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1、酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验ELISA第1页，此课件共38页哦实验目的要求实验目的要求l掌握掌握ELISAELISA的基本原理的基本原理l掌握掌握ELISAELISA双抗体夹心法检测双抗体夹心法检测HBsAgHBsAg的原的原理、操作方法及结果判断理、操作方法及结果判断l熟悉表面抗原检测的临床意义熟悉表面抗原检测的临床意义第2页，此课件共38页哦（一）（一）ELISA的原理的原理ELISAELISA的基本原理的基本原理三种必要的试剂三种必要的试剂：l固相的抗原或抗体，即固相的抗原或抗体，即“免疫吸附剂免疫吸附剂”（immunosorbent）l酶标记的抗原或抗体，称为酶标记的抗原或抗体，称
2、为结合物结合物（conjugate）l酶作用的底物酶作用的底物第3页，此课件共38页哦l在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。与固相载体表面的抗原或抗体起反应。l用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。合物与液体中的其他物质分开。l再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。受检物质的量呈一定的比例。第4页，
3、此课件共38页哦l加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。l由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。的结果，使测定方法达到很高的敏感度。第5页，此课件共38页哦（二）方法类型及反应原理l双抗体夹心法双抗体夹心法l间接法间接法l竞争法竞争法l捕获法第6页，此课件共38页哦1 双抗体夹心法双抗体夹心法 是检测是检测抗原
4、抗原最常用的方法最常用的方法第7页，此课件共38页哦第8页，此课件共38页哦操作步骤操作步骤1 1）将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗）将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体，洗涤除去未结合的抗体及杂质。体，洗涤除去未结合的抗体及杂质。2 2）加受检标本，保温反应。标本中的抗原与固）加受检标本，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物，洗涤相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物，洗涤除去其他未结合物质。除去其他未结合物质。3 3）加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上）加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶的抗原与酶标抗体结合。彻底
5、洗涤未结合的酶标抗体，此时固相载体上带有的酶量与标本中标抗体，此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。受检抗原的量相关。4 4）加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色）加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。产物。第9页，此课件共38页哦应用应用l此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如如HBsAgHBsAg、HBeAgHBeAg、AFPAFP、hCGhCG等等 l不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。不能形成两位点夹心。第10页，此课件共38页哦2 间接法间接法 是检测是检测
6、抗体抗体常用的方法常用的方法 第11页，此课件共38页哦第12页，此课件共38页哦基本步骤基本步骤1 1）将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗）将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。2 2）加稀释的受检血清，保温反应。血清中的特）加稀释的受检血清，保温反应。血清中的特异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体，血清中的其他成份在洗涤过程中被洗去。体，血清中的其他成份在洗涤过程中被洗去。3 3）加酶标抗抗体。固相
