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1、酶联免疫吸附实验（酶联免疫吸附实验（ELISA）n n1.1.ELISAELISA的原理的原理的原理的原理ELISAELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原的基础是抗原或抗体的固相化及抗原的基础是抗原或抗体的固相化及抗原的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免
2、疫学活性，又保留酶的活性。既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。n n在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液
3、体方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。中的其他物质分开。中的其他物质分开。中的其他物质分开。n n再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，物质的量呈一定的
4、比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很接地放大了免疫反应的结果，使
5、测定方法达到很接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。高的敏感度。高的敏感度。高的敏感度。n n间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗体）以检测与标记的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗体）以检测与标记的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗体）以检测与标记的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗体）以检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法（见图）。固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法（见图）。固相抗原结合的受检抗
6、体，故称为间接法（见图）。固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法（见图）。n n操作步骤如下：操作步骤如下：操作步骤如下：操作步骤如下：1 1）将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原。）将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原。）将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原。）将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。洗涤除去未结合的抗原及杂质。洗涤除去未结合的抗原及杂质。洗涤除去未结合的抗原及杂质。2 2）加稀释的受检血清，保温反应。血清中的特异）加稀释的受检血清，保温反应。血清中的特异）加稀释的受检血清，保温反应。血清中的特异）加稀释的受检血清，保温反应。血清中的特
7、异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体，血清经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体，血清经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体，血清经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体，血清中的其他成份在洗涤过程中被洗去。中的其他成份在洗涤过程中被洗去。中的其他成份在洗涤过程中被洗去。中的其他成份在洗涤过程中被洗去。n n3 3）加酶标抗抗体。可用酶标抗人）加酶标抗抗体。可用酶标抗人）加酶标抗抗体。可用酶标抗人）加酶标抗抗体。可用酶标抗人I
