基因工程药物精选PPT.ppt

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1、关于基因工程药物关于基因工程药物第1页，讲稿共82张，创作于星期日2基因工程制药基因工程制药：指利用：指利用重组重组DNA技术技术，结合发酵工，结合发酵工程、细胞工程、酶工程等现代生物技术研制预防和程、细胞工程、酶工程等现代生物技术研制预防和治疗人类、动物重大疾病的蛋白质药物、核酸药物治疗人类、动物重大疾病的蛋白质药物、核酸药物以及生物制品的一门技术。以及生物制品的一门技术。第2页，讲稿共82张，创作于星期日38.1 基因工程药物的发展概况基因工程药物的发展概况8.1.1 基因工程药物的发展简史与现状基因工程药物的发展简史与现状8.1.2 基因工程药物的特点基因工程药物的特点8.1.3 基因工

2、程药物的研发过程基因工程药物的研发过程第3页，讲稿共82张，创作于星期日48.1.1 基因工程药物的发展简史与现状基因工程药物的发展简史与现状1973年，年，Cohen等，等，tetr和和strr成功重组，基因工程拉成功重组，基因工程拉开序幕开序幕1974年，重组质粒转化大肠杆菌，获得相应抗性年，重组质粒转化大肠杆菌，获得相应抗性1976年，年，Genentech公司成立公司成立1982年，授权年，授权Eli Lilly公司公司基因重组动物疫苗抗眼基因重组动物疫苗抗眼球病疫苗生产和使用；人胰岛素生产和使用球病疫苗生产和使用；人胰岛素生产和使用希克劳希克劳百忧解百忧解第4页，讲稿共82张，创作于

3、星期日51984年，凝血因子年，凝血因子VIII1985年，注射用促生长素年，注射用促生长素1987年，年，tPA。第5页，讲稿共82张，创作于星期日6国家国家 发展策略发展策略 投入资金投入资金临床试临床试验验上市上市品种品种 产值产值美国支持基础创新，主导领先水平100亿US$/年350110200亿US$/年日本合作，实用化，信息化2千亿日元/年50种以上50五千亿日元/年德国创新，转让，加大投入10068中国重视，优先、优惠20余种2030亿人民币主要国家基因工程制药产业化概况主要国家基因工程制药产业化概况第6页，讲稿共82张，创作于星期日7基因工程药物现状与前景基因工程药物现状与前景

4、2001年，生物技术公司年，生物技术公司4284家（上市家（上市622家），家），销售总额销售总额348亿美元，其中基因药物占亿美元，其中基因药物占70%，250亿亿美元；美元；美国，美国，1466家，占家，占55%；销售总额；销售总额285亿美元，亿美元，占占82；上市公司；上市公司318家，占家，占55%；日本日本欧洲欧洲表表8.1第7页，讲稿共82张，创作于星期日8我国国情我国国情“起步晚，发展快；项目不多，仿制为主；重复生起步晚，发展快；项目不多，仿制为主；重复生产，后劲不足产，后劲不足”。IL-2，干扰素，干扰素，粒细胞集落刺激因子（，粒细胞集落刺激因子（G-CSF），），EPO，生

5、长激素。，生长激素。表表8.3第8页，讲稿共82张，创作于星期日98.1.2 基因工程药物的特点基因工程药物的特点1、高技术：人才、技术、高技术：人才、技术2、长周期：实验室、中试、临床、规模化生产、市场、长周期：实验室、中试、临床、规模化生产、市场商品化阶段、监督环节商品化阶段、监督环节3、高投入、高投入4、高风险、高风险5、高收益、高收益第9页，讲稿共82张，创作于星期日10基因工程药物的优点基因工程药物的优点1、可以得到天然状态难以获得的生理活性物质，改、可以得到天然状态难以获得的生理活性物质，改造成新药造成新药 胰岛素胰岛素2、使生理活性物质在各种反应器中获得高表达，符合临、使生理活性

6、物质在各种反应器中获得高表达，符合临床和研究需要床和研究需要3、改造生理活性物质，提高其活性：速效、长效、改造生理活性物质，提高其活性：速效、长效4、可以挖掘和开发更多的新药，获得新物质、可以挖掘和开发更多的新药，获得新物质第10页，讲稿共82张，创作于星期日118.1.3 基因工程药物的研发过程基因工程药物的研发过程1、实验室研究阶段（、实验室研究阶段（discovery，research）2、基因工程药品的开发阶段（、基因工程药品的开发阶段（development）3、基因工程药品的临床试验（、基因工程药品的临床试验（commercialization）:、期临床试验期临床试验4、新药申请

7、和上市、新药申请和上市第11页，讲稿共82张，创作于星期日128.2 基因工程制药的下游技术基因工程制药的下游技术8.2.1 基因工程菌的规模化培养基因工程菌的规模化培养8.2.2基因工程菌细胞膜的破碎基因工程菌细胞膜的破碎8.2.3 基因重组蛋白的分离与纯化基因重组蛋白的分离与纯化下游技术下游技术：表达、分离纯化和活性测定：表达、分离纯化和活性测定第12页，讲稿共82张，创作于星期日138.2.1 基因工程菌的规模化培养基因工程菌的规模化培养8.2.1.1 重组大肠杆菌培养基重组大肠杆菌培养基8.2.1.2 基本培养方式基本培养方式8.2.1.3 培养工艺条件对外源基因表达的影响培养工艺条件

