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1、关于基因芯片第1页，讲稿共85张，创作于星期日2主要内容主要内容n1。基因芯片的概念和原理。基因芯片的概念和原理n2。基因芯片的类型。基因芯片的类型n3。基因表达的数据分析。基因表达的数据分析n4。细胞学应用实例介绍。细胞学应用实例介绍第2页，讲稿共85张，创作于星期日31,基因芯片的概念和原理n基因芯片（gene chip），又称DNA微阵列（DNA microarray），n是由大量DNA或寡核苷酸探针密集排列所形成的探针阵列，其工作的基本原理是通过杂交检测信息,实质是核酸碱基的互补匹配。n把大量已知序列探针集成在同一个基片上，经过标记的若干靶核酸序列通过与芯片特定位置上的探针杂交。n利用
2、基因芯片杂交检测图像，可以对生物细胞或组织中大量的基因信息进行分析。n基因芯片能够在同一时间内分析大量的基因，实现生物基因信息的大规模检测。第3页，讲稿共85张，创作于星期日4Labeled TargetLabeled TargetHybridized ArrayHybridized ArrayDetectionDetectionReagentsReagentsDNA MicroarrayDNA Microarray基因芯片的原理基因芯片的原理第4页，讲稿共85张，创作于星期日5基因芯片的相关知识第5页，讲稿共85张，创作于星期日6应用原则n测基因表达水平的微阵列应用最为广泛是比较试验 n为了
3、提高实验的可靠性，对于同一样本，往往有两次或更多次的重复实验;由于 DNA 微阵列的费用较贵，不可能重复足够多的次数来满足实验数据分析的要求 n良好的模型(除比较因素外,其他尽量相同)，时间点的选择n适当的统计方法来分析数据 第6页，讲稿共85张，创作于星期日72,基因芯片的类型基因芯片的类型n制备方法：制备方法：1.cDNA arrays(Microspotting)cDNA芯片芯片2.Oligonucleotide arrays(Photolithographic synthesis,Ink-jet technology,etc.)寡核苷酸芯片寡核苷酸芯片n探针位置探针位置:基因表达芯片基
4、因表达芯片(gene expression microarray)启动子芯片启动子芯片(promoter microarray)CHIP(染色质免疫共沉淀染色质免疫共沉淀)on chip 外显子（外显子（exons microarray）基因组芯片（基因组芯片（Tiling microarray）第7页，讲稿共85张，创作于星期日8基因芯片的类型基因芯片的类型n用途：用途：转录因子、药物作用、免疫分子、细胞周期等肿瘤相关：Oncogene芯片、抑癌基因芯片microRNA芯片DNA甲基化芯片 第8页，讲稿共85张，创作于星期日9基因芯片的探针设计基因芯片的探针设计第9页，讲稿共85张，创作于星
5、期日10分子生物学的认识,2004ProteinhnRNADNAt r a n s c r i p t i o ntranslationMolecules with effector functiontRNArRNAreversetranscriptionmRNAs p l i c i n gribozymesmiRNAdicingpre-miRNAOther noncoding RNAs第10页，讲稿共85张，创作于星期日11基因组序列基因表达谱蛋白质谱mRNA编辑 表观遗传机制转录过程染色质的结构转录因子表达谱转录因子结合序列的差异DNA结合RNA可变剪切 Micro RNAs第11页，讲
6、稿共85张，创作于星期日12表观遗传学（epigenetics）n是指在基因组中除了DNA和RNA序列以外，还有许多调控基因的信息，它们虽然本身不改变基因的序列，但是可以通过基因修饰，而影响和调节遗传的基因的功能和特性。n表观遗传的的信息也被称为第二遗传密码，它是建立在我们熟知的经典遗传密码（3联密码）之外的遗传信息，高等生物的发育调控是通过对其二倍体基因组的选择性表达来实现的。n主要有:DNA甲基化、组蛋白修饰和染色质重塑、RNA剪辑 第12页，讲稿共85张，创作于星期日13Oligo(寡核苷核)芯片nOligo(寡核苷核)芯片 介绍n公司(美国Affymetrix)推动n主要特点是超高密度
7、n核苷酸长度较短(=60nt)第13页，讲稿共85张，创作于星期日14Affymetrix 光脱保护合成法光脱保护合成法 LampMaskChip第14页，讲稿共85张，创作于星期日15O O O O OLight(deprotection)HO HO O O OT T O O OT T C C OLight(deprotection)T T O O OC A T A TA G C T GT T C C GMaskMaskSubstrateSubstrateMaskMaskSubstrateSubstrateT T C C REPEATREPEATAffymetrix 光脱保护合成法光脱保护合
