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1、基因工程药物的第1页，本讲稿共36页 宿主细胞中表达的外源基因，在转宿主细胞中表达的外源基因，在转宿主细胞中表达的外源基因，在转宿主细胞中表达的外源基因，在转录翻译精制工艺放大过程中都可能录翻译精制工艺放大过程中都可能录翻译精制工艺放大过程中都可能录翻译精制工艺放大过程中都可能发生变化，故从原料以及制备全过发生变化，故从原料以及制备全过发生变化，故从原料以及制备全过发生变化，故从原料以及制备全过程都必须严格控制条件和鉴定质量。程都必须严格控制条件和鉴定质量。程都必须严格控制条件和鉴定质量。程都必须严格控制条件和鉴定质量。第2页，本讲稿共36页一、一、一、一、原材料的质量控制原材料的质量控制原材
2、料的质量控制原材料的质量控制 原材料的质量控制是确保编码药原材料的质量控制是确保编码药原材料的质量控制是确保编码药原材料的质量控制是确保编码药品的品的品的品的DNADNA序列的正确性，重组微生物序列的正确性，重组微生物序列的正确性，重组微生物序列的正确性，重组微生物来自单一克隆，所用质粒纯而稳定，来自单一克隆，所用质粒纯而稳定，来自单一克隆，所用质粒纯而稳定，来自单一克隆，所用质粒纯而稳定，以保证产品质量的安全性和一致性。以保证产品质量的安全性和一致性。以保证产品质量的安全性和一致性。以保证产品质量的安全性和一致性。第3页，本讲稿共36页 根据质量控制要求应了解以下根据质量控制要求应了解以下根
3、据质量控制要求应了解以下根据质量控制要求应了解以下 特性：特性：特性：特性：明确目的基因的来源、克隆经过，明确目的基因的来源、克隆经过，明确目的基因的来源、克隆经过，明确目的基因的来源、克隆经过，并以限制性内切酶酶切图谱并以限制性内切酶酶切图谱并以限制性内切酶酶切图谱并以限制性内切酶酶切图谱 和核苷酸序列予以确证；和核苷酸序列予以确证；和核苷酸序列予以确证；和核苷酸序列予以确证；第4页，本讲稿共36页 应提供表达载体的名称、结构、遗传应提供表达载体的名称、结构、遗传应提供表达载体的名称、结构、遗传应提供表达载体的名称、结构、遗传特性及各组成部分（如复制子、启动特性及各组成部分（如复制子、启动特
4、性及各组成部分（如复制子、启动特性及各组成部分（如复制子、启动子）的来源与功能，构建中所用位点子）的来源与功能，构建中所用位点子）的来源与功能，构建中所用位点子）的来源与功能，构建中所用位点的酶切图谱，抗生素抗性标记物；的酶切图谱，抗生素抗性标记物；的酶切图谱，抗生素抗性标记物；的酶切图谱，抗生素抗性标记物；应提供宿主细胞的名称、来源、传代应提供宿主细胞的名称、来源、传代应提供宿主细胞的名称、来源、传代应提供宿主细胞的名称、来源、传代历史、检定结果及其生物学特性；历史、检定结果及其生物学特性；历史、检定结果及其生物学特性；历史、检定结果及其生物学特性；第5页，本讲稿共36页 须阐明载体引入宿主
5、细胞的方法须阐明载体引入宿主细胞的方法须阐明载体引入宿主细胞的方法须阐明载体引入宿主细胞的方法及载体在宿主细胞与载体结合后的及载体在宿主细胞与载体结合后的及载体在宿主细胞与载体结合后的及载体在宿主细胞与载体结合后的遗传稳定性；遗传稳定性；遗传稳定性；遗传稳定性；提供插入基因与表达载体两侧端控制提供插入基因与表达载体两侧端控制提供插入基因与表达载体两侧端控制提供插入基因与表达载体两侧端控制区内的核苷酸序列，详细叙述在生产区内的核苷酸序列，详细叙述在生产区内的核苷酸序列，详细叙述在生产区内的核苷酸序列，详细叙述在生产过程中启动与控制基因在宿主细胞中过程中启动与控制基因在宿主细胞中过程中启动与控制基