8、对外源基因表达的影响8.2.1.4 培养条件对产物活性、存在形式及释放的培养条件对产物活性、存在形式及释放的影响影响8.2.1.5 高密度和高表达培养对策高密度和高表达培养对策第13页，讲稿共82张，创作于星期日148.2.1.1 重组大肠杆菌培养基重组大肠杆菌培养基C源、源、N源、无机盐、微量元素、维生素、生物素源、无机盐、微量元素、维生素、生物素等等LB培养基、培养基、M9培养基培养基按组成物质的来源分：合成培养基、天然培养基按组成物质的来源分：合成培养基、天然培养基按存在状态分：固体、液体培养基按存在状态分：固体、液体培养基第14页，讲稿共82张，创作于星期日158.2.1.2 基本培养

9、方式基本培养方式1、分批培养（、分批培养（batch culture）：）：在一个封闭培养系在一个封闭培养系统内含有初始限制量的基质的培养方法。培养过统内含有初始限制量的基质的培养方法。培养过程从接种开始，经过程从接种开始，经过4 4个时期：迟滞期、对数生长个时期：迟滞期、对数生长期、减速期和稳定期。期、减速期和稳定期。2、补料分批培养（、补料分批培养（fed-batch culture）3、连续培养（、连续培养（continuous culture）4、透析培养（、透析培养（dialysis culture）第15页，讲稿共82张，创作于星期日168.2.1.3 培养工艺条件对外源基因培养工

10、艺条件对外源基因表达的影响表达的影响u工程菌大规模培养的优化设计和控制对外源基工程菌大规模培养的优化设计和控制对外源基因的高效表达至关重要。因的高效表达至关重要。工艺工艺：选择合适的发酵系统或生物反应器。：选择合适的发酵系统或生物反应器。生物学生物学方面的因素：方面的因素：与细菌生长密切相关的条件或因素：与细菌生长密切相关的条件或因素：温度温度、pH值值、溶氧溶氧、培养基成分、培养基成分 表达条件表达条件 诱导物、改变温度诱导物、改变温度 提高外源基因表达产物的总量：提高外源基因表达产物的总量：表达水平、菌体浓度表达水平、菌体浓度第16页，讲稿共82张，创作于星期日178.2.1.4 培养条件

11、对产物活性、存培养条件对产物活性、存在形式及释放的影响在形式及释放的影响对产物活性和存在形式的影响：温度和对产物活性和存在形式的影响：温度和pH值值存在形式：包涵体、融合蛋白、分泌型存在形式：包涵体、融合蛋白、分泌型第17页，讲稿共82张，创作于星期日18外源基因在大肠杆菌中的表达形式外源基因在大肠杆菌中的表达形式表达产物可能存在于：细胞质、细胞周质、胞外培表达产物可能存在于：细胞质、细胞周质、胞外培养基中养基中表达形式表达形式：可溶性蛋白、不溶性蛋白：可溶性蛋白、不溶性蛋白包涵体蛋白包涵体蛋白融合蛋白融合蛋白分泌型外源蛋白分泌型外源蛋白第18页，讲稿共82张，创作于星期日191 1、包涵体蛋

12、白包涵体蛋白包涵体包涵体：一定条件下，外源基因的表达产物在大肠杆菌中积：一定条件下，外源基因的表达产物在大肠杆菌中积累并致密的聚集在一起形成无膜的裸露结构。累并致密的聚集在一起形成无膜的裸露结构。细胞质中较多，较少细胞周质细胞质中较多，较少细胞周质由蛋白质组成，氨基酸序列正确，空间构象错误，无生物由蛋白质组成，氨基酸序列正确，空间构象错误，无生物学活性。学活性。包涵体包涵体优点优点：易于分离纯化易于分离纯化对蛋白酶有较好的抗性对蛋白酶有较好的抗性第19页，讲稿共82张，创作于星期日202 2、融合蛋白融合蛋白融合蛋白融合蛋白：外源蛋白基因与受体菌自身蛋白基因重组：外源蛋白基因与受体菌自身蛋白基

13、因重组在一起，但不改变两个基因阅读框。在一起，但不改变两个基因阅读框。受体菌蛋白位于受体菌蛋白位于N端，外源蛋白位于端，外源蛋白位于C端。端。融合蛋白优点：融合蛋白优点：稳定性增加：杂合构象，不易被水解稳定性增加：杂合构象，不易被水解具有较高的水溶性和生物学活性具有较高的水溶性和生物学活性能以较高的效率表达：自身蛋白能以较高的效率表达：自身蛋白易于分离纯化：易于分离纯化：酶水解酶水解第20页，讲稿共82张，创作于星期日213 3、分泌型外源蛋白分泌型外源蛋白分泌型蛋白分泌型蛋白：指外源基因的表达产物通过运输或分泌的：指外源基因的表达产物通过运输或分泌的方式穿过细胞的外膜进入培养基中。方式穿过细