8、成法第15页，讲稿共85张，创作于星期日16Affymetrix 光脱保护合成法光脱保护合成法nEach probe 25 bp longn11-20 probes per genenPerfect Match(PM)as well as MisMatch(MM)probes第16页，讲稿共85张，创作于星期日17Affymetrix 基因表达芯片的探针设计基因表达芯片的探针设计53mRNA sequencePerfectMatchPerfectMatchMismatchMismatch第17页，讲稿共85张，创作于星期日18Affymetrix 基因芯片流程SpecimensBioinfor
9、maticsLabeled Targets0000第18页，讲稿共85张，创作于星期日19AAAAOligo(dT)-T7Total RNARtase/Pol IIdsDNAAAAA-T7TTTT-T7CTP-biotinT7 polTTTT-55Biotin-cRNAHybridizationSteptavidin-phycoerythrinScanningPMMM单色标记第19页，讲稿共85张，创作于星期日20PMMMProbe PairProbe Cell:-24m mm x 24m mm -3m mm/Pixel -64 PixelsAffymetrix探针设计第20页，讲稿共85张，
10、创作于星期日21cDNA Probes GenBank UniGene dbESTcDNA Arrays(10,000 Probes)Robotic PrintingcDNA 基因芯片基因芯片第21页，讲稿共85张，创作于星期日22第22页，讲稿共85张，创作于星期日23ControlTestRT&Labeled with Fluor DyescDNA MicroarraysscanningCy3Cy5BioinformaticscDNA 基因芯片样品标记基因芯片样品标记第23页，讲稿共85张，创作于星期日24cDNA 基因芯片样品标记基因芯片样品标记第24页，讲稿共85张，创作于星期日25c
11、DNA 基因芯片的荧光信号基因芯片的荧光信号第25页，讲稿共85张，创作于星期日26Oligonucleotide芯片与芯片与 cDNA 芯片的比较芯片的比较 Oligonucleotide ArrayscDNA ArraysHigh densityLower densityHigh specificityCross-hybridization cannot be determinedRequires small amount of samplesLarger amount of samples is requiredGene expression andMostly for Gene Exp
12、ression Genetic alteration/polymorphismHigh reagent costs Lower reagent costsHybridization of target from a single source Simultaneous hybridization of targets from two sourcesClones for signal validation have to be Clones available for signal validation obtained from other sourcesDifficult to manuf
13、acture arrays in-house Array manufacture is labor intensive and initial set-up is expensive High cost per array Low cost per arrayLower flexibilityHigh flexibility第26页，讲稿共85张，创作于星期日27 基因表达芯片基因表达芯片cDNA ArraysOligonucleotide ArraysGlas ArraysMembrane based Arrays第27页，讲稿共85张，创作于星期日28 图像分析1.网格Gridding:i
14、dentify spots(automatic,semiautomatic,manual)2.分割Segmentation:separate spots from background.Fixed circle(B),Adaptive circle C,Adaptive shape(D),Histogram3.强度提取Intensity extraction:mean or median of pixels in spot4.背景修正Background correction:local or global第28页，讲稿共85张，创作于星期日29质量控制质量控制nControl(内对照)nGe