6、因在宿主细胞中过程中启动与控制基因在宿主细胞中表达的方法及水平等。表达的方法及水平等。表达的方法及水平等。表达的方法及水平等。第6页，本讲稿共36页二、培养过程的质量控制二、培养过程的质量控制 在工程菌的贮存中，要求种子克在工程菌的贮存中，要求种子克在工程菌的贮存中，要求种子克在工程菌的贮存中，要求种子克隆纯而稳定；隆纯而稳定；隆纯而稳定；隆纯而稳定；在培养过程中，要求工程菌所含在培养过程中，要求工程菌所含在培养过程中，要求工程菌所含在培养过程中，要求工程菌所含的质粒稳定，始终无突变；的质粒稳定，始终无突变；的质粒稳定，始终无突变；的质粒稳定，始终无突变；在重复生产发酵中，工程菌表达稳在重复生
7、产发酵中，工程菌表达稳在重复生产发酵中，工程菌表达稳在重复生产发酵中，工程菌表达稳定；定；定；定；始终能排除外源微生物污染。始终能排除外源微生物污染。始终能排除外源微生物污染。始终能排除外源微生物污染。第7页，本讲稿共36页 生产基因工程产品应有种子批生产基因工程产品应有种子批生产基因工程产品应有种子批生产基因工程产品应有种子批系统，并证明种子批不含有致癌因系统，并证明种子批不含有致癌因系统，并证明种子批不含有致癌因系统，并证明种子批不含有致癌因子，无细菌、病毒、真菌和支原体子，无细菌、病毒、真菌和支原体子，无细菌、病毒、真菌和支原体子，无细菌、病毒、真菌和支原体等污染，并由原始种子批建立生产
8、等污染，并由原始种子批建立生产等污染，并由原始种子批建立生产等污染，并由原始种子批建立生产用工作细胞库。用工作细胞库。用工作细胞库。用工作细胞库。第8页，本讲稿共36页 原始种子批须确证克隆基因原始种子批须确证克隆基因原始种子批须确证克隆基因原始种子批须确证克隆基因DNADNADNADNA序列，详细叙述种子批来源、方序列，详细叙述种子批来源、方序列，详细叙述种子批来源、方序列，详细叙述种子批来源、方式、保存及预计使用期，保存与复式、保存及预计使用期，保存与复式、保存及预计使用期，保存与复式、保存及预计使用期，保存与复苏时宿主载体表达系统的稳定性。苏时宿主载体表达系统的稳定性。苏时宿主载体表达系
9、统的稳定性。苏时宿主载体表达系统的稳定性。第9页，本讲稿共36页 对生产种子，应详细叙述细胞生对生产种子，应详细叙述细胞生对生产种子，应详细叙述细胞生对生产种子，应详细叙述细胞生长与产品生成的方法和材料，并控制长与产品生成的方法和材料，并控制长与产品生成的方法和材料，并控制长与产品生成的方法和材料，并控制微生物污染；提供培养生产浓度与产微生物污染；提供培养生产浓度与产微生物污染；提供培养生产浓度与产微生物污染；提供培养生产浓度与产量恒定性数据，依据宿主细胞量恒定性数据，依据宿主细胞量恒定性数据，依据宿主细胞量恒定性数据，依据宿主细胞-载体载体载体载体系统稳定性，确定最高允许传种代系统稳定性，确
10、定最高允许传种代系统稳定性，确定最高允许传种代系统稳定性，确定最高允许传种代数；数；数；数；第10页，本讲稿共36页 在培养过程中，应测定被表在培养过程中，应测定被表在培养过程中，应测定被表在培养过程中，应测定被表达基因分子的完整性及宿主细胞达基因分子的完整性及宿主细胞达基因分子的完整性及宿主细胞达基因分子的完整性及宿主细胞长期培养后的基因型特征；依宿长期培养后的基因型特征；依宿长期培养后的基因型特征；依宿长期培养后的基因型特征；依宿主细胞主细胞主细胞主细胞-载体稳定性与产品恒定性，载体稳定性与产品恒定性，载体稳定性与产品恒定性，载体稳定性与产品恒定性，规定持续培养时间，并定期评价细规定持续培
