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1、高效液相色谱法中文高效液相色谱法中文第1页，此课件共77页哦n n第十八章第十八章 高效液相色谱法高效液相色谱法n n（high performance liquid chromatography;HPLC）18.1 概论概论一、一、定义定义以液体为流动相的色谱法称之为液相色谱法以液体为流动相的色谱法称之为液相色谱法第2页，此课件共77页哦 采用普通规格的固定相及流动相，常压输送的采用普通规格的固定相及流动相，常压输送的液相色谱法为经典液相色谱法。液相色谱法为经典液相色谱法。以经典液相色谱法为基础，引入了气相色谱的理以经典液相色谱法为基础，引入了气相色谱的理论与实验方法，流动相改为高压输送，采
2、用高效固定论与实验方法，流动相改为高压输送，采用高效固定相及在线检测手段，发展而成的分离分析方法叫高效相及在线检测手段，发展而成的分离分析方法叫高效液相色谱法。液相色谱法。该法具有分离效能高，分析速度快及仪器化该法具有分离效能高，分析速度快及仪器化等特点，因此称之为高效液相色谱法。等特点，因此称之为高效液相色谱法。第3页，此课件共77页哦HPLC能制成溶液的样品能制成溶液的样品8080的有机化合物的有机化合物分子量大的高分子化分子量大的高分子化合物及离子型都能测定合物及离子型都能测定二、高效液相色谱法与气相色谱法应用范围对比二、高效液相色谱法与气相色谱法应用范围对比GC 能汽化的样品能汽化的样
3、品 2020的有机化合物的有机化合物挥发性差和热不稳定挥发性差和热不稳定的样品不能测的样品不能测第4页，此课件共77页哦三、高效液相色谱法与经典液相色谱法区别三、高效液相色谱法与经典液相色谱法区别第5页，此课件共77页哦一、一、HPLC 的主要类型的主要类型1818.2.2 高效液相色谱法的主要类型与原理高效液相色谱法的主要类型与原理第6页，此课件共77页哦 以以化学键合相为固定相的色谱法称之为化学键化学键合相为固定相的色谱法称之为化学键合相色谱法，简称键合相色谱法。合相色谱法，简称键合相色谱法。（bonded phase chromatography，BPC）二、二、化学键合相色谱法化学键合
4、相色谱法第7页，此课件共77页哦根据化学键合相与流动相极性的相对强弱，根据化学键合相与流动相极性的相对强弱，键合相色谱法可分为正相键合相色谱法可分为正相(normal phase;NP)(normal phase;NP)和反相和反相(reversed phase;RP)(reversed phase;RP)键合相色谱法。键合相色谱法。第8页，此课件共77页哦（一）正相键合相色谱法（一）正相键合相色谱法 固定相的极性大于流动相的极性。固定相的极性大于流动相的极性。固定相氨丙基、氰丙基固定相氨丙基、氰丙基 流动相以正己烷为底剂，加入极性调节剂。流动相以正己烷为底剂，加入极性调节剂。第9页，此课件共
5、77页哦 氰基键合相：氰基键合相：其分离选择性与硅胶相似，但极性小其分离选择性与硅胶相似，但极性小于硅胶，所以，流动相和其他色谱条件都于硅胶，所以，流动相和其他色谱条件都相同的条件下，同一组分的保留时间将小相同的条件下，同一组分的保留时间将小于硅胶。许多用硅胶柱分离的课题，可用于硅胶。许多用硅胶柱分离的课题，可用氰基键合相柱完成。氰基键合相柱完成。第10页，此课件共77页哦n n 氨基键合相氨基键合相:n n与硅胶的性质有较大差异，前者为碱性，后与硅胶的性质有较大差异，前者为碱性，后者为酸性。在做正相洗脱时，表现出不同的者为酸性。在做正相洗脱时，表现出不同的选择性。选择性。n n氨基键合相色谱
6、柱是分析糖类最主要的色谱氨基键合相色谱柱是分析糖类最主要的色谱柱，也称为碳水化合物柱。柱，也称为碳水化合物柱。第11页，此课件共77页哦1.1.分离机制分离机制 主要是范德华作用力，诱导作用力或主要是范德华作用力，诱导作用力或氢键作用力。氢键作用力。例如：用氨基键合相分离极性化合物（如例如：用氨基键合相分离极性化合物（如糖类）时，主要根据被分离组分分子与键合相糖类）时，主要根据被分离组分分子与键合相的氢键作用力的强弱差别而分离的。的氢键作用力的强弱差别而分离的。第12页，此课件共77页哦2.2.流动相的极性与保留因子的关系流动相的极性与保留因子的关系 极极性性强强的的组组分分的的保保留留因因子