15、ne specific:whether recognize unique sequences in these genes?(专业知识)nArray specific:normalization factor,genes present,linearity,control/spike performance(e.g.5/3 ratio,intensity)-RNA完整性nAcross arrays:linearity,correlation,background,normalization factors,noise -横向比较第29页，讲稿共85张，创作于星期日30基因芯片的其它类型基因芯片
16、的其它类型n研究的对象（探针的针对对象）研究的对象（探针的针对对象）n用途用途第30页，讲稿共85张，创作于星期日31启动子芯片简介n染色质免疫共沉淀（chromatin immunoprecipitation,ChIP）技术 n该技术的主要方法是：将细胞先用甲醛固定，使DNA和蛋白质交联，再用DNA结合蛋白（转录因子和核酸结合酶类）的特异性抗体将蛋白质和DNA一起沉淀下来，与蛋白质解离后的DNA经过PCR扩增，并用荧光标记后，与芯片上的核酸探针杂交，通过杂交信号的检测，判定该DNA结合蛋白与何种基因结合，由于DNA结合蛋白通常与基因的启动子区结合，也称为启动子区基因芯片。第31页，讲稿共85
17、张，创作于星期日32第32页，讲稿共85张，创作于星期日33第33页，讲稿共85张，创作于星期日34第34页，讲稿共85张，创作于星期日35Tiling microarray 简介第35页，讲稿共85张，创作于星期日36Unbiased寻找转录因子的位点(TFBS)第36页，讲稿共85张，创作于星期日37Miska et al.2005 current opinion in genetics microRNA基因芯片简介第37页，讲稿共85张，创作于星期日38第38页，讲稿共85张，创作于星期日39基因芯片需考虑的事项n组织或细胞的类型n基因表达的时间性及空间性n基因表达的方式、丰度第39页，
18、讲稿共85张，创作于星期日40基因表达的时间性及空间性第40页，讲稿共85张，创作于星期日41时间和空间特异性第41页，讲稿共85张，创作于星期日42第42页，讲稿共85张，创作于星期日43基因表达的方式n管家基因与奢侈基因n管家基因（housekeeping gene）-在一个生物个体的几乎所有细胞中持续表达的基因。组成性基因表达(constitutive gene expression)n奢侈基因（luxury gene）只在特定的细胞类型中表达的基因第43页，讲稿共85张，创作于星期日443,基因芯片的数据分析基因芯片的数据分析DataProcessingDataMiningInform
19、ationDataKnowledge第44页，讲稿共85张，创作于星期日45数据处理数据处理NormalizationBackground SubtractionExpression AlgorithmIntensity AlgorithmData Processing第45页，讲稿共85张，创作于星期日46基因表达数据分析过程基因表达数据分析过程强度算法强度算法(Intensity Algorithm)将图像转化为杂交信号值将图像转化为杂交信号值背景去除背景去除(Background Subtraction)去除非特异性的杂交信号去除非特异性的杂交信号(背背景信号景信号)探针的对应算法探针的
20、对应算法(Expression Algorithm)将探针的将探针的杂交信号值杂交信号值与各自所代表的基因相对应与各自所代表的基因相对应标准化标准化(Normalization)不同试验和不同样品间数据的归一不同试验和不同样品间数据的归一化化,使它们均衡可比使它们均衡可比第46页，讲稿共85张，创作于星期日47数据筛选数据筛选n探针筛选n表达水平筛选（信号强度值、多次试验标准差等）n背景差异筛选（选出与背景差异显著的探针）n表达差异筛选（选择与对照样本表达差异较大的基因）第47页，讲稿共85张，创作于星期日48探针筛选（以Affymetrix芯片为例）n1.探针名的后缀以“_at”识别基因的反
21、义链 而且，以“_at”标识的探针 表示仅识别唯一的基因.n2.探针名的后缀以“_a_at”表示识别同一基因的多个可变剪切.n3.探针名的后缀以“_s_at”表示识别不同基因的多个转录本.n4.探针名的后缀以“_x_at”可能包含一些交叉序列的基因可以去除可以去除“_s_at”和和“_x_at”的探针集的探针集第48页，讲稿共85张，创作于星期日49数据挖掘数据挖掘Data MiningGenesExperimentsNovel genesNovel functions of known genes Pathway elucidationsBiological Processes123456-
22、1.5-0.50.51.5123456-1.5-0.50.51.5123456-1.5-0.50.51.5123456-1.5-0.50.51.5第49页，讲稿共85张，创作于星期日50主成分分析Principal Component Analysis(PCA)分层聚类分析Hierarchical Cluster Analysis(HCA)Multidimensional Scaling(MDS)k-MeansClassification and Regression Tree(CART)自组织映射 Self-Organizing Maps(SOM)相关系数聚类Correlation Coef