7、免疫复合物中的抗体与）加酶标抗抗体。固相免疫复合物中的抗体与酶标抗体抗体结合，从而间接地标记上酶。洗酶标抗体抗体结合，从而间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量与标本中受检抗体的涤后，固相载体上的酶量与标本中受检抗体的量量正相关正相关。4 4）加底物显色。）加底物显色。第13页，此课件共38页哦应用应用l检测检测Ab的最常用的方法的最常用的方法l只要更换不同的固相只要更换不同的固相Ag，可以用一种酶标，可以用一种酶标二抗检测各种与二抗检测各种与Ag相应的相应的Ab。第14页，此课件共38页哦3 竞争法第15页，此课件共38页哦l其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中
8、抗体量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应。l方法相同第16页，此课件共38页哦ELISA的基本步骤的基本步骤l包被洗涤封闭洗涤加样加酶结合物加底物、显色剂终止液酶标仪检测第17页，此课件共38页哦包被包被l将抗原或抗体固定化的过程称为将抗原或抗体固定化的过程称为包被包被(coating)(coating)。换言之，包被即是抗原或抗体结。换言之，包被即是抗原或抗体结合到固相载体表面的过程。合到固相载体表面的过程。l抗体和蛋白质抗原一般采用抗体和蛋白质抗原一般采用pH9.6pH9.6的碳酸盐缓的碳酸盐缓冲液作为稀释液，也有用冲液作为稀释液，也有用pH7.2pH7.2的磷
9、酸盐缓冲的磷酸盐缓冲液及液及pH78pH78的的Tris-HCLTris-HCL缓冲液作为稀释液的。缓冲液作为稀释液的。通常在通常在ELISAELISA板孔中加入包被液后，在板孔中加入包被液后，在4-84-8冰冰箱中放置过夜，箱中放置过夜，3737中保温中保温2 2小时被认为具有小时被认为具有同等的包被效果。同等的包被效果。第18页，此课件共38页哦固相载体固相载体l固相载体在固相载体在ELISAELISA测定过程中作为吸附剂和容测定过程中作为吸附剂和容器，不参与化学反应。器，不参与化学反应。l可作可作ELISAELISA中载体的材料很多，最常用的是中载体的材料很多，最常用的是聚聚苯乙烯。苯乙
10、烯。l ELISAELISA载体的形状主要有三种：微量滴定板、载体的形状主要有三种：微量滴定板、小珠和小试管。以小珠和小试管。以微量滴定板微量滴定板最为常用，专用最为常用，专用于于EILSAEILSA的产品称为的产品称为ELISAELISA板，国际上标准的微板，国际上标准的微量滴定板为量滴定板为812812的的9696孔式。孔式。第19页，此课件共38页哦固相载体固相载体l 微颗粒微颗粒 带有蛋白质结合功能基团，结合容量大、反应速带有蛋白质结合功能基团，结合容量大、反应速度快度快l膜载体膜载体 硝酸纤维素膜（硝酸纤维素膜（NCNC）、玻璃纤维素膜、尼龙膜，）、玻璃纤维素膜、尼龙膜，非共价键结合
11、，但吸附能力强斑点非共价键结合，但吸附能力强斑点ELISAELISA第20页，此课件共38页哦洗涤洗涤l洗涤在洗涤在ELISAELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。定着实验的成败。ELSIAELSIA就是靠洗涤来达到分离游离就是靠洗涤来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以清除残留在的和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。聚应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质
12、的吸附是普遍性的，而在洗涤苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说在以说在ELISAELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术，应操作中，洗涤是最主要的关键技术，应引起操作者的高度重视，操作者应严格按要求洗涤，引起操作者的高度重视，操作者应严格按要求洗涤，不得马虎。不得马虎。第21页，此课件共38页哦封闭封闭 包被好的固相载体表面常留有少量未吸附位包被好的固相载体表面常留有少量未吸附位点，可非特异地吸附测定时加入的标本和酶标点，可非特异地吸附测定时加入的标本和酶标记物中的蛋白质，导致本底偏高。因
