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1、补充：补充：1.1.原核细胞的基因结构原核细胞的基因结构非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 与与RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点启动子启动子终止子终止子启动子：启动子：位于基因首端一段能与位于基因首端一段能与RNARNA聚合酶结合并能起始聚合酶结合并能起始mRNAmRNA合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。终止子：终止子：位于基因的尾端的一段特殊的位于基因的尾端的一段特殊的DNADNA片段，它能阻片段，它能阻碍碍RNARNA聚合酶的移动，并使其从聚合酶的移动，并使其从DNADNA模板链上脱离
2、下来，模板链上脱离下来，使转录终止。使转录终止。RNARNA聚合酶聚合酶:能够识别启动子上的结合位点并与其结合能够识别启动子上的结合位点并与其结合的一种蛋白质的一种蛋白质.(.(以模板转录然后脱落以模板转录然后脱落)第1页/共53页不能转录为信使不能转录为信使RNARNA，不能，不能 编码蛋白质。编码蛋白质。：能转录相应的信使：能转录相应的信使RNARNA，能，能 编码蛋白质编码蛋白质 编码区编码区非编码区非编码区原核原核细胞细胞的的 基因基因结构结构有调控遗传信息表达的核有调控遗传信息表达的核 苷酸序列，在该序列中，苷酸序列，在该序列中，最重要的是位于编码区上最重要的是位于编码区上 游的游的
3、RNARNA聚合酶结合位点。聚合酶结合位点。非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 启动子启动子终止子终止子第2页/共53页编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区与与RNARNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点内含子内含子 外显子外显子 能够编码蛋白质的序列叫做外显子能够编码蛋白质的序列叫做外显子 不能够编码蛋白质的序列叫做内不能够编码蛋白质的序列叫做内含子含子启动子启动子终止子终止子编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 内含子：内含子：外显子：外显子：2.2.真核细胞的基因结构真核细胞的基因结构第3页/共53页真核真核细胞细胞的的 基因
4、基因结构结构编码区编码区非编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用的核苷酸序列，：有调控作用的核苷酸序列，包括位于编码区上游的包括位于编码区上游的RNARNA 聚合酶结合位点等。聚合酶结合位点等。非编码序列：非编码序列：包括非编码区和内含子包括非编码区和内含子第4页/共53页原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞不同点不同点编码区是编码区是_的的编码区是间隔的、编码区是间隔的、_的的相同点相同点都由能够编码蛋白质的都由能够编码蛋白质的_和具和具有调控作用的有调控作用的_区组成的区组成的原核细胞与真核细胞的基
5、因结构比较原核细胞与真核细胞的基因结构比较思考思考编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？细胞与真核细胞基因结构一样长吗？连续连续不连续不连续编码区编码区非编码非编码第5页/共53页1 1、目的基因的获取、目的基因的获取2 2、基因表达载体的构建、基因表达载体的构建3 3、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞4 4、目的基因的检测与鉴定、目的基因的检测与鉴定基因工程基本操作的四个步骤基因工程基本操作的四个步骤第6页/共53页一、目的基因的获取一、目的基因的获取(一一)、目的基因主要是、目的基因主要是_编码蛋白质的结构基因编码蛋白
6、质的结构基因请举出三个以上的例子请举出三个以上的例子（二）、获取目的基因的常用方法有哪些（二）、获取目的基因的常用方法有哪些?1 1、从基因文库中获取、从基因文库中获取2 2、利用、利用PCRPCR技术扩增技术扩增3 3、人工合成、人工合成请阅读请阅读P9P9第一和二两段第一和二两段第7页/共53页1 1、从基因文库中获取目的基因、从基因文库中获取目的基因 将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库基因文库 基因组文库部分基因文库（如:cDNA文库）（1 1）.基因文库基因文库第8页/共53页第10页/共53页基因组文库的构
7、建（2 2）.基因文库的构建方法通过对受体菌的培养而储存基因第11页/共53页 cDNA文库的构建-反转录法：反转录法：以目的基因转以目的基因转录成的信使录成的信使RNARNA为模为模板，反转录成互补板，反转录成互补的单链的单链DNADNA，然后在，然后在酶的作用下合成双酶的作用下合成双链链DNADNA，从而获得所，从而获得所需的基因。需的基因。目的基因的目的基因的mRNAmRNA单链单链DNADNA反转录酶反转录酶DNADNA聚合酶聚合酶双链双链DNADNA(目的基因目的基因)第12页/共53页基因组文库和部分基因组文库(cDNA文库)比较第13页/共53页（3 3）构建基因文库的目的 怎样