8、gIg以检测总抗体，以检测总抗体，以检测总抗体，以检测总抗体，但一般多用酶标抗人但一般多用酶标抗人但一般多用酶标抗人但一般多用酶标抗人IgGIgG检测检测检测检测IgGIgG抗体。固相免疫抗体。固相免疫抗体。固相免疫抗体。固相免疫复合物中的抗体与酶标抗体抗体结合，从而间接复合物中的抗体与酶标抗体抗体结合，从而间接复合物中的抗体与酶标抗体抗体结合，从而间接复合物中的抗体与酶标抗体抗体结合，从而间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量与标本地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量与标本地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量与标本地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量与标本中受检抗体的量正相关。中受检抗体的
9、量正相关。中受检抗体的量正相关。中受检抗体的量正相关。4 4）加底物显色）加底物显色）加底物显色）加底物显色n n本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。利用同一酶标抗抗体建立检
10、测相应抗体的方法。n n间接法成功的关键在于抗原的纯度。虽然有时用间接法成功的关键在于抗原的纯度。虽然有时用间接法成功的关键在于抗原的纯度。虽然有时用间接法成功的关键在于抗原的纯度。虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结果，但应尽粗提抗原包被也能取得实际有效的结果，但应尽粗提抗原包被也能取得实际有效的结果，但应尽粗提抗原包被也能取得实际有效的结果，但应尽可能予以纯化，以提高试验的特异性。特别应注可能予以纯化，以提高试验的特异性。特别应注可能予以纯化，以提高试验的特异性。特别应注可能予以纯化，以提高试验的特异性。特别应注意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质，例意除去能与一般健康人血清发生反
11、应的杂质，例意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质，例意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质，例如以如以如以如以E.ColiE.Coli为工程酶的重组抗原，如其中含有为工程酶的重组抗原，如其中含有为工程酶的重组抗原，如其中含有为工程酶的重组抗原，如其中含有E.ColiE.Coli成份，很可能与受过成份，很可能与受过成份，很可能与受过成份，很可能与受过E.ColiE.Coli感染者血甭中的感染者血甭中的感染者血甭中的感染者血甭中的抗抗抗抗E.ColiE.Coli抗体发生反应。抗体发生反应。抗体发生反应。抗体发生反应。n n抗原中也不能含有与酶标抗人抗原中也不能含有与酶标抗人抗原中也不能含有与酶标
12、抗人抗原中也不能含有与酶标抗人IgIg反应的物质，例反应的物质，例反应的物质，例反应的物质，例如来自人血浆或人体组织的抗原，如不将其中的如来自人血浆或人体组织的抗原，如不将其中的如来自人血浆或人体组织的抗原，如不将其中的如来自人血浆或人体组织的抗原，如不将其中的IgIg去除，试验中也发生假阳性反应。另外如抗原去除，试验中也发生假阳性反应。另外如抗原去除，试验中也发生假阳性反应。另外如抗原去除，试验中也发生假阳性反应。另外如抗原中含有无关蛋白，也会因竟争吸附而影响包被效中含有无关蛋白，也会因竟争吸附而影响包被效中含有无关蛋白，也会因竟争吸附而影响包被效中含有无关蛋白，也会因竟争吸附而影响包被效果
13、。果。果。果。ELISA的试剂的试剂n n在临床检验中一般采用商品试剂盒进行测定。在临床检验中一般采用商品试剂盒进行测定。在临床检验中一般采用商品试剂盒进行测定。在临床检验中一般采用商品试剂盒进行测定。n nELISAELISA中有三个必要的试剂：中有三个必要的试剂：中有三个必要的试剂：中有三个必要的试剂：n n免疫吸附剂、结合物免疫吸附剂、结合物免疫吸附剂、结合物免疫吸附剂、结合物和和和和酶的底物酶的底物酶的底物酶的底物。n n完整的完整的完整的完整的ELISAELISA试剂盒包含以下各组分：试剂盒包含以下各组分：试剂盒包含以下各组分：试剂盒包含以下各组分：（1 1）已包被抗原或抗体的固相载