7、子k 大大，后后洗洗脱脱出出柱柱。流流动动相相的的极极性性增增强强，洗洗脱脱能能力力增增加加，使使组组分分 k 减小，减小，tR 减小；反之，减小；反之，k 增大增大，tR增大。增大。第13页，此课件共77页哦n n 固定相固定相十八烷基硅烷（十八烷基硅烷（C18）、辛烷基）、辛烷基（C8）等化学键合相，有时也用弱极性或）等化学键合相，有时也用弱极性或中等极性的键合相为固定相。中等极性的键合相为固定相。n n流动相流动相以水作为基础溶剂再加入一定量以水作为基础溶剂再加入一定量与水混溶的极性调整剂，与水混溶的极性调整剂，n n常用甲醇水、乙腈水等。常用甲醇水、乙腈水等。（一）（一）反相键合相色谱
8、法反相键合相色谱法固定相的极性比流动相的极性弱。固定相的极性比流动相的极性弱。第14页，此课件共77页哦n n2.2.流动相的极性与保留因子的关系流动相的极性与保留因子的关系n n 极性强的组分的保留因子极性强的组分的保留因子k 小，先洗脱出小，先洗脱出柱。流动相的极性增强，洗脱能力减弱，柱。流动相的极性增强，洗脱能力减弱，使组分使组分 k 增大，增大，tR 增大；反之，增大；反之，k 减小减小，tR 减小。减小。第15页，此课件共77页哦（三）离子对色谱法（三）离子对色谱法（paired ion chromatography,PIC或或 ion pair chromatography,IPC
9、）正相离子对色谱法和反相离子对色谱法正相离子对色谱法和反相离子对色谱法第16页，此课件共77页哦反相离子对色谱法反相离子对色谱法(RP-ion pair chromatography)是把离子对试剂加入到含水流动相中，被是把离子对试剂加入到含水流动相中，被分析的组分离子在流动相中与离子对试剂的反分析的组分离子在流动相中与离子对试剂的反离子（或称对离子，离子（或称对离子，counter ioncounter ion）生成不荷电）生成不荷电的中性离子对，从而增加溶质与非极性固定相的作的中性离子对，从而增加溶质与非极性固定相的作用，使分配系数增加，改善分离效果。用，使分配系数增加，改善分离效果。用于
10、分离可离子化或离子型的化合物。用于分离可离子化或离子型的化合物。第17页，此课件共77页哦1.1.分离机制分离机制 以以RPICRPIC分离碱类物质为例，用离子对模式说明分离分离碱类物质为例，用离子对模式说明分离机制。机制。第18页，此课件共77页哦 RPIC的出柱顺序与的出柱顺序与RHPLC一致。一致。RPIC是在药物分析中应用很广，如生是在药物分析中应用很广，如生物碱、有机酸、磺胺类药物，某些抗生素物碱、有机酸、磺胺类药物，某些抗生素和维生素等。和维生素等。第19页，此课件共77页哦（四）离子抑制色谱法（四）离子抑制色谱法（ion suppression chromatography,IS
11、C）在在反相色谱法中，通过调节流动相的反相色谱法中，通过调节流动相的pH值，值，抑制样品组分的解离，增加它在固定相中的溶抑制样品组分的解离，增加它在固定相中的溶解度，以达到分离有机弱酸、弱碱的目的，这解度，以达到分离有机弱酸、弱碱的目的，这种技术称为离子抑制色谱法。种技术称为离子抑制色谱法。第20页，此课件共77页哦1.1.适用范围适用范围 3.0 3.0 pKa 7.0 7.0 的弱酸的弱酸 7.0 7.0 pKa 8.0 8.0 的弱碱的弱碱2.2.影响保留因子的因素影响保留因子的因素 除与反相色谱法有相同的影响因素外，除与反相色谱法有相同的影响因素外，主要还受流动相的主要还受流动相的pH
12、值的影响。值的影响。第21页，此课件共77页哦 对于弱酸，当流动相的对于弱酸，当流动相的pHpKa时，时，组分以分组分以分子形式为主，子形式为主，k 值增大值增大，tR增大增大；pHpKa，组分以离子形式为主组分以离子形式为主，k 值变小值变小，tR 减小减小 对于弱碱，情况相反对于弱碱，情况相反第22页，此课件共77页哦一、化学键合相色谱法的固定相一、化学键合相色谱法的固定相 按照所键合基团的极性可将其分为非按照所键合基团的极性可将其分为非极性极性弱极性和极性三类。弱极性和极性三类。（一）键合相的种类（一）键合相的种类 1818.2 HPLC.2 HPLC的的固定相流动相及其选择固定相流动相