8、从基因文库中得到我们所怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢需的目的基因呢?便于在不知道目的基因核苷酸序列的情况下，获得所需的目的基因。第14页/共53页依据：目的基因的有关信息。依据：目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能基因的功能 基因在染色体上的位置基因在染色体上的位置 基因的转录产物基因的转录产物mRNAmRNA 基因翻译产物蛋白质等特性基因翻译产物蛋白质等特性（4）从基因文库中得到目的基因的方法直接分离法直接分离法(鸟枪法鸟枪法)第15页/共53页 概念：概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成技
9、术的核酸合成技术 条件：条件：_、_、_ _、_._.原理：原理：_方式：以方式：以_方式扩增，即方式扩增，即_（n n为扩增循为扩增循 环的次数）环的次数）结果：结果：多聚酶链式反应多聚酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段DNADNA复制复制已知基因的核苷酸序列已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸一对引物一对引物DNADNA聚合酶聚合酶指数指数2 2n n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增2 2、利用、利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因第16页/共53页过程：过程：a a、DNADNA变性变性（90-9590-
10、95）：）：双链双链DNADNA模板在热作用下，模板在热作用下，_断裂，形成断裂，形成_b b、退火、退火（复性55-6555-65）：）：系统温度降低，系统温度降低，引物引物与与DNADNA模模板结合，形成局部板结合，形成局部_。c c、延伸、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶酶的作用下，合成与模板的作用下，合成与模板互补的互补的_。氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链d.重复步骤：每重复一次，重复步骤：每重复一次，目的基因增加目的基因增加_倍倍一第17页/共53页过程：过程：第18页/共53页PCRPCR反应体系中目的基因成反应体系中目的基因成指数指数(2
11、(2n n)形式扩增形式扩增第19页/共53页DNA复制复制PCR技术技术场所场所原理原理条件条件解旋方式解旋方式酶酶特点特点结果结果PCR技术扩增与技术扩增与DNA复制的比较复制的比较碱基互补配对原则碱基互补配对原则碱基互补配对原则碱基互补配对原则四种脱氧核苷酸、模四种脱氧核苷酸、模板、酶、板、酶、ATP四种脱氧核苷酸、四种脱氧核苷酸、模板、酶、模板、酶、引物引物DNA在高温下变性解旋在高温下变性解旋解旋酶催化解旋解旋酶催化解旋半保留复制、半保留复制、边解旋变复制边解旋变复制半保留复制、半保留复制、全解旋再复制全解旋再复制体外复制体外复制主要在细胞核内主要在细胞核内大量的大量的DNA片段片段
12、形成整个形成整个DNA分子分子热稳定的热稳定的DNA聚合酶聚合酶细胞内的细胞内的DNA聚合酶、聚合酶、解旋酶、解旋酶、DNA连接酶等连接酶等第20页/共53页蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列基因的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因目的基因化学合成化学合成推测推测推测推测3 3、人工合成法：、人工合成法：在基因较小，核苷酸序列已知的情况下，可以利用DNA合成仪人工合成化学法合成的目的基因含内含子、启动子和终止子吗？第21页/共53页1 1 1 1.作用作用：二二.基因表达载体的构建基因表达载体的构建-核心核心IMNIMN2 2.组成：使目的基因在受体细
13、胞中稳定存在使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代并遗传给子代。同时使目的基因能表达和发挥作用。同时使目的基因能表达和发挥作用。(3)(3)终止子：是使转录在需要的地方停止(4)(4)标记基因：是鉴别受体细胞中是否含有目的基因标记基因：是鉴别受体细胞中是否含有目的基因从而将含有目的基因的细胞筛选出来从而将含有目的基因的细胞筛选出来(2)(2)启动子：是RNA聚合酶识别和结合部位(1)(1)目的基因不同受体细胞，目的基因导入受体细胞的方法不不同受体细胞，目的基因导入受体细胞的方法不同，基因表达载体的构建有所差异。同，基因表达载体的构建有所差异。（5）复制原点：是转录和复制的起点。第22页/共
14、53页二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建核心核心质粒质粒DNADNA分子分子限制酶处理限制酶处理两个切口两个切口获得目的基因获得目的基因DNADNA连接酶连接酶重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）同一种同一种一个切口一个切口两个黏性末端两个黏性末端复制原点复制原点+启动子启动子+目的基因目的基因+终止子终止子+标记基因标记基因第23页/共53页寻根问底：寻根问底：将生物的所有DNA直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，结果会怎样？有人采用总有人采用总DNA注射法进行遗传转化：即将一个生注射法进行遗传转化：即将一个生物中的总物中的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通
15、道法提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体细胞，没有进行表达载体的构建。导入受体细胞，没有进行表达载体的构建。这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因导入了受体细胞。此法目前争议颇多，什么基因导入了受体细胞。此法目前争议颇多，严格来说不算基因工程。严格来说不算基因工程。第24页/共53页资资料料:科学家在培育抗虫棉时，起初把科学家在培育抗虫棉时，起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。结果抗虫基因在棉花体内没有表达。然后