11、养时间，并定期评价细规定持续培养时间，并定期评价细规定持续培养时间，并定期评价细胞系统和产品。胞系统和产品。胞系统和产品。胞系统和产品。第11页，本讲稿共36页 培养周期结束时，应监测宿培养周期结束时，应监测宿培养周期结束时，应监测宿培养周期结束时，应监测宿主细胞主细胞主细胞主细胞-载体系统的特性，如质载体系统的特性，如质载体系统的特性，如质载体系统的特性，如质粒拷贝数、宿主细胞中表达载体粒拷贝数、宿主细胞中表达载体粒拷贝数、宿主细胞中表达载体粒拷贝数、宿主细胞中表达载体存留程度，含插入基因载体的酶存留程度，含插入基因载体的酶存留程度，含插入基因载体的酶存留程度，含插入基因载体的酶切图谱等。切
12、图谱等。切图谱等。切图谱等。第12页，本讲稿共36页三、纯化工艺过程的质量控制三、纯化工艺过程的质量控制三、纯化工艺过程的质量控制三、纯化工艺过程的质量控制 产品要有足够的生理和生物产品要有足够的生理和生物产品要有足够的生理和生物产品要有足够的生理和生物学试验数据，确证提纯物分子批学试验数据，确证提纯物分子批学试验数据，确证提纯物分子批学试验数据，确证提纯物分子批间保持一致性；外源蛋白质、间保持一致性；外源蛋白质、间保持一致性；外源蛋白质、间保持一致性；外源蛋白质、DNADNA与热源质控制在规定限度以与热源质控制在规定限度以与热源质控制在规定限度以与热源质控制在规定限度以下。下。下。下。第13
13、页，本讲稿共36页 在精制过程中能清除宿主细在精制过程中能清除宿主细在精制过程中能清除宿主细在精制过程中能清除宿主细胞蛋白质、核酸、糖类、病毒、胞蛋白质、核酸、糖类、病毒、胞蛋白质、核酸、糖类、病毒、胞蛋白质、核酸、糖类、病毒、培养基成分及精制工序本身引入培养基成分及精制工序本身引入培养基成分及精制工序本身引入培养基成分及精制工序本身引入的化学物质，并有检测方法。的化学物质，并有检测方法。的化学物质，并有检测方法。的化学物质，并有检测方法。第14页，本讲稿共36页四、目标产品的质量控制四、目标产品的质量控制四、目标产品的质量控制四、目标产品的质量控制 基因工程药物的质量控制主要包括基因工程药物
14、的质量控制主要包括基因工程药物的质量控制主要包括基因工程药物的质量控制主要包括以下几项要求以下几项要求以下几项要求以下几项要求:产品的鉴别、纯度、活产品的鉴别、纯度、活产品的鉴别、纯度、活产品的鉴别、纯度、活性、安全性、稳定性和一致性。它需性、安全性、稳定性和一致性。它需性、安全性、稳定性和一致性。它需性、安全性、稳定性和一致性。它需要利用生物化学、免疫学、微生物学、要利用生物化学、免疫学、微生物学、要利用生物化学、免疫学、微生物学、要利用生物化学、免疫学、微生物学、细胞生物学和分子生物学等多学科的细胞生物学和分子生物学等多学科的细胞生物学和分子生物学等多学科的细胞生物学和分子生物学等多学科的
15、理论与技术所建立的鉴定方法。理论与技术所建立的鉴定方法。理论与技术所建立的鉴定方法。理论与技术所建立的鉴定方法。第15页，本讲稿共36页产品的鉴别产品的鉴别 常用的鉴定方法常用的鉴定方法常用的鉴定方法常用的鉴定方法:电泳方法电泳方法电泳方法电泳方法:SDS-PAGE:SDS-PAGE、等电聚焦、等电聚焦、等电聚焦、等电聚焦、免疫电泳免疫电泳免疫电泳免疫电泳 免疫学方法免疫学方法免疫学方法免疫学方法:放射免疫放射免疫放射免疫放射免疫(RIA)(RIA)、酶联免疫、酶联免疫、酶联免疫、酶联免疫(ELISA)(ELISA)受体结合试验受体结合试验受体结合试验受体结合试验 高效液相色谱高效液相色谱高效