13、及其选择第23页，此课件共77页哦n n1 1非极性键合相非极性键合相 n n如十八烷基（如十八烷基（C18）辛烷基（辛烷基（C8）甲基甲基（C1）与苯基等。）与苯基等。n n十八烷基硅烷十八烷基硅烷(octadecylsilane，ODS 或或C18)键合相是最常用的非极性键合相。它是键合相是最常用的非极性键合相。它是由十八烷基硅烷试剂与硅胶表面的硅醇基经由十八烷基硅烷试剂与硅胶表面的硅醇基经多步反应生成的键合相。非极性键合相通常多步反应生成的键合相。非极性键合相通常用于反相色谱。用于反相色谱。第24页，此课件共77页哦n n 非极性键和相的烷基链长对溶质的保留、非极性键和相的烷基链长对溶质
14、的保留、选择性和载样量都有影响。选择性和载样量都有影响。n n 长链烷基可使溶质的长链烷基可使溶质的k 增大，分离选择性增大，分离选择性改善，使载样量增加，长链烷基键合相的稳改善，使载样量增加，长链烷基键合相的稳定性好。定性好。n n 短链非极性键和相的分离速度较快，对于短链非极性键和相的分离速度较快，对于极性化合物可得到对称性较好的色谱峰。极性化合物可得到对称性较好的色谱峰。第25页，此课件共77页哦 2 2弱极性键合固定相弱极性键合固定相 常见的有醚基和二羟基键合相。常见的有醚基和二羟基键合相。这种键合相可作为正相或反相色谱的固定这种键合相可作为正相或反相色谱的固定相，视流动相的极性而定。
15、相，视流动相的极性而定。这类固定相应用较少。这类固定相应用较少。第26页，此课件共77页哦 3 3极性键合相极性键合相 常用氨基常用氨基氰基键合相，是分别将氨丙硅烷氰基键合相，是分别将氨丙硅烷基（基（Si(CH2)3NH2）及氰乙硅烷基）及氰乙硅烷基(Si(CH2)2CN)键合在硅胶上制成。它们一般都用键合在硅胶上制成。它们一般都用作正相色谱的固定相，但有时也用于反相色谱。作正相色谱的固定相，但有时也用于反相色谱。第27页，此课件共77页哦二、化学键合相色谱法的流动相二、化学键合相色谱法的流动相n nHPLC HPLC 对流动相的基本要求：对流动相的基本要求：n n化学稳定性好，不与固定相发生
16、化学反应。化学稳定性好，不与固定相发生化学反应。化学稳定性好，不与固定相发生化学反应。化学稳定性好，不与固定相发生化学反应。n n对对对对试试试试样样样样有有有有适适适适宜宜宜宜的的的的溶溶溶溶解解解解度度度度。要要要要求求求求使使使使k k在在在在1 1 1010范范范范围围围围内内内内，最最最最好好好好在在在在2 2 2 2 5 5的范围内。的范围内。的范围内。的范围内。n n必必必必须须须须与与与与检检检检测测测测器器器器相相相相适适适适应应应应。例例例例如如如如用用用用紫紫紫紫外外外外检检检检测测测测器器器器时时时时，只只只只能能能能选选选选用用用用截截截截止波长小于检测波长的溶剂。止
17、波长小于检测波长的溶剂。止波长小于检测波长的溶剂。止波长小于检测波长的溶剂。n n纯纯纯纯度度度度要要要要高高高高，黏黏黏黏度度度度要要要要小小小小。低低低低黏黏黏黏度度度度流流流流动动动动相相相相如如如如甲甲甲甲醇醇醇醇乙乙乙乙睛睛睛睛等等等等可以降低柱压，提高柱效。可以降低柱压，提高柱效。可以降低柱压，提高柱效。可以降低柱压，提高柱效。第28页，此课件共77页哦n n 截止波长截止波长:用用 1cm 光径的吸收池装溶剂，光径的吸收池装溶剂，用空气为参比，改变照射波长，当吸光度用空气为参比，改变照射波长，当吸光度 A1 时，此时的波长称为该溶剂的截止波时，此时的波长称为该溶剂的截止波长。长。
18、n n 如：水如：水190nm190nm，甲醇，甲醇205nm205nm，乙腈，乙腈190nm190nm第29页，此课件共77页哦(二二)流动相对分离的影响流动相对分离的影响n nn 由固定相及色谱柱填充质量决定由固定相及色谱柱填充质量决定，n n主要受溶剂种类的影响主要受溶剂种类的影响，n nk 受溶剂配比受溶剂配比的影响。的影响。第30页，此课件共77页哦n n 因为不同种类的溶剂，分子间的作用力因为不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，有可能使被分离的两个组分的分配不同，有可能使被分离的两个组分的分配系数不等，即系数不等，即11。n n 改变流动相中各种溶剂的配比，能改变改变流动相中各种溶
19、剂的配比，能改变其洗脱能力，组分的其洗脱能力，组分的 k 也改变。在正相色也改变。在正相色谱法中，增加流动相中强溶剂的比例，其谱法中，增加流动相中强溶剂的比例，其洗脱能力增强，使洗脱能力增强，使 k 变小。变小。第31页，此课件共77页哦 流动相的极性可用流动相的极性可用Snyder提出的溶剂极性参提出的溶剂极性参数数P来表示。来表示。Snyder选择了三种参考物质，乙醇（质子给予选择了三种参考物质，乙醇（质子给予体），二氧六环（质子受体）和硝基甲烷（强偶体），二氧六环（质子受体）和硝基甲烷（强偶极体）用来检验溶剂的质子接受能力（极体）用来检验溶剂的质子接受能力（Xe），给），给予质子能力（予