14、胞的外膜进入培养基中。分泌蛋白需在分泌蛋白需在N端端加上信号肽序列。加上信号肽序列。分泌型蛋白分泌型蛋白优点优点：简化了纯化工艺简化了纯化工艺使外源蛋白免于被降解使外源蛋白免于被降解有利于形成正确的构象，获得有生物活性的蛋白质。有利于形成正确的构象，获得有生物活性的蛋白质。第21页，讲稿共82张，创作于星期日22表达蛋白在细胞中的稳定性表达蛋白在细胞中的稳定性防止蛋白降解防止蛋白降解融合蛋白融合蛋白表达系统：封闭了水解酶作用位点，增加表达系统：封闭了水解酶作用位点，增加稳定性。稳定性。分泌蛋白分泌蛋白表达系统：分泌到细胞周质、培养基中表达系统：分泌到细胞周质、培养基中包涵体包涵体表达系统：难溶

15、性的沉淀复合物表达系统：难溶性的沉淀复合物,不易被宿不易被宿主蛋白水解酶降解。主蛋白水解酶降解。蛋白蛋白水解酶基因缺陷型水解酶基因缺陷型的受体系统：的受体系统：第22页，讲稿共82张，创作于星期日238.2.1.5 高密度和高表达培养对策高密度和高表达培养对策1、高密度培养：、高密度培养：2、高表达培养：、高表达培养：单因素实验单因素实验正交实验正交实验第23页，讲稿共82张，创作于星期日24基因表达产物的分离纯化基因表达产物的分离纯化收集细胞收集细胞破碎细胞破碎细胞初步分离初步分离柱层析柱层析经一步分离纯化经一步分离纯化第24页，讲稿共82张，创作于星期日258.2.2基因工程菌细胞膜的破碎

16、基因工程菌细胞膜的破碎（一）细胞收集（一）细胞收集离心法离心法贝克曼贝克曼beckman离心机离心机第25页，讲稿共82张，创作于星期日26（二）破碎细胞（二）破碎细胞变性剂裂解法：哺乳动物变性剂裂解法：哺乳动物 SDS超声波破碎法超声波破碎法：细菌和酵母：细菌和酵母 缓冲液缓冲液机械破碎法机械破碎法适用于细菌、酵母、植物细胞适用于细菌、酵母、植物细胞石英砂、细玻璃珠：石英砂、细玻璃珠：液氮液氮酶解裂解法：细菌、酵母、植物酶解裂解法：细菌、酵母、植物cell第26页，讲稿共82张，创作于星期日278.2.3 基因重组蛋白的分离与纯化基因重组蛋白的分离与纯化8.2.3.1 重组蛋白的分离重组蛋白

17、的分离1、离心：、离心：去除未破碎的细胞和细胞碎片等去除未破碎的细胞和细胞碎片等2、沉淀：盐溶和盐析：、沉淀：盐溶和盐析：(NH4)2SO4；有机溶剂沉淀：有机溶剂沉淀：乙醇、丙酮；乙醇、丙酮；等电点沉淀等电点沉淀3、膜分离：透析和超滤：透析膜、超滤管、膜分离：透析和超滤：透析膜、超滤管透析透析超滤超滤第27页，讲稿共82张，创作于星期日284、双水相萃取双水相萃取：利用物质在互不相溶的两水相间利用物质在互不相溶的两水相间分配系数的差异进行萃取的方法。分配系数的差异进行萃取的方法。原理：水相中加入溶于水的高分子化合物，形成密度原理：水相中加入溶于水的高分子化合物，形成密度不同的两相体系。不同的

18、两相体系。形成原因：聚合物的不相容性，即聚合物分子的形成原因：聚合物的不相容性，即聚合物分子的空间阻碍作用，无法形成均一相。空间阻碍作用，无法形成均一相。n双聚合物：聚乙二醇双聚合物：聚乙二醇(PEG)/(PEG)/葡聚糖葡聚糖(Dx)(Dx)。该系统上。该系统上相富含相富含PEGPEG，下相富含，下相富含DxDx；第28页，讲稿共82张，创作于星期日295、反胶团萃取：、反胶团萃取：反胶团反胶团：是表面活性剂分散在连续的有机溶剂：是表面活性剂分散在连续的有机溶剂中，自发形成的纳米尺度的一种聚集体。中，自发形成的纳米尺度的一种聚集体。第29页，讲稿共82张，创作于星期日308.2.3.2 基因

19、重组蛋白的纯化方法基因重组蛋白的纯化方法进一步分离纯化进一步分离纯化离子交换层析：等电点的差异离子交换层析：等电点的差异 阳、阴离子阳、阴离子凝胶柱层析（分子筛）：分子量大小凝胶柱层析（分子筛）：分子量大小亲和层析：分子间特异相互作用亲和层析：分子间特异相互作用凝胶层析柱凝胶层析柱离子交换柱离子交换柱亲和层析柱亲和层析柱第30页，讲稿共82张，创作于星期日31柱层析柱层析基本步骤基本步骤（1）装柱）装柱 （2）柱平衡）柱平衡（3）上样）上样 （4）洗脱）洗脱（5）样品收集：鉴定脱盐浓缩）样品收集：鉴定脱盐浓缩自动核酸蛋白分离层析仪自动核酸蛋白分离层析仪 第31页，讲稿共82张，创作于星期日32