13、此需用记物中的蛋白质，导致本底偏高。因此需用1 15 5牛血清白蛋白或牛血清白蛋白或5 52020小牛血清小牛血清等等包被一次，消除上述干扰，此过程称为包被一次，消除上述干扰，此过程称为封闭封闭。一般说来，双抗体夹心法，只要酶标记物是一般说来，双抗体夹心法，只要酶标记物是高活性的，操作时洗涤彻底，不经封闭也可得高活性的，操作时洗涤彻底，不经封闭也可得到满意的结果。到满意的结果。第22页，此课件共38页哦加样加样 在在ELISAELISA中一般有中一般有3 3次加样步聚，即加标本，次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在LEISALE
14、ISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。意不可溅出，不可产生气泡。加标本一般用微量加样器，按规定的量加加标本一般用微量加样器，按规定的量加入板孔中。入板孔中。第23页，此课件共38页哦加酶结合物加酶结合物l结合物即酶标记的抗体（或抗原），是结合物即酶标记的抗体（或抗原），是ELISAELISA中最关键的试剂。中最关键的试剂。l ELISAELISA的酶应符合以下要求：的酶应符合以下要求：纯度高，催化反应的转化率高，专一性强，性纯度高，催化反应的转化率高，专一性强，性质稳定，来源丰富，价格不贵，制备成酶结合质稳定，来源丰富，价格不贵，制
15、备成酶结合物后仍继续保留它的活性部分和催化能力。最物后仍继续保留它的活性部分和催化能力。最好在受检标本中不存在相同的酶。另外，它的好在受检标本中不存在相同的酶。另外，它的相应底物易于制备和保存，价格低廉，有色产相应底物易于制备和保存，价格低廉，有色产物易于测定等。物易于测定等。第24页，此课件共38页哦常用的酶和底物常用的酶和底物l1、辣根过氧化物酶、辣根过氧化物酶（horsradish peroxidase,HRP）l糖蛋白主酶糖蛋白主酶+亚铁血红素辅基亚铁血红素辅基（活性基团）（活性基团）l纯度纯度：RZ=OD403/OD275,3.1l酶活性酶活性：U：1min将将1mol底物转化为产物
16、所需的底物转化为产物所需的酶量。酶量。l反应式反应式：DH2+H2O2 D+2H2Ol底物底物：OPD,TMB,5-ASA,ABTS第25页，此课件共38页哦酶作用酶作用后显色后显色终止液终止液终止反终止反应显色应显色最大吸最大吸收峰收峰致癌致癌避光避光OPD橙黄色橙黄色H2SO4棕黄色棕黄色492nm有有需要需要TMB蓝色蓝色H2SO4黄色黄色450nm无无无需无需OPD和和TMB的比较的比较第26页，此课件共38页哦底物底物显色显色终止液终止液最大吸最大吸收峰收峰特点特点APp-NPP黄色黄色NaOH405nm-Gal4MUG荧光物荧光物4MU/均相酶均相酶免疫测免疫测定定2、碱性磷酸酶和
17、、碱性磷酸酶和半乳糖苷酶的比较半乳糖苷酶的比较第27页，此课件共38页哦显色显色l显色是显色是ELISAELISA中的最后一步温育反应，此时酶中的最后一步温育反应，此时酶催化无色的底物生成有色的产物。反应的温度催化无色的底物生成有色的产物。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。在一定时间内，和时间仍是影响显色的因素。在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。而呈色加强。l在定量测定中，加入底物后的反应温度和时间在定量测定中，加入底物后的反应温度和时间应按规定力求准确。定性测定的显色可在室温应按规定力求准确。定性测定的显色可在室温进行
18、，时间一般不需要严格控制，有时可根据进行，时间一般不需要严格控制，有时可根据阳性对照孔和阴性对照孔的显色情况适当缩短阳性对照孔和阴性对照孔的显色情况适当缩短或延长反应时间，及时判断。或延长反应时间，及时判断。第28页，此课件共38页哦酶反应终止液酶反应终止液l常用的常用的HRPHRP反应终止液为硫酸，其浓度按加量反应终止液为硫酸，其浓度按加量及比色液的最终体积而异，在板式及比色液的最终体积而异，在板式ELISAELISA中一中一般采用般采用2mol/L2mol/L。第29页，此课件共38页哦比色比色l比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体，然后将板正