20、质子能力（Xd）和偶极作用力（）和偶极作用力（Xn）。）。（三）三）溶剂的强度和选择性溶剂的强度和选择性1 1溶剂的极性和强度溶剂的极性和强度 第32页，此课件共77页哦n n Snyder提出的溶剂极性参数是根据罗胥提出的溶剂极性参数是根据罗胥那德那德（Rohrschneider）的溶解度数据推导的溶解度数据推导出来的，将罗氏提供的极性分配系数出来的，将罗氏提供的极性分配系数()以对数的形式表示。以对数的形式表示。n n 纯溶剂的极性参数纯溶剂的极性参数(P)定义为：定义为：P 值越大，则溶剂的极性越大，在正相色值越大，则溶剂的极性越大，在正相色谱中的洗脱能力越强。谱中的洗脱能力越强。第33
21、页，此课件共77页哦表表20-1常用溶剂的极性参数常用溶剂的极性参数P和选择性参数和选择性参数溶溶剂剂PXeXdXn溶溶剂剂PXeXdXn正戊正戊烷烷0.0乙醇乙醇4.30.520.190.29正己正己烷烷0.1醋酸乙醋酸乙酯酯4.40.340.230.43苯苯2.70.230.320.45丙丙酮酮5.10.350.230.42乙乙醚醚2.80.530.130.34甲醇甲醇5.10.480.220.31二二氯氯甲甲烷烷3.10.290.180.53乙乙腈腈5.80.310.270.42正丙醇正丙醇4.00.530.210.26醋酸醋酸6.00.390.310.30四四氢呋氢呋喃喃4.00.38
22、0.200.42水水10.20.370.370.25氯氯仿仿4.10.250.410.33第34页，此课件共77页哦n n反相键合相色谱法的溶剂强度常用反相键合相色谱法的溶剂强度常用 S 表示表示n n常用溶剂的常用溶剂的 S 值列于表值列于表20-220-2n n 在正、反相色谱法中，溶剂的洗脱能力在正、反相色谱法中，溶剂的洗脱能力大体相反。大体相反。n n 例如，在正相洗脱时，水的洗脱能力最强例如，在正相洗脱时，水的洗脱能力最强（P最大，为最大，为10.210.2），而在反相洗脱时，水），而在反相洗脱时，水的洗脱能力最弱（的洗脱能力最弱（S 最小，为最小，为0 0）。）。第35页，此课件共
23、77页哦 表表20-2 反相色谱常用溶剂的强度因子反相色谱常用溶剂的强度因子（S）水水甲醇甲醇乙乙腈腈丙丙酮酮二噁二噁烷烷乙醇乙醇异丙醇异丙醇四四氢呋氢呋喃喃03.03.23.43.53.64.24.5第36页，此课件共77页哦2 2混合溶剂的强度混合溶剂的强度 n n 用于正相键合相色谱法的多元混合溶剂用于正相键合相色谱法的多元混合溶剂的强度，用极性参数的强度，用极性参数 来表示，其值为来表示，其值为各组成溶剂极性参数的加权和：各组成溶剂极性参数的加权和：纯溶剂纯溶剂 i i 的极性参数的极性参数 i i 该溶剂在混合溶剂中的体积分数。该溶剂在混合溶剂中的体积分数。第37页，此课件共77页哦
24、n n 反相色谱法的混合溶剂的强度因子反相色谱法的混合溶剂的强度因子 用类似方法计算：用类似方法计算：第38页，此课件共77页哦三、分离条件的选择三、分离条件的选择(一一)高效液相色谱法中的速率理论高效液相色谱法中的速率理论1 1涡流扩散涡流扩散 A=2dp 为了降低涡流扩散的影响，为了降低涡流扩散的影响，HPLC中一般使用中一般使用3 310m10m的小颗粒固定相，目前有的小颗粒固定相，目前有2m2m以下的固定相。以下的固定相。为了填充均匀，减小填充不规则因子，常采用球为了填充均匀，减小填充不规则因子，常采用球形固定相，而且要求粒度均匀（形固定相，而且要求粒度均匀（RSD5%）。此外，）。此
25、外，HPLC色谱柱以匀浆高压填充。色谱柱以匀浆高压填充。第39页，此课件共77页哦 2 2纵向扩散纵向扩散Dm 与流动相的黏度（与流动相的黏度（）成反比，与温度成正比。）成反比，与温度成正比。在在HPLC中，流动相是液体，其黏度比气体黏度大得多（约中，流动相是液体，其黏度比气体黏度大得多（约10102 2倍），而且常在室温下进行操作，因此组分在流动倍），而且常在室温下进行操作，因此组分在流动相中的扩散系数相中的扩散系数Dm比气相色谱的要小得多（为比气相色谱的要小得多（为1010 5 5倍左右）倍左右）。而且。而且HPLC的流速一般都在最佳流速以上，这时纵的流速一般都在最佳流速以上，这时纵向扩散
