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1、关于基因芯片的制作方法(2)第1页，讲稿共40张，创作于星期日3.1 概述概述 1.基因芯片是以Southern印迹杂交技术为基础发展起来的。反向杂交技术第2页，讲稿共40张，创作于星期日2.基因芯片的制作方法：原位合成法：Affymetrix公司 直接点样法（合成后点样）：Stanford大学，1995年第3页，讲稿共40张，创作于星期日项目项目原位合成法原位合成法直接点样法直接点样法探针预备探针预备不需要不需要需要需要探针类型探针类型寡核苷酸寡核苷酸寡核苷酸，寡核苷酸，cDNA，基因组，基因组DNA，蛋白等，蛋白等探针长度探针长度约约25nt不限制不限制联合合成联合合成需要需要不需要不需要
2、芯片表面点样芯片表面点样不需要不需要需要需要密度密度高高低低制作成本制作成本高高低低应用应用基因表达，突变检测基因表达，突变检测 基因表达，突变检测，基因表达，突变检测，CGH第4页，讲稿共40张，创作于星期日1.常见的载体类型 膜 玻片 三维基质包被玻片3.2 芯片载体的制作芯片载体的制作第5页，讲稿共40张，创作于星期日（1）膜 优点：与核酸亲和力强。缺点：单位面积上点样密度低；背景较高；灵敏度低。第6页，讲稿共40张，创作于星期日（2）玻片 优点：耐受高温和高离子强度；具有不浸润性，提高点样密度；背景低。缺点：二维的平面结构，与DNA杂交时会有空间位阻。第7页，讲稿共40张，创作于星期日
3、（3）三维基质包被玻片 具有三维孔性结构，更适合做蛋白质芯片的支持物，可以保持蛋白质的空间构象，不影响它的活性。第8页，讲稿共40张，创作于星期日2.玻片的修饰类型l氨基修饰玻片l同型双功能偶联剂修饰的玻片l硫醇基修饰的玻片l环氧硅烷化修饰的玻片等第9页，讲稿共40张，创作于星期日图图3-3 APS修饰玻璃表面反应示意修饰玻璃表面反应示意（1）氨基修饰的玻片羟基羟基氨基氨基第10页，讲稿共40张，创作于星期日对苯乙异硫氰酸（2）同型双功能偶联剂包被修饰的玻片异硫氰基异硫氰基第11页，讲稿共40张，创作于星期日醛基醛基戊二醛第12页，讲稿共40张，创作于星期日连接分子连接分子手臂分子手臂分子特异
4、性探针特异性探针第13页，讲稿共40张，创作于星期日图图3-7 SMPB连接硫醇基核苷酸和氨基玻片连接硫醇基核苷酸和氨基玻片（3）连接硫醇基修饰的玻片硫醇基硫醇基第14页，讲稿共40张，创作于星期日图图3-8 环氧硅烷化玻片修饰示意环氧硅烷化玻片修饰示意（4）环氧硅烷化修饰的玻片环氧硅烷基环氧硅烷基第15页，讲稿共40张，创作于星期日1.cDNA探针2.寡核苷酸探针3.基因组DNA探针（很少用）4.RNA探针3.3 探针的制备探针的制备第16页，讲稿共40张，创作于星期日cDNA探针：主要来自cDNA文库，从细胞或组织中提取RNA后逆转。第17页，讲稿共40张，创作于星期日寡核苷酸探针：根据数
5、据库中的基因序列人工合成的。通常在5末端进行氨基修饰，并加入一段不直接参与杂交的重复序列，称为手臂分子，通常用poly dT(10)。手臂分子手臂分子特异性探针特异性探针第18页，讲稿共40张，创作于星期日探针分子与基片表面的作用方式 化学偶联：探针分子与基片表面活性基团发生化学反应，生成新的共价键。物理吸附：探针分子与基片表面通过次级键相连接。第19页，讲稿共40张，创作于星期日3.4 点样仪及点样过程点样仪及点样过程l接触式点样l非接触式点样第20页，讲稿共40张，创作于星期日1.接触式点样 点样针。基本过程：点样针接触探针溶液，通过浸润现象或毛细现象，使液体转移到针尖或针的狭缝中。针尖再
6、接触基片，样品在基片上留下斑点，完成一次点样。第21页，讲稿共40张，创作于星期日点样针的种类：实心针（solid pin）裂隙针（split pin）毛细管针（capillary tube）针与环（pin and ring）第22页，讲稿共40张，创作于星期日bestbest第23页，讲稿共40张，创作于星期日第24页，讲稿共40张，创作于星期日2.非接触式点样（自学）（1）微螺线阀 （2）压电元件第25页，讲稿共40张，创作于星期日接触式接触式非接触式非接触式 压电元件压电元件微螺线阀微螺线阀1 1 图图3-10当前当前59家芯片设备生产商使用的点样针分布情况家芯片设备生产商使用的点样针分
7、布情况（图中的数字代表使用各点样针的厂家数目）（图中的数字代表使用各点样针的厂家数目）第26页，讲稿共40张，创作于星期日3.5 原位合成法第27页，讲稿共40张，创作于星期日操作平台第28页，讲稿共40张，创作于星期日Affymetrix芯片的特点：光导原位合成的寡核苷酸芯片 高密度的点阵技术 独特的PM-MM探针设计 第29页，讲稿共40张，创作于星期日1.光导原位合成原理第30页，讲稿共40张，创作于星期日2.高密度的点阵技术1平方厘米的面积至少可排列上百万个探针合成区（“点”)第31页，讲稿共40张，创作于星期日3.Affymetrix独特的PM-MM探针设计第32页，讲稿共40张，创作于星期日图图3-11 PM-MM探针设计方案探针设计方案第33页，讲稿共40张，创作于星期日第34页，讲稿共40张，创作于星期日高灵敏度图图3-12 仅仅用用PM探探针针与与联联合合应应用用PM-MM探探针检测针检测靶序列的灵敏度比靶序列的灵敏度比较较第35页，讲稿共40张，创作于星期日芯片结果准确可靠图图3-13 PM-MM的多个探针的结果与单个探针的结果比较的多个探针的结果与单个探针的结果比较第36页，讲稿共40张，创作于星期日第37页，讲稿共40张，创作于星期日第38页，讲稿共40张，创作于星期日第39页，讲稿共40张，创作于星期日感谢大家观看第40页，讲稿共40张，创作于星期日