16、液相色谱高效液相色谱(HPLC)(HPLC)、肽图分析法、肽图分析法、肽图分析法、肽图分析法、末端序列分末端序列分末端序列分末端序列分 析、圆二色谱、核磁共振析、圆二色谱、核磁共振析、圆二色谱、核磁共振析、圆二色谱、核磁共振第16页，本讲稿共36页 肽图分析肽图分析肽图分析肽图分析 肽图分析是用酶法或化学法降解目的肽图分析是用酶法或化学法降解目的肽图分析是用酶法或化学法降解目的肽图分析是用酶法或化学法降解目的蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质,对生成的肽段进行分离分析。它是对生成的肽段进行分离分析。它是对生成的肽段进行分离分析。它是对生成的肽段进行分离分析。它是检测蛋白质一级结构最有效的方法，该技检测蛋
17、白质一级结构最有效的方法，该技检测蛋白质一级结构最有效的方法，该技检测蛋白质一级结构最有效的方法，该技术灵敏高效是对基因工程药物的分子结构术灵敏高效是对基因工程药物的分子结构术灵敏高效是对基因工程药物的分子结构术灵敏高效是对基因工程药物的分子结构和遗传稳定性进行评价和验证的首选方法。和遗传稳定性进行评价和验证的首选方法。和遗传稳定性进行评价和验证的首选方法。和遗传稳定性进行评价和验证的首选方法。常用常用常用常用HPLCHPLC、毛细管电泳。、毛细管电泳。、毛细管电泳。、毛细管电泳。第17页，本讲稿共36页 氨基酸成分分析氨基酸成分分析氨基酸成分分析氨基酸成分分析 5050个氨基酸较理想个氨基酸
18、较理想个氨基酸较理想个氨基酸较理想 部分氨基酸序列分析部分氨基酸序列分析部分氨基酸序列分析部分氨基酸序列分析 N N端端端端1515个氨基酸可作为重个氨基酸可作为重个氨基酸可作为重个氨基酸可作为重 组蛋白质和多肽的重要鉴组蛋白质和多肽的重要鉴组蛋白质和多肽的重要鉴组蛋白质和多肽的重要鉴 定指标。定指标。定指标。定指标。第18页，本讲稿共36页 重组蛋白质浓度测定和相对分子重组蛋白质浓度测定和相对分子重组蛋白质浓度测定和相对分子重组蛋白质浓度测定和相对分子量的测定量的测定量的测定量的测定 蛋白质浓度测定方法有蛋白质浓度测定方法有蛋白质浓度测定方法有蛋白质浓度测定方法有:福林福林福林福林-酚法、酚
19、法、酚法、酚法、双缩脲法双缩脲法双缩脲法双缩脲法 蛋白相对分子量的测定蛋白相对分子量的测定蛋白相对分子量的测定蛋白相对分子量的测定:凝胶过滤凝胶过滤凝胶过滤凝胶过滤法、法、法、法、SD-SPAGESD-SPAGE法法法法第19页，本讲稿共36页 蛋白质二硫键分析蛋白质二硫键分析蛋白质二硫键分析蛋白质二硫键分析 测定方法有测定方法有测定方法有测定方法有:对氯汞苯甲酸法等对氯汞苯甲酸法等对氯汞苯甲酸法等对氯汞苯甲酸法等 5 5 5 5，5 5 5 5-二硫基双二硫基双二硫基双二硫基双-2-2-2-2-硝基苯甲酸法硝基苯甲酸法硝基苯甲酸法硝基苯甲酸法第20页，本讲稿共36页 纯度分析纯度分析纯度分析