14、体（免疫吸附剂）；）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；（2 2）酶标记的抗原或抗体（结合物）；）酶标记的抗原或抗体（结合物）；）酶标记的抗原或抗体（结合物）；）酶标记的抗原或抗体（结合物）；（3 3）酶的底物；）酶的底物；）酶的底物；）酶的底物；（4 4）阴性对照品和阳性对照品（定性测定中），）阴性对照品和阳性对照品（定性测定中），）阴性对照品和阳性对照品（定性测定中），）阴性对照品和阳性对照品（定性测定中），参考标准参考标准参考标准参考标准品和控制血清（定量测定中）；品和控制血清（定量测定中）；品
15、和控制血清（定量测定中）；品和控制血清（定量测定中）；（5 5）结合物及标本的稀释液；）结合物及标本的稀释液；）结合物及标本的稀释液；）结合物及标本的稀释液；（6 6）洗涤液；）洗涤液；）洗涤液；）洗涤液；（7 7）酶反应终止液。）酶反应终止液。）酶反应终止液。）酶反应终止液。n n2.12.1免疫吸附剂免疫吸附剂免疫吸附剂免疫吸附剂已包被抗原或抗体的固相载体在低温（已包被抗原或抗体的固相载体在低温（已包被抗原或抗体的固相载体在低温（已包被抗原或抗体的固相载体在低温（2828）干）干）干）干燥的条件下一般可保存燥的条件下一般可保存燥的条件下一般可保存燥的条件下一般可保存6 6个月。有些不完整的
16、试盒，个月。有些不完整的试盒，个月。有些不完整的试盒，个月。有些不完整的试盒，仅供应包被用抗原或抗体，检测人员需自行包被。仅供应包被用抗原或抗体，检测人员需自行包被。仅供应包被用抗原或抗体，检测人员需自行包被。仅供应包被用抗原或抗体，检测人员需自行包被。以下简述固相载体和包被过程以下简述固相载体和包被过程以下简述固相载体和包被过程以下简述固相载体和包被过程:n n2.1.12.1.1固相载体固相载体固相载体固相载体固相载体在固相载体在固相载体在固相载体在ELISAELISA测定过程中作为吸附剂和测定过程中作为吸附剂和测定过程中作为吸附剂和测定过程中作为吸附剂和容器，不参与化学反应。可作容器，不
17、参与化学反应。可作容器，不参与化学反应。可作容器，不参与化学反应。可作ELISAELISA中载体的材中载体的材中载体的材中载体的材料很多，最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有较料很多，最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有较料很多，最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有较料很多，最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性，加之它的价格其上后仍保留原来的免疫学活性，加之它的价格其上后仍保留原来的免疫学活性，加之它的价格其上后仍
18、保留原来的免疫学活性，加之它的价格低廉，所以被普遍采用。聚苯乙烯为塑料，可制低廉，所以被普遍采用。聚苯乙烯为塑料，可制低廉，所以被普遍采用。聚苯乙烯为塑料，可制低廉，所以被普遍采用。聚苯乙烯为塑料，可制成各种形式。成各种形式。成各种形式。成各种形式。n nELISAELISA载体的形状主要有三种：载体的形状主要有三种：载体的形状主要有三种：载体的形状主要有三种：微量滴定板微量滴定板微量滴定板微量滴定板、小小小小珠珠珠珠和和和和小试管小试管小试管小试管。以微量滴定板最为常用，专用于。以微量滴定板最为常用，专用于。以微量滴定板最为常用，专用于。以微量滴定板最为常用，专用于EILSAEILSA的产品
19、称为的产品称为的产品称为的产品称为ELISAELISA板，国际上标准的微量板，国际上标准的微量板，国际上标准的微量板，国际上标准的微量滴定板为滴定板为滴定板为滴定板为812812的的的的9696孔式。为便于作少量标本的检孔式。为便于作少量标本的检孔式。为便于作少量标本的检孔式。为便于作少量标本的检测，有制成测，有制成测，有制成测，有制成8 8联孔条或联孔条或联孔条或联孔条或1212联孔条的，放入座架后，联孔条的，放入座架后，联孔条的，放入座架后，联孔条的，放入座架后，大小与标准大小与标准大小与标准大小与标准ELISAELISA板相同。板相同。板相同。板相同。n nELISAELISA板的特点是
20、可以同时进行大量标本的检测，板的特点是可以同时进行大量标本的检测，板的特点是可以同时进行大量标本的检测，板的特点是可以同时进行大量标本的检测，并可在特制的比色计上迅速读出结果。并可在特制的比色计上迅速读出结果。并可在特制的比色计上迅速读出结果。并可在特制的比色计上迅速读出结果。n n现在已有多种自动化仪器用于微量滴定板型的现在已有多种自动化仪器用于微量滴定板型的现在已有多种自动化仪器用于微量滴定板型的现在已有多种自动化仪器用于微量滴定板型的ELISAELISA检测，包括加样、洗涤、保温、比色等步检测，包括加样、洗涤、保温、比色等步检测，包括加样、洗涤、保温、比色等步检测，包括加样、洗涤、保温、