20、基因表达产物的精细纯化基因表达产物的精细纯化检测、制备和纯化蛋白质检测、制备和纯化蛋白质 蛋白浓度、纯度测定蛋白浓度、纯度测定PAGESDS-PAGEHPLC第32页，讲稿共82张，创作于星期日338.2.3.3 重组蛋白活性的测定重组蛋白活性的测定生物活性的保持生物活性的保持免疫测定法免疫测定法第33页，讲稿共82张，创作于星期日348.3 几种重要基因工程药物的研发概况几种重要基因工程药物的研发概况8.3.1 基因工程激素类药物基因工程激素类药物8.3.2 基因工程基因工程细胞因子细胞因子类药物类药物8.3.3 基因工程抗体基因工程抗体8.3.4 基因工程疫苗基因工程疫苗8.3.5 基因工

21、程受体基因工程受体第34页，讲稿共82张，创作于星期日358.3.1 基因工程激素类药物基因工程激素类药物u激素（激素（hormone）：由生物体内分泌腺或特异性）：由生物体内分泌腺或特异性细胞产生的微量有机化合物，通过体液或细胞外细胞产生的微量有机化合物，通过体液或细胞外液运送到特定的作用部位，能引起特殊的生理效液运送到特定的作用部位，能引起特殊的生理效应。应。分类：分类：多肽蛋白类激素多肽蛋白类激素、甾醇类激素、脂肪酸类激、甾醇类激素、脂肪酸类激素素如胰岛素、人生长激素、人促卵泡激素如胰岛素、人生长激素、人促卵泡激素第35页，讲稿共82张，创作于星期日36u激素（hormones）：又称化

22、学信使，是特定细胞合成的，能使生物体发生一定反应的有机分子；它们的作用力很强，很低的浓度就能引起很强的反应；它们都是短命的，在细胞中不能积累，很快就会被破坏。激素都是有特异性的，只对某种或某几种细胞有效，具有接受相应激素的特异受体。第36页，讲稿共82张，创作于星期日37第37页，讲稿共82张，创作于星期日388.3.1.1 胰岛素（胰岛素（insulin）l概况：动物胰脏胰岛的概况：动物胰脏胰岛的细胞以细胞以前胰岛素原前胰岛素原形式形式合成合成跨膜运输后成跨膜运输后成胰岛素原胰岛素原高尔基体内形成高尔基体内形成成熟成熟胰岛素胰岛素。l生理功能：治疗糖尿病生理功能：治疗糖尿病 降低血糖降低血糖

23、提高组织摄取葡萄糖的能力提高组织摄取葡萄糖的能力抑制肝糖原的分解抑制肝糖原的分解促进肝糖原和肌糖原的合成促进肝糖原和肌糖原的合成第38页，讲稿共82张，创作于星期日39 胰岛素原的结构第39页，讲稿共82张，创作于星期日40基因工程生产人胰岛素的途径基因工程生产人胰岛素的途径用大肠杆菌发酵生产胰岛素原，在用大肠杆菌发酵生产胰岛素原，在体外将胰岛素原转变为胰岛素。（体外将胰岛素原转变为胰岛素。（丹丹麦麦NovoNordisk公司公司）先分别大肠杆菌发酵胰岛素的先分别大肠杆菌发酵胰岛素的A链链和和B链，纯化后再在体外重组产生完链，纯化后再在体外重组产生完整的人胰岛素。（美国整的人胰岛素。（美国El

24、ililly公司）公司）酵母发酵产生前胰岛素原。酵母发酵产生前胰岛素原。第40页，讲稿共82张，创作于星期日41已上市的基因工程胰岛素药物已上市的基因工程胰岛素药物1、重组人胰岛素：、重组人胰岛素：Humulin、Novoli2、重组人胰岛素类似物：赖脯胰岛素、重组人胰岛素类似物：赖脯胰岛素 Humalog，作，作用快用快3、甘精胰岛素：、甘精胰岛素：Lantus4、门冬胰岛素：、门冬胰岛素：Novolog：速效：速效HumulinHumalog第41页，讲稿共82张，创作于星期日42曾经的曾经的II型糖尿病治疗药物型糖尿病治疗药物第42页，讲稿共82张，创作于星期日43研制基因工程药物胰岛素

25、的基本路线研制基因工程药物胰岛素的基本路线?第43页，讲稿共82张，创作于星期日448.3.1.2 生长激素（生长激素（growth hormone）概况：是一类由动物脑垂体前概况：是一类由动物脑垂体前叶分泌的能促进生长的叶分泌的能促进生长的蛋白类蛋白类激素激素。191个氨基酸组成，分子量个氨基酸组成，分子量21.5kDa。侏儒症；巨人症；肢端肥大症侏儒症；巨人症；肢端肥大症第44页，讲稿共82张，创作于星期日45生长激素生长激素生理功能生理功能：治疗垂体性侏儒症：治疗垂体性侏儒症刺激骨和软骨的生长刺激骨和软骨的生长促进黏多糖及胶原的合成促进黏多糖及胶原的合成影响蛋白质、糖、脂类的代谢，最终影