26、项很小，可以忽略。向扩散项很小，可以忽略。第40页，此课件共77页哦n n 第41页，此课件共77页哦n n（1 1）固定相传质阻抗固定相传质阻抗n n 通常采用化学键合相，它的通常采用化学键合相，它的“固定液固定液”是键合在载体表面固定液官能团的单分子层，是键合在载体表面固定液官能团的单分子层，所以，固定液的传质阻抗可以忽略，于是所以，固定液的传质阻抗可以忽略，于是 n n C=Cm+Csm 3 3传质阻抗传质阻抗 C=Cm+Csm+Cs第42页，此课件共77页哦（2 2）流动相传质阻抗）流动相传质阻抗 在一个流路中处于流路中心的分子和在一个流路中处于流路中心的分子和处于流路边缘的分子与固定
27、相的作用力不同，处于流路边缘的分子与固定相的作用力不同，迁移速率不同，处于流路边缘的分子与固定迁移速率不同，处于流路边缘的分子与固定相的作用力大于处于流路中心的分子，迁移相的作用力大于处于流路中心的分子，迁移速率相对慢于处于流路中心的分子，因而使速率相对慢于处于流路中心的分子，因而使峰变宽。峰变宽。第43页，此课件共77页哦（3 3）静态流动相传质阻抗）静态流动相传质阻抗 由于固定相是多孔性的，使部分流动相滞由于固定相是多孔性的，使部分流动相滞留在固定相微孔内部。静态流动相传质阻抗是留在固定相微孔内部。静态流动相传质阻抗是分子进入处于固定相较深孔穴内的静止流动相分子进入处于固定相较深孔穴内的静
28、止流动相中，而晚回到流动相而引起峰展宽。中，而晚回到流动相而引起峰展宽。于是于是HPLC中的中的Van Deemter 方程式为方程式为：H=A+Cm u+Csm u第44页，此课件共77页哦（二）二）键合相色谱法的分离条件键合相色谱法的分离条件 1.1.固定相的选择固定相的选择 （1 1）正相键合相色谱法正相键合相色谱法 一般以极性键合相为固定相一般以极性键合相为固定相 如氰基、氨基键合相如氰基、氨基键合相 第45页，此课件共77页哦 氨基键合相氨基键合相具有较强的氢键结合能力，对具有较强的氢键结合能力，对某些基团化合物如甾体，强心苷等有较好的分离某些基团化合物如甾体，强心苷等有较好的分离能
29、力。能力。氨基键合相上的氨基能与糖类分子中的羟氨基键合相上的氨基能与糖类分子中的羟基产生选择性相互作用，所以广泛用于糖类的基产生选择性相互作用，所以广泛用于糖类的分析。分析。氰基键合相氰基键合相对双键异构体或含双键数不等的对双键异构体或含双键数不等的环状化合物的分离有较好的选择性；环状化合物的分离有较好的选择性；第46页，此课件共77页哦（2 2）反相键合相色谱法）反相键合相色谱法 在反相键合相色谱、反相离子抑制色谱及反相离子对在反相键合相色谱、反相离子抑制色谱及反相离子对色谱中，常选用非极性键合相，非极性键合相可用于分离分色谱中，常选用非极性键合相，非极性键合相可用于分离分子型化合物，也可用
30、于分离离子型或可离子化的化合物。子型化合物，也可用于分离离子型或可离子化的化合物。ODS是应用最广泛的非极性固定相。对于各种类型的化是应用最广泛的非极性固定相。对于各种类型的化合物都有很强的适应能力。短链烷基键合相能用于极性化合物合物都有很强的适应能力。短链烷基键合相能用于极性化合物的分离，苯基键合相适用于分离芳香化合物以及多羟基化合物的分离，苯基键合相适用于分离芳香化合物以及多羟基化合物如黄酮苷类等。如黄酮苷类等。第47页，此课件共77页哦2.2.流动相的选择流动相的选择 (1)(1)正相色谱法正相色谱法 以正己烷为底剂，加入极性调节剂以正己烷为底剂，加入极性调节剂 第48页，此课件共77页
31、哦 例如，正己烷与异丙醚例如，正己烷与异丙醚()()组成的二元流动组成的二元流动相，通过调节极性调节剂异丙醚的浓度来改变溶剂相，通过调节极性调节剂异丙醚的浓度来改变溶剂强度强度P，使样品组分的，使样品组分的k值在值在1-101-10范围内。范围内。若溶剂的选择性不好，可以改用其它组别的强若溶剂的选择性不好，可以改用其它组别的强溶剂如氯仿（溶剂如氯仿（）或二氯甲烷（）或二氯甲烷（），与正己烷组），与正己烷组成具有相似成具有相似P值的二元流动相，若仍难以达到所需值的二元流动相，若仍难以达到所需的分离选择性，还可以使用三元或四元溶剂体系。的分离选择性，还可以使用三元或四元溶剂体系。第49页，此课件共