20、纯度分析 蛋白质含量测定蛋白质含量测定蛋白质含量测定蛋白质含量测定 SDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGE、等电聚焦、各种、等电聚焦、各种、等电聚焦、各种、等电聚焦、各种HPLCHPLCHPLCHPLC、毛毛毛毛细管电泳细管电泳细管电泳细管电泳 杂质杂质杂质杂质 蛋白类杂质蛋白类杂质蛋白类杂质蛋白类杂质 残留宿主细胞蛋白残留宿主细胞蛋白残留宿主细胞蛋白残留宿主细胞蛋白 采用免采用免采用免采用免疫分析的方法疫分析的方法疫分析的方法疫分析的方法 非蛋白类杂质非蛋白类杂质非蛋白类杂质非蛋白类杂质 第21页，本讲稿共36页非蛋白类杂质非蛋白类杂质非蛋白类杂质非蛋白类杂质非蛋白
21、类杂质主要有非蛋白类杂质主要有非蛋白类杂质主要有非蛋白类杂质主要有:病毒、细菌等微生物、热原、病毒、细菌等微生物、热原、病毒、细菌等微生物、热原、病毒、细菌等微生物、热原、内毒素、致敏源及内毒素、致敏源及内毒素、致敏源及内毒素、致敏源及DNADNADNADNA。第22页，本讲稿共36页常用检测方法：常用检测方法：常用检测方法：常用检测方法：杂质和污染物杂质和污染物杂质和污染物杂质和污染物杂质和污染物杂质和污染物 检检检检检检 测测测测测测 方方方方方方 法法法法法法内毒素内毒素内毒素内毒素内毒素内毒素 鲎试剂、家兔热原法鲎试剂、家兔热原法鲎试剂、家兔热原法鲎试剂、家兔热原法鲎试剂、家兔热原法鲎
22、试剂、家兔热原法宿主细胞蛋白宿主细胞蛋白宿主细胞蛋白宿主细胞蛋白宿主细胞蛋白宿主细胞蛋白 免疫分析、免疫分析、免疫分析、免疫分析、免疫分析、免疫分析、SDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGE、CECECECECECE其它蛋白杂质其它蛋白杂质其它蛋白杂质其它蛋白杂质其它蛋白杂质其它蛋白杂质 免疫分析、免疫分析、免疫分析、免疫分析、免疫分析、免疫分析、SDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGE、HPLCHPLCHPLCHPLCHPLCHPLC、CECECECECECE残余残余残余残余残余残
23、余DNA DNADNA DNADNA DNADNA DNADNA DNADNA DNA杂交、紫外光谱、蛋白结合杂交、紫外光谱、蛋白结合杂交、紫外光谱、蛋白结合杂交、紫外光谱、蛋白结合杂交、紫外光谱、蛋白结合杂交、紫外光谱、蛋白结合蛋白变异蛋白变异蛋白变异蛋白变异蛋白变异蛋白变异 肽谱、肽谱、肽谱、肽谱、肽谱、肽谱、HPLCHPLCHPLCHPLCHPLCHPLC、IEFIEFIEFIEFIEFIEF、CECECECECECE甲酰蛋氨酸甲酰蛋氨酸甲酰蛋氨酸甲酰蛋氨酸甲酰蛋氨酸甲酰蛋氨酸 肽谱、肽谱、肽谱、肽谱、肽谱、肽谱、HPLCHPLCHPLCHPLCHPLCHPLC、IEFIEFIEFIEF
24、IEFIEF、CECECECECECE蛋氨酸氧化蛋氨酸氧化蛋氨酸氧化蛋氨酸氧化蛋氨酸氧化蛋氨酸氧化 肽谱、肽谱、肽谱、肽谱、肽谱、肽谱、HPLCHPLCHPLCHPLCHPLCHPLC、质谱、氨基酸分析质谱、氨基酸分析质谱、氨基酸分析质谱、氨基酸分析质谱、氨基酸分析质谱、氨基酸分析产物变性或聚和脱氨基产物变性或聚和脱氨基产物变性或聚和脱氨基产物变性或聚和脱氨基产物变性或聚和脱氨基产物变性或聚和脱氨基 SDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGE、IEFIEFIEFIEFIEFIEF、HPLCHPLCHPLCHPLCHPLCHPLC、CECEC