26、响肌体的生长影响蛋白质、糖、脂类的代谢，最终影响肌体的生长与发育与发育第45页，讲稿共82张，创作于星期日46第一代：大肠杆菌生产，第一代：大肠杆菌生产，N端多一甲硫氨酸端多一甲硫氨酸第二代第二代：分泌蛋白形式，信号肽被自动切去：分泌蛋白形式，信号肽被自动切去第46页，讲稿共82张，创作于星期日478.3.2 基因工程细胞因子类药物基因工程细胞因子类药物细胞因子（细胞因子（Cytokine）:由细胞分泌的能调节生物由细胞分泌的能调节生物有机体生理功能，参与细胞的增殖、分化和凋亡的小有机体生理功能，参与细胞的增殖、分化和凋亡的小分子多肽类物质。分子多肽类物质。干扰素（干扰素（IFN）、白细胞介素

27、（）、白细胞介素（IL）、肿瘤坏死因）、肿瘤坏死因子（子（TNF）、生长因子（）、生长因子（GF）第47页，讲稿共82张，创作于星期日48细胞因子通过与靶细胞表面的特异性受体结合后细胞因子通过与靶细胞表面的特异性受体结合后会引发信号的转导，导致会引发信号的转导，导致细胞表面结构和功能的细胞表面结构和功能的变化变化。作用特点作用特点：多相性、网络性、高效性：多相性、网络性、高效性细胞因子细胞因子生物学功能生物学功能：调节免疫应答、抗病毒、抗：调节免疫应答、抗病毒、抗肿瘤、调节肌体造血功能、促进炎症反应。可治疗多肿瘤、调节肌体造血功能、促进炎症反应。可治疗多种免疫疾病、肿瘤、造血功能障碍等。种免疫

28、疾病、肿瘤、造血功能障碍等。第48页，讲稿共82张，创作于星期日49第49页，讲稿共82张，创作于星期日508.3.2.1 干扰素（干扰素（interferon,IFN）1957年年英国英国病毒生物学家病毒生物学家AlickIsaacs和和瑞士瑞士研究人研究人员员JeanIndenmann首次发现，利用灭活的流感病毒首次发现，利用灭活的流感病毒作用于鸡胚绒毛尿囊膜后，可使细胞产生一种干扰作用于鸡胚绒毛尿囊膜后，可使细胞产生一种干扰病毒繁殖的可溶性物质，称为病毒繁殖的可溶性物质，称为干扰素干扰素。普遍存在：脾脏、肝脏、肾脏、骨髓等；可被多种因普遍存在：脾脏、肝脏、肾脏、骨髓等；可被多种因素诱发分

29、泌，如病毒，双链素诱发分泌，如病毒，双链RNA等。等。第50页，讲稿共82张，创作于星期日51o种类种类 产生细胞产生细胞 用途用途-干扰素干扰素 白细胞白细胞 I I型干扰素型干扰素 antivirus,anti-tumor-干扰素干扰素 成纤维细胞成纤维细胞 -干扰素干扰素 活化活化T T、NKNK细胞细胞 型干扰素型干扰素 immuneregulation干扰素来源、分类与用途IFN-1b第51页，讲稿共82张，创作于星期日52干扰素干扰素o位置：位于人第位置：位于人第9号染色体上号染色体上o无内含子，无内含子，5端非编码区端非编码区+信号肽信号肽+编码区编码区+3端非端非编码区组成。编

30、码区组成。o表达产物：表达产物：188-189个氨基酸前体，分泌时切去个氨基酸前体，分泌时切去N端端23个氨基酸，个氨基酸，165-166个氨基酸的活性产物。个氨基酸的活性产物。o四个半胱氨酸（四个半胱氨酸（1，29，98/99，138/139），），2对二硫对二硫键：键：1 98/99，29138/139。第52页，讲稿共82张，创作于星期日53干扰素干扰素o位置：位于人第位置：位于人第12号染色体上号染色体上o4个外显子个外显子+3个内含子个内含子o表达产物：表达产物：143个氨基酸个氨基酸o有糖基化有糖基化第53页，讲稿共82张，创作于星期日54干扰素生理作用：干扰素生理作用：抗病毒感染

31、：作用于细胞后能合成多种抗病毒抗病毒感染：作用于细胞后能合成多种抗病毒蛋白，抑制病毒的复制。蛋白，抑制病毒的复制。调控细胞的生长：可抑制或促进细胞的生长。调控细胞的生长：可抑制或促进细胞的生长。调节免疫细胞发挥生理效应：在临床上已用于治调节免疫细胞发挥生理效应：在临床上已用于治疗白血病、乙型肝炎、丙型肝炎、多发性硬化症和疗白血病、乙型肝炎、丙型肝炎、多发性硬化症和类风湿关节炎等多种疾病类风湿关节炎等多种疾病。第54页，讲稿共82张，创作于星期日55o1976年年Greenberg等首先报道用人白细胞干扰素治疗等首先报道用人白细胞干扰素治疗4例慢性活动性乙肝，治疗后有例慢性活动性乙肝，治疗后有2

32、例例HBeAg消失。消失。o1980-1982年，年，基因工程方法基因工程方法在大肠杆菌及酵母菌在大肠杆菌及酵母菌细胞内获得了干扰素，从每细胞内获得了干扰素，从每1升细胞培养物中可以得升细胞培养物中可以得到到20-40毫升干扰素。毫升干扰素。o从从1987年开始，用基因工程方法生产的干扰素进入年开始，用基因工程方法生产的干扰素进入了工业化生产，并且大量投放市场。了工业化生产，并且大量投放市场。第55页，讲稿共82张，创作于星期日56可供临床选用的干扰素可供临床选用的干扰素l惠福仁惠福仁（类淋巴母细胞干扰素）：葛兰素（类淋巴母细胞干扰素）：葛兰素威康（英国）威康（英国）l重组重组 IFN-1b，

