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1、精品名师归纳总结Elisa常见类型及试验标准操作方法与常见问题酶联免疫吸附试验 ELISA 是一种试验室常用的检测方法，广泛应用于测量溶液中的分析物抗体或抗原的浓度。与其他基于抗体的检测方法不同的是，酶 联免疫吸附试验或酶免疫测定 EIA 通过与固相支持物的结合和系列洗涤步骤， 实现特异性和非特异性相互作用的别离， 并可通过最终有色产物的形成， 定量分析原始样品中分析物的含量。ELISA试验通常以细胞培养上清液、血清、血浆以及组织裂解物等为样品。该 试验必备三种试剂：固相的抗原或抗体。酶标记的抗原或抗体。酶作用的底物。 依据样品的性质、检测的试验条件、试剂的来源，可设计出不同类型的ELISA
2、检测方法。该试验可快速分析大量平行样品，在基础争论和临床诊断实践中广泛使用。一、直接 ELISA原理：将抗原与固相载体连接， 洗涤除去未结合的抗原及杂质。 加酶标抗体进行孵育。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。完全洗涤未结合的酶标抗体。 此时固相上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。加底物反应。 直接法主要用于测定抗原。优点：操作流程简短，试验步骤少。无需使用二抗，防止了交叉反应。试验步骤少，操作不易出错。缺点：试验中的一抗需要直接用酶标记，成本相对较高。二、间接法 ELISA可编辑资料 - - - 欢迎下载精品名师归纳总结原理：将抗原与固相载体相连结， 形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原
3、及杂质。加入特异性一抗与固相抗原相结合，形成固相抗原抗体复合物。 经洗涤后， 加酶标二抗。固相免疫复合物中的抗体与酶标二抗结合，从而间接的标记上酶。 洗涤后，加底物显色。优点：酶标二抗可加强信号，提高灵敏度。灵敏性更大，同一酶标二抗可应用于多种不同的一抗。不直标一抗，可保留更多的免疫反应性。成本更低，使用标记抗体更少。缺点：交叉反应几率上升。三、双抗夹心法 ELISA原理：双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子，但不适用于小分子抗原。将特异性抗体捕获抗体与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤除去未结 合的抗体及杂质。 加入待检样品， 保温孵育。 样品中的特异性抗原与固相抗体结合，形成固相抗原
4、抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。加酶标抗体检测抗 体保温孵育。 固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。完全洗涤未结合的酶标抗体。加底物反应。双抗原夹心法测抗体的反应模式与测抗原相像， 用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。可编辑资料 - - - 欢迎下载精品名师归纳总结优点：高特异性， 使用的捕获抗体与检测抗体都是检测特异性的。适用于复杂样品，抗原不需要进行纯化即可用于检测。灵敏性更大，灵敏度更高，可接受直接 法也可接受间接法。缺点：检测物需要拥有两个以上不同的抗原表位或多个相同的重复表位。不适用于检测小分子物质。四、竞争法 ELISA原理：竞争法 ELISA 最为复杂，
5、通常用于检测小分子如半抗原、 激素、药物等。样品中待检游离抗原与固定于固相载体上的抗原一起竞争相同的有限量抗体，当样品中的游离抗原越多， 就可结合越多的抗体， 而固相抗原只能结合较少的抗体。反之亦然。经洗涤去除样品中的抗原与抗体的结合物， 只留下固相抗原与抗体的结合物。显示经运算可得样品中抗原的含量。 竞争法可依据试验设置直接法、 间接法或夹心法形式。可编辑资料 - - - 欢迎下载精品名师归纳总结常见问题：Elisa试验以灵敏度较高、特异性较好的特点在临床上得到了广泛的应用，但操作中的各个环节对试验的检测成效影响较大，如不留意，有可能导致显色不全、花板等结果。下面一步步分析 Elisa 试验