23、ficient Clustering向量机Support Vector Machine(SVM)k最近邻法 k-Nearest Neighbors(KNN)Partial Least-Squares Regression(PLS)Back-Propagation Artificial Neural Network(BP-ANN)Genetic Algorithm(GA)数据挖掘数据挖掘的方法介绍的方法介绍第50页，讲稿共85张，创作于星期日51a,hierarchical clustering;b,Self-organizing maps(SOMs)d,principal component
24、analysis(PCA);e,nearest-neighborhood method第51页，讲稿共85张，创作于星期日52基因表达的散点图第52页，讲稿共85张，创作于星期日53Leukemiamelanomabreast cancercolon cancerScherf et al.Nature Genetics 24:236-244(2000)n cDNA microarrayn 9703 cDNA probes人类肿瘤的基因表达谱人类肿瘤的基因表达谱(PCA分析分析)第53页，讲稿共85张，创作于星期日54Research Projects分分层层聚聚类类分分析析第54页，讲稿共85
25、张，创作于星期日55Alizadeh et al.,Nature 403:503-11,2000第55页，讲稿共85张，创作于星期日56集成的数据分析工具集成的数据分析工具1第56页，讲稿共85张，创作于星期日57集成的数据分析工具集成的数据分析工具2第57页，讲稿共85张，创作于星期日58Expression Levels of RelatedGenes on the Array(Structure,Function,Pathway,etc.)Sequence Analysis(e.g.Functional Domains)Database Query(e.g.blast search)Bi
26、ochemical ActivityBiological ActivityLiterature Search集成的数据分析工具集成的数据分析工具3第58页，讲稿共85张，创作于星期日59Expression Levels of RelatedGenes on the Array(Structure,Function,Pathway,etc.)Sequence Analysis(e.g.Functional Domains)Database Query(e.g.blast search)Biochemical ActivityBiological ActivityLiterature Searc
27、h集成的数据分析工具集成的数据分析工具4第59页，讲稿共85张，创作于星期日60ProteomicsGenomicsAutomated Data AnalysisMulti-platform Data Integration and AnalysisActivities ofCellular ProcessesPredictive OutcomesState of the CellPhenotypes数据分析与预测数据分析与预测第60页，讲稿共85张，创作于星期日614,基因芯片的应用实例基因芯片的应用实例3.Extract metylationpattern and interpretres
28、ults第61页，讲稿共85张，创作于星期日62ExpressionGeneExperiment第62页，讲稿共85张，创作于星期日631)用基因表达芯片探索药物作用机理第63页，讲稿共85张，创作于星期日64探索药物作用机理ntreatment with oestrogen and tamoxifen它莫西芬(a selective oestrogen receptor modulator).nPilot experiments were done first to determine the optimal duration of treatment,and we found that a
29、 3-hr treatment of cEECs内皮细胞瘤 with 17b-oestradiol(E2)yielded the greatest coverage(about 75%)of currently known ER target genes.nThus,we chose a 3-hrtreatment for subsequent experiments.第64页，讲稿共85张，创作于星期日65Endometrioid carcinoma samples(cEECs)and from samples of normal endometrial epithelium(nEECs)第