33、赛若金赛若金，国产，深圳科兴，国产，深圳科兴 IFN-2a，罗扰素罗扰素，罗氏公司（瑞士），罗氏公司（瑞士）IFN-2b，干扰能（甘乐能）干扰能（甘乐能），先灵葆雅，先灵葆雅（美国）（美国）l组合干扰素，组合干扰素，干复津干复津，安进（美国），安进（美国）。第56页，讲稿共82张，创作于星期日57l各种亚型的干扰素各种亚型的干扰素-（含（含1或或2或或2a或或2b）疗效）疗效近似；近似；l因为因为IFN不能通过胃肠道吸收，临床主要采取不能通过胃肠道吸收，临床主要采取肌肉注射肌肉注射和和皮下注射皮下注射2种方式，种方式，2h后达到血液最高浓度。吸收率后达到血液最高浓度。吸收率可达可达80%以上。

34、以上。第57页，讲稿共82张，创作于星期日58基因工程生产基因工程生产IFNo大肠杆菌表达体系大肠杆菌表达体系：温度诱导系统，：温度诱导系统，30振荡培养至振荡培养至AD600达达0.4后将温度升高至后将温度升高至42 ，继续培养，继续培养5h。o新型干扰素：新型干扰素：o长效长效rhIFN-o干扰素联合利巴韦林干扰素联合利巴韦林第58页，讲稿共82张，创作于星期日598.3.2.2 红细胞生成素（红细胞生成素（EPO）红细胞生成素（红细胞生成素（EPO）：是一种集落刺激因子。它由：是一种集落刺激因子。它由肾脏和肝脏产生，其主要功能是刺激造血始细胞分化为肾脏和肝脏产生，其主要功能是刺激造血始细

35、胞分化为红细胞，维持外周血中红细胞的正常水平。红细胞，维持外周血中红细胞的正常水平。7号染色体，号染色体，5个外显子，成熟个外显子，成熟165个氨基酸个氨基酸糖基化糖基化：只能采用哺乳动物表达系统如：只能采用哺乳动物表达系统如CHO细胞。细胞。治疗肾功能衰退导致的贫血、非肾性导致的贫血治疗肾功能衰退导致的贫血、非肾性导致的贫血第59页，讲稿共82张，创作于星期日60临床用临床用rh EPO美国美国Amgen公司的公司的Epogen日本麒麟公司的利血宝（日本麒麟公司的利血宝（Espo）德国宝灵曼公司的生血素（德国宝灵曼公司的生血素（Recormon）珠海丽珠制药厂等珠海丽珠制药厂等10多家单位：

36、益比奥，宁红多家单位：益比奥，宁红欣，爱血宝欣，爱血宝 第60页，讲稿共82张，创作于星期日61基因工程生产红细胞生成素的主要步骤？基因工程生产红细胞生成素的主要步骤？第61页，讲稿共82张，创作于星期日628.3.2.3 白介素（白介素（interleukin，IL）1979年第二届国际淋巴因子研讨会指出，年第二届国际淋巴因子研讨会指出，白介素白介素是一类是一类免疫调节因子免疫调节因子，指由白细胞产生，介导白细胞或，指由白细胞产生，介导白细胞或免疫细胞间相互作用的淋巴因子。免疫细胞间相互作用的淋巴因子。白细胞介素在传递信息，激活与调节免疫细胞，白细胞介素在传递信息，激活与调节免疫细胞，介导介

37、导T、B细胞活化、增殖与分化及在炎症反应中起细胞活化、增殖与分化及在炎症反应中起重要作用。重要作用。第62页，讲稿共82张，创作于星期日63白细胞介素（白细胞介素（IL）生理功能：在免疫调节中生理功能：在免疫调节中起重要作用起重要作用:促进多种促进多种T细胞增殖和分化细胞增殖和分化促进天然杀伤细胞的杀伤能力促进天然杀伤细胞的杀伤能力促进促进B细胞的增殖和分化细胞的增殖和分化促进多种细胞因子和细胞因子受体的表达，因而在抗肿瘤促进多种细胞因子和细胞因子受体的表达，因而在抗肿瘤和抗感染中发挥重要功能。和抗感染中发挥重要功能。第63页，讲稿共82张，创作于星期日64人白介素人白介素-2o又称又称T细胞

38、生长因子，由细胞生长因子，由133个个氨基酸组成的单链，分子量氨基酸组成的单链，分子量15-17.5kD。o3个半胱氨酸（个半胱氨酸（cys58,105,125），），cys58,105之间形成二硫键才有之间形成二硫键才有活性。活性。o有糖基化位点，但糖基化与否并有糖基化位点，但糖基化与否并不影响功能。不影响功能。o活性集中在活性集中在N端。端。o对热不稳定。对热不稳定。人白介素人白介素-11o又称脂肪细胞生长抑制因子，又称脂肪细胞生长抑制因子，由由178个氨基酸组成的单链，个氨基酸组成的单链，分子量分子量23-24kD。o无半胱氨酸，富含脯氨酸和碱性无半胱氨酸，富含脯氨酸和碱性氨基酸。氨基酸