25、ECECECE、质谱、质谱、质谱、质谱、质谱、质谱、凝胶过滤凝胶过滤凝胶过滤凝胶过滤凝胶过滤凝胶过滤第23页，本讲稿共36页杂质和污染物杂质和污染物杂质和污染物杂质和污染物杂质和污染物杂质和污染物 检检检检检检 测测测测测测 方方方方方方 法法法法法法单克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体 SDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGE、免疫分析、免疫分析、免疫分析、免疫分析、免疫分析、免疫分析氨基酸取代氨基酸取代氨基酸取代氨基酸取代氨基酸取代氨基酸取代 氨基酸分析、肽谱、质氨基酸分析、肽谱、质氨基酸分析、肽谱、质氨基酸分
26、析、肽谱、质氨基酸分析、肽谱、质氨基酸分析、肽谱、质 谱、谱、谱、谱、谱、谱、CECECECECECE微生物微生物微生物微生物微生物微生物 微生物学检查微生物学检查微生物学检查微生物学检查微生物学检查微生物学检查支原体支原体支原体支原体支原体支原体 微生物学检查微生物学检查微生物学检查微生物学检查微生物学检查微生物学检查病毒病毒病毒病毒病毒病毒 微生物学检查微生物学检查微生物学检查微生物学检查微生物学检查微生物学检查第24页，本讲稿共36页生物学活性测定生物学活性测定生物学活性测定生物学活性测定 需通过动物体内试验和通过细胞培养需通过动物体内试验和通过细胞培养需通过动物体内试验和通过细胞培养需
27、通过动物体内试验和通过细胞培养 进行体外效价测定。进行体外效价测定。进行体外效价测定。进行体外效价测定。稳定性考查稳定性考查稳定性考查稳定性考查 是药品有效性安全性的重要指标，是药是药品有效性安全性的重要指标，是药是药品有效性安全性的重要指标，是药是药品有效性安全性的重要指标，是药品贮藏条件和使用期限的主要依据。品贮藏条件和使用期限的主要依据。品贮藏条件和使用期限的主要依据。品贮藏条件和使用期限的主要依据。产品一致性的保证产品一致性的保证产品一致性的保证产品一致性的保证第25页，本讲稿共36页五、产品的保存五、产品的保存五、产品的保存五、产品的保存液态保存液态保存液态保存液态保存低温保存低温保
28、存低温保存低温保存在稳定的下保存在稳定的下保存在稳定的下保存在稳定的下保存高浓度保存高浓度保存高浓度保存高浓度保存加保护剂保存加保护剂保存加保护剂保存加保护剂保存固态保存固态保存固态保存固态保存第26页，本讲稿共36页第十节基因工程药物制造实例干扰素（干扰素（interferoninterferon，IFNIFN）是人体细胞分泌的一种活性蛋白质，）是人体细胞分泌的一种活性蛋白质，具有广泛的抗病毒抗肿瘤和免疫调节活性，是人体防御系统的重要组具有广泛的抗病毒抗肿瘤和免疫调节活性，是人体防御系统的重要组成部分。根据分子结构和抗原性的差异分为成部分。根据分子结构和抗原性的差异分为、等等4 4个个类型。
29、类型。型干扰素在分为型干扰素在分为1b 2a 2b1b 2a 2b等亚型。等亚型。一、基因工程菌的组建一、基因工程菌的组建 诱生的白细胞诱生的白细胞 提取全提取全RNA RNA 通过寡通过寡dT-dT-纤维素柱纤维素柱 蔗糖密度梯度蔗糖密度梯度 获得寡获得寡A A的的mRNA mRNA 离心提取离心提取12s12s 的的 mRNAmRNA 逆转录成逆转录成cDNA cDNA 双链双链cDNAcDNA接上接上dTdT或或dGdG尾尾 pBR322pBR322质粒质粒 pBR322pBR322质粒加上质粒加上dAdA或或dCdC第27页，本讲稿共36页第十节基因工程药物制造第十节基因工程药物制造第