32、77页哦（2 2）反相色谱法）反相色谱法 以极性最强的水为基础溶剂，加入甲醇、乙腈等以极性最强的水为基础溶剂，加入甲醇、乙腈等极性调节剂。极性调节剂的性质以及其与水的混合比极性调节剂。极性调节剂的性质以及其与水的混合比例对溶质的保留值和分离选择性有显著影响。例对溶质的保留值和分离选择性有显著影响。但乙腈的溶剂强度高且粘度小，并可满足在但乙腈的溶剂强度高且粘度小，并可满足在紫外紫外185-205nm185-205nm处检测的要求，因此，综合来看，处检测的要求，因此，综合来看，乙腈水系统要优于甲醇水系统。乙腈水系统要优于甲醇水系统。第50页，此课件共77页哦（3 3）反相离子抑制色谱反相离子抑制色
33、谱 在反相键合相色谱法中加入少量的弱酸在反相键合相色谱法中加入少量的弱酸（常用（常用HAcHAc）、弱碱（氨水）或缓冲盐（磷酸）、弱碱（氨水）或缓冲盐（磷酸盐及醋酸盐），调节流动相的盐及醋酸盐），调节流动相的pHpH值，以抑制组值，以抑制组分分子的自身解离，并改善峰形。分分子的自身解离，并改善峰形。在进行离子抑制色谱时，流动相的在进行离子抑制色谱时，流动相的pHpH需在需在2-82-8之间，超出此范围可能损坏键合相。之间，超出此范围可能损坏键合相。第51页，此课件共77页哦 在反相离子对色谱法中，影响试样组分在反相离子对色谱法中，影响试样组分的保留值和分离选择性的主要因素有离子对的保留值和分离
34、选择性的主要因素有离子对试剂的性质和浓度、流动相的试剂的性质和浓度、流动相的pHpH以及流动相以及流动相中所含有机溶剂的种类和比例等。中所含有机溶剂的种类和比例等。（4 4）反相离子对色谱法反相离子对色谱法第52页，此课件共77页哦（1 1）离子对试剂的选择）离子对试剂的选择 离子对试剂所带的电荷应与试样离子的电荷相反。离子对试剂所带的电荷应与试样离子的电荷相反。分析酸类或带负电荷的物质时，常用季铵盐作分析酸类或带负电荷的物质时，常用季铵盐作离子对试剂；离子对试剂；分析碱类或带正电荷的物质时，常用烷基磺酸盐分析碱类或带正电荷的物质时，常用烷基磺酸盐（或硫酸盐）作离子对试剂。（或硫酸盐）作离子对
35、试剂。离子对试剂的浓度一般在离子对试剂的浓度一般在 3 310 10 mmol/L。第53页，此课件共77页哦（2 2）流动相）流动相pH的选择：的选择：由于离子对的生成依赖于试样组分的解离程度，由于离子对的生成依赖于试样组分的解离程度，当试样组分与离子对试剂全部离子化时，最有利当试样组分与离子对试剂全部离子化时，最有利于离子对的形成，组分的于离子对的形成，组分的 k 值最大。因此，调节值最大。因此，调节pHpH可在较大范围内改变弱酸或弱碱试样的保留值和分可在较大范围内改变弱酸或弱碱试样的保留值和分离选择性。离选择性。流动相在流动相在 pH 2-8 范围内范围内 。第54页，此课件共77页哦（
36、3）有机溶剂及其浓度的选择）有机溶剂及其浓度的选择 在反相离子对色谱法中，甲醇水或乙腈在反相离子对色谱法中，甲醇水或乙腈水系统是常用的流动相，流动相中所含有机溶剂水系统是常用的流动相，流动相中所含有机溶剂的比例越高，组分的的比例越高，组分的 k 值越小。值越小。一般来说，样品组分的疏水性及离子对试剂的一般来说，样品组分的疏水性及离子对试剂的疏水性越强，所需有机溶剂的比例越高。疏水性越强，所需有机溶剂的比例越高。第55页，此课件共77页哦(三三)洗脱洗脱方法方法 1.1.等度洗脱等度洗脱（isocratic elution）等度洗脱是在同一分析周期内流动相组等度洗脱是在同一分析周期内流动相组成保
37、持恒定。成保持恒定。适用于组分数目较少、性质差别不大的试适用于组分数目较少、性质差别不大的试样分离。样分离。第56页，此课件共77页哦 梯度洗脱是在一个分析周期内程序控制改梯度洗脱是在一个分析周期内程序控制改变流动相的组成，如溶剂的极性、离子强度和变流动相的组成，如溶剂的极性、离子强度和pHpH值等。分析组分数目多、性质相差较大的复值等。分析组分数目多、性质相差较大的复杂试样时须采用梯度洗脱技术，使所有组分都杂试样时须采用梯度洗脱技术，使所有组分都在适宜条件下获得分离。在适宜条件下获得分离。2.梯度洗脱梯度洗脱（gradient elution）梯度洗脱能缩短分析时间，提高分离度，改善峰形，梯
38、度洗脱能缩短分析时间，提高分离度，改善峰形，提高检测灵敏度；但是可能引起基线漂移和重现性降提高检测灵敏度；但是可能引起基线漂移和重现性降低。低。第57页，此课件共77页哦1818.3.3 高效液相色谱仪HPLC装置装置输液系统输液系统分离系统分离系统检测系统检测系统数据处理系统数据处理系统进样系统第58页，此课件共77页哦高效液相色谱仪示意图高效液相色谱仪示意图第59页，此课件共77页哦一、输液系统(一一一一)高压输液泵高压输液泵高压输液泵高压输液泵送液送液送液送液n n 输液泵应具备如下性能：输液泵应具备如下性能：输液泵应具备如下性能：输液泵应具备如下性能：n n 流量精度高且稳定，其流量精