6、操作中可能影响结果因素。Step1:标本的选择与预备用于 ELISA 测定的临床标本最为常用的是血清浆，有时由于特定的检测目的，也用到唾液、脑脊液、 尿液、 粪便等标本。 目前临床上使用血清标本测定的标志物一般有传染性病原体的抗原和抗体、肿瘤标志物、激素、特种蛋白、细胞因子和治疗药物等。对用于激素和治疗药物测定的血清标本的收集，要留意收集时间甚或体位有可能会对测定结果产生影响。如可的松在早晨 4 6 点之间，会有一峰值显现：生长激素、促黄体激素LH 和促卵泡激素 FSH 均以阵发性方式释放， 因此， 在测定此类激素时， 有必要在亲热相连的时间间隔内实行数份血样本， 以其中间值为测定值。 又如当
7、从卧位变为站立位时，血清中肾素活性将显现明显增 高。再如治疗药物的检测， 应依据药代动力学选择服药后的最适时间抽血检测。用于传染性病原体的抗原和抗体、 肿瘤标志物和特种蛋白等的检测的血清标本的收集就没有时间和体位方面的影响，只是在处理和储存方面要考虑以下几个方面：(1) 要留意防止显现严肃溶血。血红蛋白中含有血红素基团，其有类似过氧化物的活性，因此，在以 HRP 为标记酶的 ELISA 测定中， 如血清标本中血红蛋白浓度较高，就其就很简洁在温育过程中吸附于固相，从而与后面加入的HRP 底物反应显色。(2) 样本的采集及血清别离中要留意尽量防止细菌污染，一就细菌的生长，其所分泌的一些酶可能会对抗
8、原抗体等蛋白产生分解作用;二就一些细菌的内源性酶如大肠杆菌的-半乳糖苷酶本身会对用相应酶作标记的测定方法产生非特异性干扰。(3) 血清标本如是以无菌操作别离，就可以在2 8下储存一周，如为有菌操作，就建议冰冻储存。样本的长时间储存，应在-70 以下。(4) 冰冻储存的血清标本须留意防止因停电等造成的反复冻融。标本的反复冻融所产生的机械剪切力将对标本中的蛋白等分子产生破坏作用，从而引起假阴性结果。 此外， 冻融标本的混匀亦应留意，不要进行猛烈振荡，反复颠倒混匀即可。(5) 标本在储存中如显现细菌污染所致的混浊或絮状物时，应离心沉淀后取上清检测。Step2:试剂的预备在临床试验室， 对试剂预备一般
9、不太留意，通常的做法是， 在试验时将试剂从冰箱中拿出来即用，而忽视了这种做法有可能影响后面温育时间不够的问题，其直接的后果是对一些弱阳性标本的检测显现假阴性。 因此在 ELISA 测定中试剂的预备最为关键的是，在试验开头前， 将试剂盒先从冰箱中拿出来，在室温下放置30-60 分钟，再进行测定，以使试剂盒在使用前与室温平稳。 这样做的目的， 主要是为了在后面的温育反应步骤中，能使反应微孔内的温度能较快的到达所要求的高度，以中意测定要求。可编辑资料 - - - 欢迎下载精品名师归纳总结Step3:加样1 标本为血清：最好将血液先自然存放1-2 小时后，再用 3000rmp离心 15 分钟 ;标本为
10、血浆：必需使用含抗凝剂的血液标本收集管，采血后必需马上颠倒采血管混合5-10 次， 放置一段时间后， 3000rpm离心 15 分钟 ;假设在几天内检测，可放在2-8 冰箱中，假设要贮存，就置于 -20 的低温冰箱内。2 加样后准时放入孵箱。3 加酶试剂后用吸水纸在酶标板外表轻拭吸干。4 假如接受 AT 或其他全自动加样，最好选择FAME 或其他后处理仪器加酶试剂。5 标本较多时，请分批操作。6 血清样本的加入几乎是唯独的要使用微量加样器加入样本的步骤。使用微量加样器加样必需留意的关键点是：加样不行太快， 要防止加在孔壁上部，不行溅出和产愤慨泡。加样太快，无法保证微量加样的精确性和均一性。加在
11、孔壁上部的非包被区，易导致非特异吸附。溅出会对邻近孔产生污染。显现气泡就反应液界面有差异。Step4:孵育1 温育是 ELISA 测定中影响测定成败最为关键的一个因素。 ELISA 作为一种固相免疫测定，抗原抗体的结合反应在固相上进行， 要使液相中的抗原或抗体与固相上的特异抗体或抗原完全结合， 必需在确定的温度条件下反应确定的时间。 温育所需时间与温度成反比， 即温度越高，就所需时间相对较短。 最为常用的温育温度有 37和室温，其次是 43 和 2 8。依据操作说明严格把握孵育时间。2 孵育时贴封片或加盖，防止标本或稀释液蒸发，吸附于孔壁。Step5 ：洗板保证洗液注满各孔，洗板针畅通，洗完板
12、后最好在吸水纸选择干净、无或少尘的吸水材料上轻轻拍干 ;反应板过多时，合理支配，或多用几台洗板机，防止等待时间过长。Step6:显色显色剂尽量在临用前配制，坚持不用过期显色剂，肉眼可见浅蓝色的 TMB 显色剂不用 ; 加样时保持显色剂不外流。Step7:终止在加终止液时应防止产愤慨泡，而导致假阳性结果。Step8:读板可编辑资料 - - - 欢迎下载精品名师归纳总结整个操作过程中保证酶标板不接触次氯酸测质量。;尽可能实现 ELISA检测标准自动化，有效提高检在实际操作中， 除了选择优良试剂外， 必需严格依据操作步骤进行操作，同时作好室内质控、室间质评，以严谨的工作作风检测每一份标本，才能保证检测质量。可编辑资料 - - - 欢迎下载