21、比色等步骤，对操作的标准化极为有利。聚苯乙烯经射线骤，对操作的标准化极为有利。聚苯乙烯经射线骤，对操作的标准化极为有利。聚苯乙烯经射线骤，对操作的标准化极为有利。聚苯乙烯经射线照射后，其吸附性能特别是对免疫球蛋白的吸附照射后，其吸附性能特别是对免疫球蛋白的吸附照射后，其吸附性能特别是对免疫球蛋白的吸附照射后，其吸附性能特别是对免疫球蛋白的吸附性能增加，应用于双抗体夹心法可使固相上抗体性能增加，应用于双抗体夹心法可使固相上抗体性能增加，应用于双抗体夹心法可使固相上抗体性能增加，应用于双抗体夹心法可使固相上抗体量增多，但用于间接法测抗体时空白值较大。量增多，但用于间接法测抗体时空白值较大。量增多，
22、但用于间接法测抗体时空白值较大。量增多，但用于间接法测抗体时空白值较大。n n良好的良好的良好的良好的ELISAELISA板应该是吸附性能好，空白值低，板应该是吸附性能好，空白值低，板应该是吸附性能好，空白值低，板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间、同孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间、同孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间、同孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间、同一板各孔之间性能相近。聚苯乙烯一板各孔之间性能相近。聚苯乙烯一板各孔之间性能相近。聚苯乙烯一板各孔之间性能相近。聚苯乙烯ELISAELISA板由于板由于板由于板由于原料的不同和制作工艺的差别
23、，各种产品的质量原料的不同和制作工艺的差别，各种产品的质量原料的不同和制作工艺的差别，各种产品的质量原料的不同和制作工艺的差别，各种产品的质量差异很大，因此，每一批号的差异很大，因此，每一批号的差异很大，因此，每一批号的差异很大，因此，每一批号的ELISAELISA板在使用前板在使用前板在使用前板在使用前须事先检查其性能。须事先检查其性能。须事先检查其性能。须事先检查其性能。n n常用的检查方法为：以一定浓度的人常用的检查方法为：以一定浓度的人常用的检查方法为：以一定浓度的人常用的检查方法为：以一定浓度的人IgGIgG（一般为（一般为（一般为（一般为10ng/ml10ng/ml）包被）包被）包
24、被）包被ELISAELISA板各孔，洗涤后每板各孔，洗涤后每板各孔，洗涤后每板各孔，洗涤后每孔内加入适当稀释度的酶标抗人孔内加入适当稀释度的酶标抗人孔内加入适当稀释度的酶标抗人孔内加入适当稀释度的酶标抗人IgGIgG抗体，保温后抗体，保温后抗体，保温后抗体，保温后洗涤，加底物显色，终止酶反应后，分洗涤，加底物显色，终止酶反应后，分洗涤，加底物显色，终止酶反应后，分洗涤，加底物显色，终止酶反应后，分别测每孔溶液的吸光度。控制反应条件，使各孔别测每孔溶液的吸光度。控制反应条件，使各孔别测每孔溶液的吸光度。控制反应条件，使各孔别测每孔溶液的吸光度。控制反应条件，使各孔读数在吸光度读数在吸光度读数在吸
25、光度读数在吸光度0.80.8左右。计算全部读数的左右。计算全部读数的左右。计算全部读数的左右。计算全部读数的平均值。所有单个读数与全部读数的均数之差，平均值。所有单个读数与全部读数的均数之差，平均值。所有单个读数与全部读数的均数之差，平均值。所有单个读数与全部读数的均数之差，应小于应小于应小于应小于10%10%。n n为比较不同固相在某一为比较不同固相在某一为比较不同固相在某一为比较不同固相在某一ELISAELISA测定中的优劣，可测定中的优劣，可测定中的优劣，可测定中的优劣，可应用如下的试验：用其他免疫学测定方法选出一应用如下的试验：用其他免疫学测定方法选出一应用如下的试验：用其他免疫学测定
26、方法选出一应用如下的试验：用其他免疫学测定方法选出一个典型的阳性标本和阴性标本，将它们进行一系个典型的阳性标本和阴性标本，将它们进行一系个典型的阳性标本和阴性标本，将它们进行一系个典型的阳性标本和阴性标本，将它们进行一系列稀释后，在不同的固相载体上按预定的列稀释后，在不同的固相载体上按预定的列稀释后，在不同的固相载体上按预定的列稀释后，在不同的固相载体上按预定的ELISAELISA操作步骤进行测定，然后比较结果。在哪一种载操作步骤进行测定，然后比较结果。在哪一种载操作步骤进行测定，然后比较结果。在哪一种载操作步骤进行测定，然后比较结果。在哪一种载体上阳性结果与阴性结果差别最大，这种载体就体上阳