39、度高且稳定，其流量精度高且稳定，其流量精度高且稳定，其RSDRSD应小于应小于应小于应小于0.5%0.5%0.5%0.5%，这对定性定量准，这对定性定量准，这对定性定量准，这对定性定量准确性至关重要；确性至关重要；确性至关重要；确性至关重要；n n流量范围宽，分析型应在流量范围宽，分析型应在流量范围宽，分析型应在流量范围宽，分析型应在0.10.10.10.1 10ml/min10ml/min10ml/min10ml/min范围内连续可调，制范围内连续可调，制范围内连续可调，制范围内连续可调，制备型应能达到备型应能达到备型应能达到备型应能达到100ml/min100ml/min100ml/min
40、100ml/min；n n能在高压下连续工作；能在高压下连续工作；能在高压下连续工作；能在高压下连续工作；n n液缸容积小；液缸容积小；液缸容积小；液缸容积小；n n密封性能好，耐腐蚀。密封性能好，耐腐蚀。密封性能好，耐腐蚀。密封性能好，耐腐蚀。第60页，此课件共77页哦型送液模式図型送液模式図第61页，此课件共77页哦（二）梯度洗脱装置n n 实现梯度洗脱的装置，即高压梯度和低压梯度。实现梯度洗脱的装置，即高压梯度和低压梯度。n n高压二元梯度装置高压二元梯度装置高压二元梯度装置高压二元梯度装置是由两台高压输液泵分别将两种溶是由两台高压输液泵分别将两种溶是由两台高压输液泵分别将两种溶是由两台
41、高压输液泵分别将两种溶剂送入混合室，混合后送入色谱柱，程序控制每台泵剂送入混合室，混合后送入色谱柱，程序控制每台泵剂送入混合室，混合后送入色谱柱，程序控制每台泵剂送入混合室，混合后送入色谱柱，程序控制每台泵的输出量就能获得各种形式的梯度曲线。的输出量就能获得各种形式的梯度曲线。的输出量就能获得各种形式的梯度曲线。的输出量就能获得各种形式的梯度曲线。低压梯度装低压梯度装低压梯度装低压梯度装置置置置是在常压下通过一比例阀先将各种溶剂按程序混合，是在常压下通过一比例阀先将各种溶剂按程序混合，是在常压下通过一比例阀先将各种溶剂按程序混合，是在常压下通过一比例阀先将各种溶剂按程序混合，然后再用一台高压输
42、液泵送入色谱柱。然后再用一台高压输液泵送入色谱柱。然后再用一台高压输液泵送入色谱柱。然后再用一台高压输液泵送入色谱柱。第62页，此课件共77页哦梯度洗脱装置第63页，此课件共77页哦二、分离和进样系统n n（一）进样器（一）进样器n n进样阀和自动进样装置两种进样阀和自动进样装置两种n n一般高效液相色谱分析常用六通进样阀，一般高效液相色谱分析常用六通进样阀，n n大数量试样的常规分析往往需要自动进样装大数量试样的常规分析往往需要自动进样装置。置。第64页，此课件共77页哦六通阀进样装置六通阀进样装置第65页，此课件共77页哦（二）色谱柱n n 1.1.色谱柱的构造色谱柱的构造n n按主要用途
43、分为分析型和制备型，按主要用途分为分析型和制备型，按主要用途分为分析型和制备型，按主要用途分为分析型和制备型，n n常规分析柱内径常规分析柱内径常规分析柱内径常规分析柱内径2 25mm5mm，柱长，柱长，柱长，柱长10101010 30cm30cm30cm30cm；n n窄径柱窄径柱窄径柱窄径柱 (narrow bore column)(narrow bore column)内径内径内径内径1 1 1 1 2mm2mm，柱长，柱长，柱长，柱长10101010 20cm20cm20cm20cm；n n毛细管柱内径毛细管柱内径0.20.20.20.20.5mm0.5mm0.5mm0.5mm。n n
44、实验室制备柱内径实验室制备柱内径实验室制备柱内径实验室制备柱内径20202020 40mm40mm，柱长，柱长，柱长，柱长10101010 30cm30cm30cm30cm，n n生产用的制备型色谱柱内径可达几十厘米。生产用的制备型色谱柱内径可达几十厘米。生产用的制备型色谱柱内径可达几十厘米。生产用的制备型色谱柱内径可达几十厘米。第66页，此课件共77页哦2 2色谱柱的性能评价色谱柱的性能评价 无论自己填装的色谱柱还是购买的商品无论自己填装的色谱柱还是购买的商品柱，使用前都要对其性能进行考察，使用期柱，使用前都要对其性能进行考察，使用期间或放置一段时间后也要重新检查。间或放置一段时间后也要重新
