《ELISA方法类型及原理.pptx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《ELISA方法类型及原理.pptx（16页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、抗原抗体反应 1.1.1可逆性 抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为：Ag+AbAgAb 抗体的亲和力（affinity），可以用平衡常数K表示：K=AgAbAgAb,AgAb的解离程度与K值有关。高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合，两者结合牢固，不易解离。解离后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性。第1页/共16页1.1.2特异性 抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之间。化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。第2页/共16页1.1.3最适比例 第3页/共16页1.1.4敏感性化学
2、比色法的敏感度为mg/ml水平;酶反应测定法的敏感度约为5-10g/ml;免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相似；标记的免疫敏感度可提高数千倍，达ng/ml水平;例如，HBsAg，其敏感度可达。第4页/共16页由于各种抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制备特异性的抗血清或单克隆抗体，利用此抗体作为试剂就可检测标本中相应的抗原，因此免疫测定的应用范围极广。免疫测定在临床检验中的应用第5页/共16页2、ELISA的类型 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂：（1）固相的抗原或抗体，即免疫吸附剂（immunosorbent）；（2）酶标记的抗原
3、或抗体，称为结合物（conjugate）；（3）酶反应的底物。可设计出各种不同类型的检测方法。第6页/共16页2.1双抗体夹心法测抗原此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。酶标抗体血清样品或参比品底物酶标仪测定OD值终止液特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体；标本中的抗原与固相载体上的抗体结合成固相抗原复合物；加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合，酶量与标本中受检物质的量成正相关；加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或
4、定量第7页/共16页双抗原夹心法测抗体 用特异性抗原进行包被和制备酶结合物。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗HBsAg的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。第8页/共16页2.3间接法测抗体传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。酶标抗体 样本稀释液血清样品或参比品 底物终止液将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原；加受检血清：其特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。加酶标抗抗体：与固相抗原抗体复合物中的 抗体结合，使该抗体问接地标记上酶
5、；固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。第9页/共16页例如：猪繁殖与呼吸综合征病毒例如：猪繁殖与呼吸综合征病毒ELISAELISA抗体检测试剂盒抗体检测试剂盒【组成组成】试剂盒由抗原包被的微孔板，酶标羊抗猪试剂盒由抗原包被的微孔板，酶标羊抗猪IgGIgG及其它试剂制成，及其它试剂制成，应用应用间接间接ELISAELISA原理原理检测猪血清中抗蓝耳病检测猪血清中抗蓝耳病N N蛋白的蛋白的抗体抗体。【用途用途】猪蓝耳病猪蓝耳病ELISAELISA诊断试剂盒用于检测猪血清中抗蓝耳病诊断试剂盒用于检测猪血清中抗蓝耳病N N蛋白的蛋白的抗体。抗体。评估猪场蓝耳病疫苗免疫状况。感染猪的血清学诊断。评估猪
6、场蓝耳病疫苗免疫状况。感染猪的血清学诊断。【原理原理】试剂盒是采用猪蓝耳病病毒试剂盒是采用猪蓝耳病病毒N N基因的基因工程表达产物包被检测基因的基因工程表达产物包被检测板。在试验中，加入稀释的对照血清和待检血清，经温育后，若样品板。在试验中，加入稀释的对照血清和待检血清，经温育后，若样品中含有猪蓝耳病中含有猪蓝耳病N N蛋白的特异性抗体，则将与检测板上抗原结合，经洗蛋白的特异性抗体，则将与检测板上抗原结合，经洗涤除去未结合的抗体和其他成分后；再加入酶标二抗，与检测板上抗涤除去未结合的抗体和其他成分后；再加入酶标二抗，与检测板上抗原抗体复合物发生特异性结合；再经洗涤除去未结合的酶结合物，在原抗体
7、复合物发生特异性结合；再经洗涤除去未结合的酶结合物，在孔中加孔中加TMBTMB底物液，与酶反应形成蓝色产物，加入底物液，与酶反应形成蓝色产物，加入HFHF溶液中止反应后，溶液中止反应后，用酶标仪用酶标仪630nm630nm波长测定各反应孔中的波长测定各反应孔中的ODOD值。值。第10页/共16页例如：猪繁殖与呼吸综合征病毒ELISA抗体检测试剂盒【试剂盒主要组成试剂盒主要组成】1包被抗原的检测板包被抗原的检测板2块块（96孔孔/板）板）2阴、阳性对照血清阴、阳性对照血清各各1管管（1ml/管）管）3抗猪抗猪IgG-HRP结合物结合物1瓶瓶（20ml/瓶）瓶）420倍浓缩洗涤液倍浓缩洗涤液1瓶瓶
8、（30ml/瓶）瓶）5底物底物A液、液、B液液各各1瓶瓶（10ml/瓶）瓶）6终止液终止液1瓶瓶（10ml/瓶）瓶）7样品稀释液样品稀释液1瓶瓶（50ml/瓶）瓶）8血清稀释板血清稀释板2块块（96孔孔/板）板）第11页/共16页竞争法测抗体 当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。血清样品或参比品 酶标抗体 终止液 底物第12页/共16页2.5竞争法测抗原 小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上
9、的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。小分子激素、药物等的ELISA测定多用此法。第13页/共16页捕获包被法测抗体血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。因此，测定IgM抗体多用捕获法，先将所有血清IgM（包括特异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再测定特异性IgM。IgM的检测常用于传染病的诊断，尤其用于病毒性感染的早期诊断。血清样品或参比品 酶标抗体特异性抗原 底物 终止液抗人IgM抗体连接在固相载体形成固相抗人IgM加入特异性抗原与固相上的特异性IgM结合加入特异性酶标抗体，使之与结合在固相上的抗原反应结合。加底物显色：如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性IgM抗体存在（阳性反应）加入稀释的血清样品，使血清中IgM抗体被固相抗体捕获第14页/共16页ABS-ELISA法（亲和素-生物素系统-酶联免疫吸附试验）：固相支持物；：样品；：特异性IgG；：生物素化抗小鼠IgG（Biotin）；：辣根过氧化物酶HRP-酶标链亲和素（Avidin）；：DAB显色液；：显色；ABS：亲和素(avidin)生物素(biotin)系统(system）第15页/共16页 感谢您的观看！第16页/共16页