19、确放入酶标比色仪的比色架中。体，然后将板正确放入酶标比色仪的比色架中。l酶标比色仪检测酶标比色仪检测 酶标比色仪简称酶标仪，通常指专用于测读酶标比色仪简称酶标仪，通常指专用于测读ELISAELISA结果吸光度的光度计。结果吸光度的光度计。第30页，此课件共38页哦结果判断结果判断l定性测定定性测定 对受检标本中是否含有待测抗原或抗体作对受检标本中是否含有待测抗原或抗体作出出“有有”或或“无无”的简单回答，分别用的简单回答，分别用“阳性阳性”、“阴性阴性”表示表示l定量测定定量测定 在定量测定中，每批测试均须用一系列不在定量测定中，每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准同
20、浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准曲线，根据标准曲线得到样品中待测抗原的量。曲线，根据标准曲线得到样品中待测抗原的量。第31页，此课件共38页哦预期结果l阳性：显色为黄色阳性：显色为黄色l阴性：无色阴性：无色1 2 3 4阴性阴性阴性阴性阳性阳性阳性阳性第32页，此课件共38页哦试剂盒的组成试剂盒的组成 完整的完整的ELISAELISA试剂盒包含以下各组分：试剂盒包含以下各组分：（1 1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）（2 2）酶标记的抗原或抗体（结合物）酶标记的抗原或抗体（结合物）（3 3）酶的底物；）酶的底物；（4 4）阴性对照品和阳性
21、对照品（定性测定中）阴性对照品和阳性对照品（定性测定中）参考标准品和控制血清（定量测定中）；参考标准品和控制血清（定量测定中）；（5 5）结合物及标本的稀释液；）结合物及标本的稀释液；（6 6）洗涤液；）洗涤液；（7 7）显色液）显色液 （8 8）酶反应终止液。）酶反应终止液。第33页，此课件共38页哦本次实验内容本次实验内容l乙肝表面抗原的检测乙肝表面抗原的检测l具体操作见说明书具体操作见说明书(一组一组7孔孔)第34页，此课件共38页哦乙肝相关知识乙肝相关知识 l慢性乙型肝炎是一种由乙型肝炎病毒（慢性乙型肝炎是一种由乙型肝炎病毒（HBVHBV）引起的慢性、传染性疾病，严重危害健康，影引起的
22、慢性、传染性疾病，严重危害健康，影响生活质量。响生活质量。l1.1.乙肝的流行病学乙肝的流行病学 全世界半数以上的人被感染过，全世界半数以上的人被感染过，5 5为慢性感为慢性感染，每年有染，每年有50005000万新感染，万新感染，100100万死亡。我国万死亡。我国有有9.89.8HBsAgHBsAg（），慢性达（），慢性达10001000万，万，6060人人群感染。群感染。第35页，此课件共38页哦l2.2.传播途径传播途径l传染源：传染源：HBVHBV携带者、乙肝患者血液、体液携带者、乙肝患者血液、体液（精液、阴道分泌物、唾液）（精液、阴道分泌物、唾液）l传播途径：血液、血制品、性、垂直
23、、日常密传播途径：血液、血制品、性、垂直、日常密切接触切接触l易感人群：母亲是易感人群：母亲是HBVHBV感染的婴儿、感染的婴儿、HBVHBV感染家感染家庭成员、吸毒者、性病病人、血透病人、部分庭成员、吸毒者、性病病人、血透病人、部分医护人员医护人员第36页，此课件共38页哦l4.4.乙肝病毒的形态结构、基因组的特点乙肝病毒的形态结构、基因组的特点lHBVHBV颗粒：小球形颗粒（无病毒核酸，无感染颗粒：小球形颗粒（无病毒核酸，无感染性）性）病毒颗粒包膜产生过剩病毒颗粒包膜产生过剩l 管形颗粒（小球颗粒连接而成）管形颗粒（小球颗粒连接而成）l DaneDane颗粒（具有感染性的完整颗粒）颗粒（具
24、有感染性的完整颗粒）l基因：已知基因：已知DNADNA病毒中颗粒最小的，带有部分病毒中颗粒最小的，带有部分单链区的双链单链区的双链DNADNA基因组高度压缩、重复利用，基因组高度压缩、重复利用，容易变异。容易变异。第37页，此课件共38页哦l5.5.乙肝的发病机理乙肝的发病机理lHBVHBV不引起直接肝细胞病变，病毒整合到肝细不引起直接肝细胞病变，病毒整合到肝细胞复制，表达肝细胞表面，免疫系统清除。如胞复制，表达肝细胞表面，免疫系统清除。如免疫力强，临床经过为急性肝炎；如免疫力低免疫力强，临床经过为急性肝炎；如免疫力低下，临床经过为慢性肝炎；如免疫耐受，则和下，临床经过为慢性肝炎；如免疫耐受，则和机体和平共处，为病毒携带者。机体和平共处，为病毒携带者。第38页，此课件共38页哦