45、检查。柱性能指标包括在一定实验条件（试样、流动相、柱性能指标包括在一定实验条件（试样、流动相、流速、温度）下的柱压、塔板高度流速、温度）下的柱压、塔板高度H 和板数和板数n、对称因子对称因子fs、保留因子、保留因子k 和分离因子和分离因子的重复性的重复性或分离度或分离度R。第67页，此课件共77页哦n n色谱柱性能考察常用的试样和流动相介绍如色谱柱性能考察常用的试样和流动相介绍如下：下：n n(1)(1)硅胶柱硅胶柱：苯、萘和联苯为试样；无水己：苯、萘和联苯为试样；无水己烷或庚烷为流动相。烷或庚烷为流动相。n n(2)(2)烃基键合相柱烃基键合相柱：尿嘧啶：尿嘧啶 (k=0)=0)、硝基、硝基
46、苯、萘和芴为试样；甲醇水苯、萘和芴为试样；甲醇水 (85:15)(85:15)或或乙腈水乙腈水 (60:40)(60:40)为流动相；或者用苯、为流动相；或者用苯、萘和苯磺酸钠萘和苯磺酸钠 (k=0)=0)为试样，以甲醇水为试样，以甲醇水 (80:20)(80:20)为流动相。为流动相。第68页，此课件共77页哦三、检测系统检测器器紫外检测器紫外检测器荧光检测器荧光检测器安培检测器安培检测器蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器第69页，此课件共77页哦（一）紫外检测器 紫外检测器紫外检测器 是高效液相色谱中应用最是高效液相色谱中应用最广泛的检测器。它灵敏度较高，噪音低，线广泛的检测器。它灵敏度较高
47、，噪音低，线性范围宽，对流速和温度的波动不灵敏，还性范围宽，对流速和温度的波动不灵敏，还适用于制备色谱。但它只能检测有紫外吸收适用于制备色谱。但它只能检测有紫外吸收的物质，而且流动相有一定限制，即流动相的物质，而且流动相有一定限制，即流动相的截止波长应小于检测波长。的截止波长应小于检测波长。第70页，此课件共77页哦n n1可变波长检测器n n 可变波长紫外检测器是目前配置最多的检测器，一般采用氘灯为光源，能够按需要选择组分的最大吸收波长为检测波长，从而提高灵敏度。但是，光源发出的光是通过单色器后照射到流通池上，因此单色光强度相对较弱。这类检测器的光路系统和紫外分光光度计相似。第71页，此课件
48、共77页哦n n2 2光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器(photodiode array detector；PDADPDAD或称diode array detectordiode array detector；DAD)DAD)n n 是是是是20202020世纪世纪世纪世纪80808080年代出现的一种年代出现的一种光学多通道检测器光学多通道检测器。在晶体硅上紧密排列一系列光电二极管，每一个二极管相在晶体硅上紧密排列一系列光电二极管，每一个二极管相在晶体硅上紧密排列一系列光电二极管，每一个二极管相在晶体硅上紧密排列一系列光电二极管，每一个二极管相
49、当于一个单色仪的出口狭缝。二极管越多分辨率越高。一当于一个单色仪的出口狭缝。二极管越多分辨率越高。一当于一个单色仪的出口狭缝。二极管越多分辨率越高。一当于一个单色仪的出口狭缝。二极管越多分辨率越高。一般是一个二极管对应接受光谱上般是一个二极管对应接受光谱上般是一个二极管对应接受光谱上般是一个二极管对应接受光谱上 1nm1nm1nm1nm谱带宽的单色光。谱带宽的单色光。谱带宽的单色光。谱带宽的单色光。n n 例如，例如，例如，例如，Agilent 1100 HPLCAgilent 1100 HPLCAgilent 1100 HPLCAgilent 1100 HPLC的光电二极管阵列检测器的光电二
50、极管阵列检测器的光电二极管阵列检测器的光电二极管阵列检测器的波长范围是的波长范围是的波长范围是的波长范围是200200200200900nm900nm900nm900nm，有，有，有，有1024102410241024个光电二极管，平均个光电二极管，平均个光电二极管，平均个光电二极管，平均0.7nm0.7nm0.7nm0.7nm对应一个光电二极管。对应一个光电二极管。对应一个光电二极管。对应一个光电二极管。第72页，此课件共77页哦n n 其工作原理是，复光通过流通池被组其工作原理是，复光通过流通池被组分选择性吸收后，再进入单色器，分光分选择性吸收后，再进入单色器，分光后照射在二极管阵列装置上