27、性结果与阴性结果差别最大，这种载体就体上阳性结果与阴性结果差别最大，这种载体就体上阳性结果与阴性结果差别最大，这种载体就是这一是这一是这一是这一ELISAELISA测定项目的最合适的固相载体。测定项目的最合适的固相载体。测定项目的最合适的固相载体。测定项目的最合适的固相载体。n n2.1.2 2.1.2 包被的方式包被的方式包被的方式包被的方式将抗原或抗体固定在过程称为包被将抗原或抗体固定在过程称为包被将抗原或抗体固定在过程称为包被将抗原或抗体固定在过程称为包被(coating)(coating)。换言之，包被即是抗原或抗体结合到固相载体表换言之，包被即是抗原或抗体结合到固相载体表换言之，包被
28、即是抗原或抗体结合到固相载体表换言之，包被即是抗原或抗体结合到固相载体表面的过程。蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物面的过程。蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物面的过程。蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物面的过程。蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用于。这基团与固相载体表面的疏水基团间的作用于。这基团与固相载体表面的疏水基团间的作用于。这基团与固相载体表面的疏水基团间的作用于。这种物理吸附是非特异性的，
29、受蛋白质的分子量、种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。等电点、浓度等的影响。等电点、浓度等的影响。等电点、浓度等的影响。n n载体对不同蛋白质的吸附能力是不相同的，大分载体对不同蛋白质的吸附能力是不相同的，大分载体对不同蛋白质的吸附能力是不相同的，大分载体对不同蛋白质的吸附能力是不相同的，大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表
30、面。团，故更易吸附到固相载体表面。团，故更易吸附到固相载体表面。团，故更易吸附到固相载体表面。IgGIgG对聚苯乙烯对聚苯乙烯对聚苯乙烯对聚苯乙烯等固相具有较强的吸附力，其联结多发生在等固相具有较强的吸附力，其联结多发生在等固相具有较强的吸附力，其联结多发生在等固相具有较强的吸附力，其联结多发生在FcFc段段段段上，抗体结合点暴露于外，因此抗体的包被一般上，抗体结合点暴露于外，因此抗体的包被一般上，抗体结合点暴露于外，因此抗体的包被一般上，抗体结合点暴露于外，因此抗体的包被一般均采用直接吸附法。均采用直接吸附法。均采用直接吸附法。均采用直接吸附法。n n脂类物质无法与固相载体结合，可将其在有机
31、溶脂类物质无法与固相载体结合，可将其在有机溶脂类物质无法与固相载体结合，可将其在有机溶脂类物质无法与固相载体结合，可将其在有机溶剂（例如乙醇）中溶解后加入剂（例如乙醇）中溶解后加入剂（例如乙醇）中溶解后加入剂（例如乙醇）中溶解后加入ELISAELISA板孔中，开板孔中，开板孔中，开板孔中，开盖置冰箱过夜或冷风吹干，待酒精挥发后，让脂盖置冰箱过夜或冷风吹干，待酒精挥发后，让脂盖置冰箱过夜或冷风吹干，待酒精挥发后，让脂盖置冰箱过夜或冷风吹干，待酒精挥发后，让脂质自然干固在固相表面。抗心磷脂抗体的质自然干固在固相表面。抗心磷脂抗体的质自然干固在固相表面。抗心磷脂抗体的质自然干固在固相表面。抗心磷脂抗
32、体的ELISAELISA试剂一般采用这种包被方式。试剂一般采用这种包被方式。试剂一般采用这种包被方式。试剂一般采用这种包被方式。n n2.1.3 2.1.3 包被用抗原包被用抗原包被用抗原包被用抗原 用于包被固相载体的抗原按其来源不同可分用于包被固相载体的抗原按其来源不同可分用于包被固相载体的抗原按其来源不同可分用于包被固相载体的抗原按其来源不同可分为天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。为天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。为天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。为天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。天然抗原可取自动物组织、微生物培养物等，须天然抗原可取自动物组织、微生物培养物等