30、65页，讲稿共85张，创作于星期日66作用机理 Nature Review,2006,6第66页，讲稿共85张，创作于星期日67 它莫西芬的代谢通路第67页，讲稿共85张，创作于星期日68基因调控的复杂性基因调控的复杂性(多层次多层次)Information Functional Components Cellular PathwaysCellular PathwaysCellular ProcessesCellular ProcessesCellular PhenotypeCellular Phenotype第68页，讲稿共85张，创作于星期日69 Signal Transduction i
31、n a Cellfrom Downward,Nature,August(2001)第69页，讲稿共85张，创作于星期日702）信号通路分析nPowerful capabilities to visualize and manipulate pathwaysnGenes automatically placed on KEGG and GenMaPP pathways and linked with expression datanPathways are easily converted to genelists for further analysisnSeamless integratio
32、n with popular pathway tools,such as Ariadne Genomics PathwayAssist第70页，讲稿共85张，创作于星期日71信号通路数据库nGenMappwww.genmapp.orgnKEGGwww.kegg.orgnSPADwww.grt.kyushu-u.ac.jp/spad/nBioC Analysis in GeneSpringStep 1:Find list of interesting genes in GeneSpring第72页，讲稿共85张，创作于星期日73Pathway Analysis in GeneSpringStep
33、 2:Run script to automatically find which target genes are members of which pathways第73页，讲稿共85张，创作于星期日74Pathway Analysis in GeneSpringStep 3:Visually inspect important genes and pathways identified through the script using the“split window”function in GeneSpring第74页，讲稿共85张，创作于星期日75Pathway Analysis i
34、n GeneSpringStep 4:View important genes expression profiles on the pathway image第75页，讲稿共85张，创作于星期日76细胞信号通路数据库nAfCS-The Alliance for Cellular SignalingReconstructing NetworksLegacy DataAfCS DataProtein InteractionsMicroarray DataBiochemical PathwaysYeast Two-Hybrid DataRNAi DataProtein DataPerturbati
35、on DataMicroscopy DataPublished Literaturewww.signaling-gateway.org第76页，讲稿共85张，创作于星期日773）表达模式分析第77页，讲稿共85张，创作于星期日78人不同部位分离培养的成纤维细胞第78页，讲稿共85张，创作于星期日79不同的成纤维细胞表达谱有明显差异1600 genes 50 fibroblasts分层聚类分析第79页，讲稿共85张，创作于星期日80同源异型(Hox)基因的表达第80页，讲稿共85张，创作于星期日81不同部位人成纤维细胞与HOX基因表达基因表达上调的HOX基因第81页，讲稿共85张，创作于星期日8
36、2基因芯片基因芯片优势与挑战优势与挑战第82页，讲稿共85张，创作于星期日83优势n高通量，（同一时间内分析大量的基因，实现生物基因信息的大规模检测）特别是，近来开发的全基因组表达芯片 n检测自动化n较高敏感性和特异性n实用的又一种差异显示方法n一种实用的筛选技术第83页，讲稿共85张，创作于星期日84挑战n总的mRNA,不能检测某个具体过程中mRNA的丰度；n基因表达调控的复杂性（转录因子、DNA 甲基化、microRNA、组蛋白乙酰化的甲基化、调控网络）n如何从大量的数据中获得“有用”的信息需要区分，实质变化和试验误差引起的变化n数据分析：标准化、分析方法n基因表达水平与蛋白质水平用活性的相关性n高等动物信号通路的复杂性第84页，讲稿共85张，创作于星期日感感谢谢大大家家观观看看第85页，讲稿共85张，创作于星期日