30、十节基因工程药物制造第十节基因工程药物制造实例实例实例实例 干扰素（干扰素（干扰素（干扰素（interferoninterferoninterferoninterferon，IFNIFNIFNIFN）是人体细胞）是人体细胞）是人体细胞）是人体细胞分泌的一种活性蛋白质，具有广泛的抗病分泌的一种活性蛋白质，具有广泛的抗病分泌的一种活性蛋白质，具有广泛的抗病分泌的一种活性蛋白质，具有广泛的抗病毒抗肿瘤和免疫调节活性，是人体防御系毒抗肿瘤和免疫调节活性，是人体防御系毒抗肿瘤和免疫调节活性，是人体防御系毒抗肿瘤和免疫调节活性，是人体防御系统的重要组成部分。根据分子结构和抗原统的重要组成部分。根据分子结构
31、和抗原统的重要组成部分。根据分子结构和抗原统的重要组成部分。根据分子结构和抗原性的差异分为性的差异分为性的差异分为性的差异分为、等等等等4 4 4 4个类型。个类型。个类型。个类型。型干扰素在分为型干扰素在分为型干扰素在分为型干扰素在分为1b 2a 2b1b 2a 2b1b 2a 2b1b 2a 2b等亚型。等亚型。等亚型。等亚型。第28页，本讲稿共36页一、基因工程菌的组建诱生的白细胞诱生的白细胞诱生的白细胞诱生的白细胞 提取全提取全提取全提取全RNA RNA RNA RNA 通过寡通过寡通过寡通过寡dT-dT-dT-dT-纤维素柱纤维素柱纤维素柱纤维素柱 蔗糖密度梯度蔗糖密度梯度蔗糖密度梯
32、度蔗糖密度梯度 获得寡获得寡获得寡获得寡A A A A的的的的mRNA mRNA mRNA mRNA 离心提取离心提取离心提取离心提取12s12s12s12s 的的的的 mRNAmRNAmRNAmRNA 逆转录成逆转录成逆转录成逆转录成cDNA cDNA cDNA cDNA 双链双链双链双链cDNAcDNAcDNAcDNA接上接上接上接上dTdTdTdT或或或或dGdGdGdG尾尾尾尾 pBR322pBR322pBR322pBR322质粒质粒质粒质粒 pBR322pBR322pBR322pBR322质粒加上质粒加上质粒加上质粒加上dAdAdAdA或或或或dCdCdCdC第29页，本讲稿共36页
33、 退火获的杂交质粒退火获的杂交质粒退火获的杂交质粒退火获的杂交质粒退火获的杂交质粒退火获的杂交质粒 转化大肠杆菌转化大肠杆菌转化大肠杆菌转化大肠杆菌转化大肠杆菌转化大肠杆菌 扩增杂交质粒扩增杂交质粒扩增杂交质粒扩增杂交质粒扩增杂交质粒扩增杂交质粒 筛选抗青霉素但对氨苄筛选抗青霉素但对氨苄筛选抗青霉素但对氨苄筛选抗青霉素但对氨苄筛选抗青霉素但对氨苄筛选抗青霉素但对氨苄 用杂交翻译法挑选用杂交翻译法挑选用杂交翻译法挑选用杂交翻译法挑选用杂交翻译法挑选用杂交翻译法挑选 青霉素敏感细菌克隆青霉素敏感细菌克隆青霉素敏感细菌克隆青霉素敏感细菌克隆青霉素敏感细菌克隆青霉素敏感细菌克隆 含干扰素含干扰素含干扰
34、素含干扰素含干扰素含干扰素cDNAcDNAcDNA克隆克隆克隆克隆克隆克隆 将干扰素将干扰素将干扰素将干扰素将干扰素将干扰素cDNAcDNAcDNA克隆入表达载体克隆入表达载体克隆入表达载体克隆入表达载体克隆入表达载体克隆入表达载体 在大肠杆菌在大肠杆菌在大肠杆菌在大肠杆菌在大肠杆菌在大肠杆菌 中进行高效表达中进行高效表达中进行高效表达中进行高效表达中进行高效表达中进行高效表达第30页，本讲稿共36页二、基因工程干扰素的制备二、基因工程干扰素的制备二、基因工程干扰素的制备二、基因工程干扰素的制备启开种子启开种子启开种子启开种子启开种子启开种子 制备种子液制备种子液制备种子液制备种子液制备种子液