33、，须天然抗原可取自动物组织、微生物培养物等，须天然抗原可取自动物组织、微生物培养物等，须经提取纯化才能作包被用。经提取纯化才能作包被用。经提取纯化才能作包被用。经提取纯化才能作包被用。n n重组抗原重组抗原重组抗原重组抗原是抗原基因在质粒体中表达的蛋白质抗原，多以是抗原基因在质粒体中表达的蛋白质抗原，多以是抗原基因在质粒体中表达的蛋白质抗原，多以是抗原基因在质粒体中表达的蛋白质抗原，多以大肠杆菌或酵母菌为质粒体。大肠杆菌或酵母菌为质粒体。大肠杆菌或酵母菌为质粒体。大肠杆菌或酵母菌为质粒体。n n重组抗原的优点是除工程菌成份外，其他杂质少，重组抗原的优点是除工程菌成份外，其他杂质少，重组抗原的优
34、点是除工程菌成份外，其他杂质少，重组抗原的优点是除工程菌成份外，其他杂质少，而且无传染性，但纯化技术难度较大。而且无传染性，但纯化技术难度较大。而且无传染性，但纯化技术难度较大。而且无传染性，但纯化技术难度较大。n n重组抗原的另一特点是能用基因工程制备某些无重组抗原的另一特点是能用基因工程制备某些无重组抗原的另一特点是能用基因工程制备某些无重组抗原的另一特点是能用基因工程制备某些无法从天然材料中分离的抗原物质。法从天然材料中分离的抗原物质。法从天然材料中分离的抗原物质。法从天然材料中分离的抗原物质。n n合成多肽抗原合成多肽抗原合成多肽抗原合成多肽抗原 合成多肽抗原是根据蛋白质抗原分子的某一
35、抗原合成多肽抗原是根据蛋白质抗原分子的某一抗原合成多肽抗原是根据蛋白质抗原分子的某一抗原合成多肽抗原是根据蛋白质抗原分子的某一抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。多肽决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。多肽决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。多肽决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。多肽抗原一般只含有一个抗原决定簇，纯度高，特异抗原一般只含有一个抗原决定簇，纯度高，特异抗原一般只含有一个抗原决定簇，纯度高，特异抗原一般只含有一个抗原决定簇，纯度高，特异性也高，但由于分子量太小，往往难于直接吸附性也高，但由于分子量太小，往往难于直接吸附性也高，但由于分子量太小，往往难于直接吸附性也高，
36、但由于分子量太小，往往难于直接吸附于固相上。多肽抗原的包被一般需先使其与无关于固相上。多肽抗原的包被一般需先使其与无关于固相上。多肽抗原的包被一般需先使其与无关于固相上。多肽抗原的包被一般需先使其与无关蛋白质如牛血清白蛋白质（蛋白质如牛血清白蛋白质（蛋白质如牛血清白蛋白质（蛋白质如牛血清白蛋白质（BSABSA）等偶联，借助）等偶联，借助）等偶联，借助）等偶联，借助于偶联物与固相载体的吸附，间接地结合到固相于偶联物与固相载体的吸附，间接地结合到固相于偶联物与固相载体的吸附，间接地结合到固相于偶联物与固相载体的吸附，间接地结合到固相载体表面。载体表面。载体表面。载体表面。n n应用多肽抗原的另一注
37、意点为他仅能检测与其相应用多肽抗原的另一注意点为他仅能检测与其相应用多肽抗原的另一注意点为他仅能检测与其相应用多肽抗原的另一注意点为他仅能检测与其相应的抗体。一种蛋白质抗原往往含有多个不同的应的抗体。一种蛋白质抗原往往含有多个不同的应的抗体。一种蛋白质抗原往往含有多个不同的应的抗体。一种蛋白质抗原往往含有多个不同的能引起抗体产生的决定簇，因此在受检血清中的能引起抗体产生的决定簇，因此在受检血清中的能引起抗体产生的决定簇，因此在受检血清中的能引起抗体产生的决定簇，因此在受检血清中的其他抗体就不能与该多肽抗原发生反应。另外，其他抗体就不能与该多肽抗原发生反应。另外，其他抗体就不能与该多肽抗原发生反
38、应。另外，其他抗体就不能与该多肽抗原发生反应。另外，某些微生物发生变异时往往发生抗原结构变化，某些微生物发生变异时往往发生抗原结构变化，某些微生物发生变异时往往发生抗原结构变化，某些微生物发生变异时往往发生抗原结构变化，在这种情况下，用个别多肽抗原进行包被可引起在这种情况下，用个别多肽抗原进行包被可引起在这种情况下，用个别多肽抗原进行包被可引起在这种情况下，用个别多肽抗原进行包被可引起其他抗体的漏检。其他抗体的漏检。其他抗体的漏检。其他抗体的漏检。n n2.1.4 2.1.4 包被用抗体包被用抗体包被用抗体包被用抗体包被固相载体的抗体应具有高亲和力和高特异性，包被固相载体的抗体应具有高亲和力和