39、。o无糖基化位点。无糖基化位点。o活性集中在活性集中在C端和端和Met59。o对热稳定，对热稳定，80处理不丧失活性。处理不丧失活性。第64页，讲稿共82张，创作于星期日65IL生物活性和临床应用：生物活性和临床应用：IL-2：o处于调节机体免疫应答的细胞因子网络的中心环节，处于调节机体免疫应答的细胞因子网络的中心环节，对机体免疫监视和抗肿瘤免疫应答具有重要意义。对机体免疫监视和抗肿瘤免疫应答具有重要意义。o不能直接杀伤肿瘤细胞。不能直接杀伤肿瘤细胞。用于治疗肿瘤、免疫缺陷和感染性疾病等。用于治疗肿瘤、免疫缺陷和感染性疾病等。用于抗感染治疗，如麻风病。用于抗感染治疗，如麻风病。先天和后天性免疫

40、缺陷，如先天和后天性免疫缺陷，如HIV。第65页，讲稿共82张，创作于星期日66rhIL-2o1984年批准用于临床试验，年批准用于临床试验，1992年年FDA批准上市，批准上市，Proeukin，血管肉瘤，肾癌。，血管肉瘤，肾癌。o国内：国内：1997年先后上市，有安特鲁克，辛洛尔，年先后上市，有安特鲁克，辛洛尔，德路生等。德路生等。第66页，讲稿共82张，创作于星期日67IL-11：o是一种血小板生长因子，用于治疗癌症患者放化疗后是一种血小板生长因子，用于治疗癌症患者放化疗后血小板减少唯一安全有效药物。血小板减少唯一安全有效药物。多功能造血细胞因子多功能造血细胞因子促进骨髓增殖。促进骨髓增

41、殖。银屑病。银屑病。第67页，讲稿共82张，创作于星期日68rhIL-11o1997年美国年美国FDA批准批准Genetics Institute（GI公司）研公司）研制的制的rhIL-11上市。上市。o国内国内2001年公布批准上市，质量与进口相当，一年公布批准上市，质量与进口相当，一家为酵母，其余为大肠杆菌表达系统。家为酵母，其余为大肠杆菌表达系统。第68页，讲稿共82张，创作于星期日69干细胞因子（干细胞因子（hSCF）又称肥大细胞生长因子，又称肥大细胞生长因子，steelsteel因子，因子，kitkit配体：能配体：能刺激刺激骨髓造血干细胞骨髓造血干细胞和和造血始细胞造血始细胞增殖，

42、是造血干增殖，是造血干细胞增殖分化的关键因子。细胞增殖分化的关键因子。与与IL-3、EPO等有协同效应。等有协同效应。248248个氨基酸组成，是一种酸性糖蛋白。个氨基酸组成，是一种酸性糖蛋白。可用于治疗原发或继发可用于治疗原发或继发性的干细胞功能异常的性的干细胞功能异常的疾病疾病第69页，讲稿共82张，创作于星期日70人表皮生长因子（人表皮生长因子（hEGF）5353个氨基酸组成个氨基酸组成生理作用生理作用：对多种细胞如表皮细胞、上皮细胞等有刺激效应对多种细胞如表皮细胞、上皮细胞等有刺激效应对内皮细胞有刺激作用对内皮细胞有刺激作用促进新血管的生成促进新血管的生成主要用于外伤、溃疡、烧伤等。主

43、要用于外伤、溃疡、烧伤等。hEGFhEGF还能促进正常表皮细胞的新陈代谢还能促进正常表皮细胞的新陈代谢,添加到添加到美容护肤品中可以达到美白、抗皱、延缓衰老的作美容护肤品中可以达到美白、抗皱、延缓衰老的作用。用。第70页，讲稿共82张，创作于星期日718.3.3 基因工程抗体基因工程抗体抗体（抗体（antibody，Ab）：在抗原物质刺激下产生的，：在抗原物质刺激下产生的，能与相应抗原发生特异性免疫反应的的蛋白质分子。能与相应抗原发生特异性免疫反应的的蛋白质分子。是机体免疫细胞被抗原激活后，由分化成熟的是机体免疫细胞被抗原激活后，由分化成熟的B B细胞细胞-浆细胞合成、分泌的一类能与相应抗原特

44、异性结合浆细胞合成、分泌的一类能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。的具有免疫功能的球蛋白。抗体是免疫系统在外界抗原刺抗体是免疫系统在外界抗原刺激下产生的一种蛋白。激下产生的一种蛋白。第71页，讲稿共82张，创作于星期日72抗体结构与功能抗体结构与功能组成：组成：2条轻链条轻链2条重链条重链抗体作用抗体作用：体液免疫功能：体液免疫功能与特异性抗原结合发生免疫反应与特异性抗原结合发生免疫反应活化补体活化补体与不同受体结合介导与不同受体结合介导型免疫反应型免疫反应或调节吞噬细胞的吞噬功能或调节吞噬细胞的吞噬功能第72页，讲稿共82张，创作于星期日73抗体的产生经历了三个阶段抗体的产生经历了