35、制备种子液 发酵培养发酵培养发酵培养发酵培养发酵培养发酵培养 粗提粗提粗提粗提粗提粗提精提精提精提精提精提精提 半成品制备半成品制备半成品制备半成品制备半成品制备半成品制备 半成品检定半成品检定半成品检定半成品检定半成品检定半成品检定 分装分装分装分装分装分装冻干冻干冻干冻干冻干冻干 成品检定成品检定成品检定成品检定成品检定成品检定 成品包装成品包装成品包装成品包装成品包装成品包装第31页，本讲稿共36页2b2b2b2b干扰素生产过程干扰素生产过程干扰素生产过程干扰素生产过程1.1.1.1.发酵发酵发酵发酵 工程菌：工程菌：工程菌：工程菌：SW-IFN-2b/E.SW-IFN-2b/E.SW-
36、IFN-2b/E.SW-IFN-2b/E.colicoli DH5 DH5 DH5 DH5，质，质，质，质粒用启动子，含氨苄青霉素抗性基因。培粒用启动子，含氨苄青霉素抗性基因。培粒用启动子，含氨苄青霉素抗性基因。培粒用启动子，含氨苄青霉素抗性基因。培养基含养基含养基含养基含1%1%1%1%蛋白冻蛋白冻蛋白冻蛋白冻0.5%0.5%0.5%0.5%酵母提取物酵母提取物酵母提取物酵母提取物0.5%NACl0.5%NACl0.5%NACl0.5%NACl。摇床培养摇床培养摇床培养摇床培养30 C30 C30 C30 C，10h10h10h10h，发酵种子。，发酵种子。，发酵种子。，发酵种子。15L15
37、L15L15L发酵发酵发酵发酵罐培养，罐培养，罐培养，罐培养，30 C30 C30 C30 C，8h8h8h8h。然后。然后。然后。然后42 C42 C42 C42 C，3h3h3h3h。离。离。离。离心去上清。心去上清。心去上清。心去上清。ooo第32页，本讲稿共36页 2.2.2.2.产品的提取与纯化产品的提取与纯化产品的提取与纯化产品的提取与纯化 湿菌超声破碎，离心，上清超滤浓湿菌超声破碎，离心，上清超滤浓湿菌超声破碎，离心，上清超滤浓湿菌超声破碎，离心，上清超滤浓 缩，缩，缩，缩，Sephadex G50 Sephadex G50 Sephadex G50 Sephadex G50 分
38、离。分离。分离。分离。经经经经SDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGE检查。检查。检查。检查。在经在经在经在经DE-52DE-52DE-52DE-52柱纯化柱纯化柱纯化柱纯化。第33页，本讲稿共36页三、三、三、三、质量控制标和要求质量控制标和要求质量控制标和要求质量控制标和要求半成品检定半成品检定半成品检定半成品检定干扰素效价测定干扰素效价测定干扰素效价测定干扰素效价测定蛋白质含量测定蛋白质含量测定蛋白质含量测定蛋白质含量测定比活性比活性比活性比活性纯度测定纯度测定纯度测定纯度测定相对分子量测定相对分子量测定相对分子量测定相对分子量测定第34页，本讲稿共36页残余外源性残余外源性DNA含量测定含量测定残余血清残余血清igG含量测定含量测定残余抗生素活性测定残余抗生素活性测定紫外光谱扫描紫外光谱扫描肽图测定肽图测定等电点测定等电点测定除菌半成品干扰素效价测定、无菌试验、除菌半成品干扰素效价测定、无菌试验、热原试验。热原试验。第35页，本讲稿共36页成品检定成品检定成品检定成品检定物理性状物理性状鉴别试验鉴别试验水分测定水分测定无菌试验无菌试验热原试验热原试验干扰素效价测定干扰素效价测定安全试验安全试验第36页，本讲稿共36页