39、高特异性，包被固相载体的抗体应具有高亲和力和高特异性，包被固相载体的抗体应具有高亲和力和高特异性，可取材于抗血清或含单克隆抗体的腹水或培养液。可取材于抗血清或含单克隆抗体的腹水或培养液。可取材于抗血清或含单克隆抗体的腹水或培养液。可取材于抗血清或含单克隆抗体的腹水或培养液。抗血清不能直接用于包被，应先提取抗血清不能直接用于包被，应先提取抗血清不能直接用于包被，应先提取抗血清不能直接用于包被，应先提取IgGIgG，通常采，通常采，通常采，通常采用硫酸铵盐析和用硫酸铵盐析和用硫酸铵盐析和用硫酸铵盐析和SephadexSephadex凝胶过滤法。一般经硫凝胶过滤法。一般经硫凝胶过滤法。一般经硫凝胶过
40、滤法。一般经硫酸铵盐析粗提的酸铵盐析粗提的酸铵盐析粗提的酸铵盐析粗提的IgGIgG已可用于包被，高度纯化的已可用于包被，高度纯化的已可用于包被，高度纯化的已可用于包被，高度纯化的IgGIgG性质不稳定。性质不稳定。性质不稳定。性质不稳定。n n2.1.5 2.1.5 包被的条件包被的条件包被的条件包被的条件包被用抗原或抗体的浓度，包被的温度和时间，包被用抗原或抗体的浓度，包被的温度和时间，包被用抗原或抗体的浓度，包被的温度和时间，包被用抗原或抗体的浓度，包被的温度和时间，包被液的包被液的包被液的包被液的pHpH等应根据试验的特点和材料的性质而等应根据试验的特点和材料的性质而等应根据试验的特点和
41、材料的性质而等应根据试验的特点和材料的性质而选定。抗体和蛋白质抗原一般采用选定。抗体和蛋白质抗原一般采用选定。抗体和蛋白质抗原一般采用选定。抗体和蛋白质抗原一般采用pH9.6pH9.6的碳酸盐的碳酸盐的碳酸盐的碳酸盐缓冲液作为稀释液，也有用缓冲液作为稀释液，也有用缓冲液作为稀释液，也有用缓冲液作为稀释液，也有用pH7.2pH7.2的磷酸盐缓冲液的磷酸盐缓冲液的磷酸盐缓冲液的磷酸盐缓冲液及及及及pH78pH78的的的的Tris-HCLTris-HCL缓冲液作为稀释液的。通常缓冲液作为稀释液的。通常缓冲液作为稀释液的。通常缓冲液作为稀释液的。通常在在在在ELISAELISA板孔中加入包被液后，在板
42、孔中加入包被液后，在板孔中加入包被液后，在板孔中加入包被液后，在4-84-8冰箱中放冰箱中放冰箱中放冰箱中放置过夜，置过夜，置过夜，置过夜，3737中保温中保温中保温中保温2 2小时被认为具有同等的包被小时被认为具有同等的包被小时被认为具有同等的包被小时被认为具有同等的包被效果。效果。效果。效果。n n包被的最适当浓度随载体和包被物的性质可有很包被的最适当浓度随载体和包被物的性质可有很包被的最适当浓度随载体和包被物的性质可有很包被的最适当浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化，每批材料需通过实验与酶结合物的浓大的变化，每批材料需通过实验与酶结合物的浓大的变化，每批材料需通过实验与酶结合物的浓大
43、的变化，每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。一般蛋白质的包被浓度为度协调选定。一般蛋白质的包被浓度为度协调选定。一般蛋白质的包被浓度为度协调选定。一般蛋白质的包被浓度为100ng/ml-100ng/ml-20ug/ml20ug/ml。n n2.1.6 2.1.6 封闭封闭封闭封闭封闭封闭封闭封闭(blocking)(blocking)是继包被之后用高浓度的无关是继包被之后用高浓度的无关是继包被之后用高浓度的无关是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。抗原或抗体包被时所蛋白质溶液再包被的过程。抗原或抗体包被时所蛋白质溶液再包被的过程。抗原或抗体包被时所蛋白质溶液再包被的过程。抗
44、原或抗体包被时所用的浓度较低，吸收后固相载体表面尚有未被占用的浓度较低，吸收后固相载体表面尚有未被占用的浓度较低，吸收后固相载体表面尚有未被占用的浓度较低，吸收后固相载体表面尚有未被占据的空隙，封闭就是让大量不相关的蛋白质充填据的空隙，封闭就是让大量不相关的蛋白质充填据的空隙，封闭就是让大量不相关的蛋白质充填据的空隙，封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥在这些空隙，从而排斥在这些空隙，从而排斥在这些空隙，从而排斥在ELISAELISA其后的步骤中干扰其后的步骤中干扰其后的步骤中干扰其后的步骤中干扰物质的再吸附。封闭的手续与包被相类似。最常物质的再吸附。封闭的手续与包被相类似。最常