45、三个阶段经典免疫方法产生的异源多克隆抗体经典免疫方法产生的异源多克隆抗体细胞工程产生的鼠源单克隆抗体细胞工程产生的鼠源单克隆抗体基因工程产生的人源单克隆抗体基因工程产生的人源单克隆抗体 u单克隆抗体单克隆抗体是由识别一种抗原决定簇的细胞所是由识别一种抗原决定簇的细胞所产生的均一性抗体，它反应的特异性高、亲和产生的均一性抗体，它反应的特异性高、亲和力强、效价高、血清交叉反应少。力强、效价高、血清交叉反应少。第73页，讲稿共82张，创作于星期日74抗原制备和提纯与动物免疫抗原制备和提纯与动物免疫 动物免疫动物免疫(Balb/小鼠小鼠)骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备和培养骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备和培养

46、 细胞融合细胞融合 阳性克隆单克隆化阳性克隆单克隆化 阳性克隆筛选阳性克隆筛选 有限稀释法有限稀释法 筛选方法建立筛选方法建立 单克隆抗体的制备和冻存单克隆抗体的制备和冻存 单克隆抗体的纯化单克隆抗体的纯化 单克隆抗体特异性鉴定单克隆抗体特异性鉴定单克隆抗体的功能研究单克隆抗体的功能研究 单克隆抗体应用研究单克隆抗体应用研究 制备单克隆抗体是复制备单克隆抗体是复杂而费时的工作，整杂而费时的工作，整个技术流程。个技术流程。第74页，讲稿共82张，创作于星期日75流流程程第75页，讲稿共82张，创作于星期日76基因工程抗体基因工程抗体基因工程抗体：以基因工程技术等高新生物技术为平台，基因工程抗体：

47、以基因工程技术等高新生物技术为平台，制备的抗体总称。制备的抗体总称。目前制备的抗体多为鼠源性，临床应用时，对人是异种抗原，目前制备的抗体多为鼠源性，临床应用时，对人是异种抗原，重复注射可使人产生重复注射可使人产生抗鼠抗体抗鼠抗体，从而减弱或失去疗效，并，从而减弱或失去疗效，并增加了超敏反应的发生。增加了超敏反应的发生。因此，在因此，在 80 年年代早期，人们开始利用基因工程制备抗代早期，人们开始利用基因工程制备抗体，以体，以降低鼠源抗体的免疫原性及其功能降低鼠源抗体的免疫原性及其功能。目前多采用。目前多采用人抗体的部分氨基酸序列代替某些鼠源性抗体人抗体的部分氨基酸序列代替某些鼠源性抗体的序列，

48、的序列，经修饰制备基因工程抗体，称为第三代抗体。经修饰制备基因工程抗体，称为第三代抗体。第76页，讲稿共82张，创作于星期日77基因工程抗体种类基因工程抗体种类单链抗体：重链和轻链的可变区单链抗体：重链和轻链的可变区嵌合抗体嵌合抗体：鼠的：鼠的V区与人的区与人的C区区第77页，讲稿共82张，创作于星期日78制备人源单克隆抗体两种方法制备人源单克隆抗体两种方法1、将人的整套抗体基因克隆到噬菌体载体上，构建抗、将人的整套抗体基因克隆到噬菌体载体上，构建抗体基因库：体基因库：抗体基因与噬菌体编码外壳蛋白基因相连，抗体与外壳蛋白以融合抗体基因与噬菌体编码外壳蛋白基因相连，抗体与外壳蛋白以融合蛋白的形式

49、进行表达蛋白的形式进行表达分离带抗体片段的噬菌体颗粒，通过纯化即可获得不同的特分离带抗体片段的噬菌体颗粒，通过纯化即可获得不同的特异性抗体。异性抗体。2 2、以人的抗体基因置换小鼠的全套抗体基因：、以人的抗体基因置换小鼠的全套抗体基因：通过抗原物质刺激小鼠，表达出人源特异性抗体。以该方法获得的抗通过抗原物质刺激小鼠，表达出人源特异性抗体。以该方法获得的抗体具有高度的特异性和免疫亲和力。体具有高度的特异性和免疫亲和力。第78页，讲稿共82张，创作于星期日798.3.4 基因工程疫苗基因工程疫苗基因工程细菌疫苗：基因工程细菌疫苗：包括包括减毒活菌苗减毒活菌苗、灭活死菌苗、菌苗的蛋白多糖成、灭活死菌

50、苗、菌苗的蛋白多糖成分等。痢疾、霍乱、伤寒、结核、幽门螺旋杆菌等分等。痢疾、霍乱、伤寒、结核、幽门螺旋杆菌等基因工程病毒疫苗基因工程病毒疫苗:牛痘、狂犬病牛痘、狂犬病 基因工程亚单位疫苗：基因工程亚单位疫苗：指通过基因工程表达具有抗指通过基因工程表达具有抗原活性的原活性的病毒蛋白质病毒蛋白质制成的疫苗。制成的疫苗。载体疫苗：载体疫苗：将抗原基因重组到载体微生物中，使其表将抗原基因重组到载体微生物中，使其表达出相应保护性抗原后而制成的疫苗。达出相应保护性抗原后而制成的疫苗。基因缺失活疫苗：基因缺失活疫苗：第79页，讲稿共82张，创作于星期日80核酸疫苗：核酸疫苗：核酸疫苗核酸疫苗（基因疫苗）：指