45、物质的再吸附。封闭的手续与包被相类似。最常物质的再吸附。封闭的手续与包被相类似。最常用的封闭剂是用的封闭剂是用的封闭剂是用的封闭剂是0.05%-0.5%0.05%-0.5%的牛血清白蛋白，也有的牛血清白蛋白，也有的牛血清白蛋白，也有的牛血清白蛋白，也有用用用用10%10%的小牛血清或的小牛血清或的小牛血清或的小牛血清或1%1%明胶作为封闭剂的。明胶作为封闭剂的。明胶作为封闭剂的。明胶作为封闭剂的。n n脱脂奶粉也是一种良好的封闭剂，其最大的特点脱脂奶粉也是一种良好的封闭剂，其最大的特点脱脂奶粉也是一种良好的封闭剂，其最大的特点脱脂奶粉也是一种良好的封闭剂，其最大的特点是价廉，可以高浓度使用（是
46、价廉，可以高浓度使用（是价廉，可以高浓度使用（是价廉，可以高浓度使用（5%5%）。高质量的速溶）。高质量的速溶）。高质量的速溶）。高质量的速溶食用低脂奶粉即可直接当作封闭剂使用，但由于食用低脂奶粉即可直接当作封闭剂使用，但由于食用低脂奶粉即可直接当作封闭剂使用，但由于食用低脂奶粉即可直接当作封闭剂使用，但由于奶的成份复杂，而且封闭后的载体不易长期保存，奶的成份复杂，而且封闭后的载体不易长期保存，奶的成份复杂，而且封闭后的载体不易长期保存，奶的成份复杂，而且封闭后的载体不易长期保存，因此在试剂盒的制备中较少应用。封闭是否必要，因此在试剂盒的制备中较少应用。封闭是否必要，因此在试剂盒的制备中较少应
47、用。封闭是否必要，因此在试剂盒的制备中较少应用。封闭是否必要，取决于取决于取决于取决于ELISAELISA的模式及具体的实验条件。并非所的模式及具体的实验条件。并非所的模式及具体的实验条件。并非所的模式及具体的实验条件。并非所有的有的有的有的ELISAELISA固相均需封闭，封闭不当反而会使阴固相均需封闭，封闭不当反而会使阴固相均需封闭，封闭不当反而会使阴固相均需封闭，封闭不当反而会使阴性本底增高。性本底增高。性本底增高。性本底增高。n n2.2 2.2 结合物结合物结合物结合物结合物即酶标记的抗体（或抗原），是结合物即酶标记的抗体（或抗原），是结合物即酶标记的抗体（或抗原），是结合物即酶标记
48、的抗体（或抗原），是ELISAELISA中中中中最关键的试剂。良好的结合物应该是既保有酶的最关键的试剂。良好的结合物应该是既保有酶的最关键的试剂。良好的结合物应该是既保有酶的最关键的试剂。良好的结合物应该是既保有酶的催化活性，也保持了抗体（或抗原）的免疫活性。催化活性，也保持了抗体（或抗原）的免疫活性。催化活性，也保持了抗体（或抗原）的免疫活性。催化活性，也保持了抗体（或抗原）的免疫活性。结合物中酶与抗体（或抗原）之间有恰当的分子结合物中酶与抗体（或抗原）之间有恰当的分子结合物中酶与抗体（或抗原）之间有恰当的分子结合物中酶与抗体（或抗原）之间有恰当的分子比例，在结合试剂中应尽量不含有或少含有游
49、离比例，在结合试剂中应尽量不含有或少含有游离比例，在结合试剂中应尽量不含有或少含有游离比例，在结合试剂中应尽量不含有或少含有游离的（未结合的）酶或游离的抗体（或抗原）。此的（未结合的）酶或游离的抗体（或抗原）。此的（未结合的）酶或游离的抗体（或抗原）。此的（未结合的）酶或游离的抗体（或抗原）。此外，结合物尚要有良好的稳定性。外，结合物尚要有良好的稳定性。外，结合物尚要有良好的稳定性。外，结合物尚要有良好的稳定性。n n2.2.12.2.1酶酶酶酶用于用于用于用于ELISAELISA的酶应符合以下要求：纯度高，的酶应符合以下要求：纯度高，的酶应符合以下要求：纯度高，的酶应符合以下要求：纯度高，催
50、化反应的转化率高，专一性强，性质稳定，来催化反应的转化率高，专一性强，性质稳定，来催化反应的转化率高，专一性强，性质稳定，来催化反应的转化率高，专一性强，性质稳定，来源丰富，价格不贵，制备成酶结合物后仍继续保源丰富，价格不贵，制备成酶结合物后仍继续保源丰富，价格不贵，制备成酶结合物后仍继续保源丰富，价格不贵，制备成酶结合物后仍继续保留它的活性部分和催化能力。最好在受检标本中留它的活性部分和催化能力。最好在受检标本中留它的活性部分和催化能力。最好在受检标本中留它的活性部分和催化能力。最好在受检标本中不存在相同的酶。另外，它的相应底物易于制备不存在相同的酶。另外，它的相应底物易于制备不存在相同的酶