16、在插入抗虫基因的质粒中插入抗虫基因然后在插入抗虫基因的质粒中插入抗虫基因启动启动子子，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入抗虫基因抗虫基因终止子终止子，导入棉花受精卵，结果成长的植株，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。有了抗虫能力。资料证明：表达载体构建组成要完整第25页/共53页载体载体与与表达载体表达载体的区别：二者都有标记基因的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分和复制原点两部分DNADNA片段。表达载体在载体片段。表达载体在载体基础
17、上增加了目的基因、启动子、终止子三部基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构分结构用到的工具酶：用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又既用到限制酶切割载体，又用到用到DNADNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键酶作用的化学键都是磷酸二酯键启动子、终止子启动子、终止子对于目的基因表达必不可少对于目的基因表达必不可少目的基因不能单独进入受体细胞，目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表必需以表达载体的方式携带进去。达载体的方式携带进去。注意注意第26页/共53页2.2.下列属于获取目的基因的方法的是()()利用mRNAmRNA反转录形
18、成 从基因组文库中提取从受体细胞中提取 利用PCRPCR技术 利用DNADNA转录 人工合成A.B.C.D.A.B.C.D.1在已知基因的核苷酸序列的情况下，获取目的基因的最方便方法是A、化学合成法B、基因组文库法C、CDNA文库法D、聚合酶链反应第27页/共53页3.3.在基因工程中，把选出的一个目的基因（共10001000个脱氧核苷酸对，其中腺嘌岭脱氧核苷酸是460460个）放入DNADNA扩增仪中扩增4 4次，那么，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是（）个A.540B.8100C.17280D.7560第28页/共53页 4.目的基因与运载体结合所需的条件有 同一种限制酶 具有抗性
19、基因的质粒 RNA聚合酶 目的基因 DNA连接酶 四种脱氧核苷酸 ATP A BC D5.（多选）一个基因表达载体的构建应包括A目的基因B启动子C终止子D标记基因ABCDD第29页/共53页常用的受体细胞：常用的受体细胞：大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。酵母菌和动植物细胞等。将目的基因导入受体细胞的原理将目的基因导入受体细胞的原理借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。三三.目的基因导入受体细胞目的基因导入受体细胞转化：转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。体
20、细胞内维持稳定和表达的过程。第30页/共53页特点特点:农杆菌转化法：农杆菌转化法：（1）将目的基因导入植物细胞）将目的基因导入植物细胞能感染能感染双子叶植物双子叶植物和和祼子植物祼子植物,对对大多数大多数单子叶植物单子叶植物没有没有感染能力感染能力过程过程：TiTi质粒的质粒的TDNATDNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上可转移至受体细胞并整合到其染色体上适用生物：双子叶植物双子叶植物、祼子植物祼子植物。第31页/共53页Hin d限制性酶Hin dIIIHin dIII目的DNATi质粒苏云金杆菌构建表达载体Bt毒素蛋白基因 苏云金杆菌DNA连接酶 T-DNA(可转移-DNA)知识拓展
21、知识拓展农杆菌转化法的过程：第32页/共53页基因枪法：基因枪法：利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法操作方法：金属粒：将目的基因导入单子叶植物细胞将目的基因导入单子叶植物细胞钨粉粒子和金粉粒子，粒子的直径一般在0.64um。适用：单子叶植物第33页/共53页花粉管通道法：花粉管通道法：将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞操作方法：特点：在植物花受粉后，花粉形成花粉管还末愈合前期，剪去柱头，然后，滴入DNA（含目的基因）使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞十分简便经济例：转基因抗虫棉第35页/共53页细胞类型：操作程序
22、：_显微注射法：显微注射法：（2）将目的基因导入动物细胞将目的基因导入动物细胞发育成新性状动物发育成新性状动物移植到子宫或输卵管移植到子宫或输卵管培养成早期胚胎培养成早期胚胎显微显微注射注射取受精卵取受精卵（体内或体外（体内或体外 受精）受精）提纯含目提纯含目的基因表的基因表达载体达载体受精卵第38页/共53页常用法：常用菌：微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少过程：大肠杆菌CaCa2+2+处理获得感受态细胞CaCaCaCa2+2+2+2+处理处理大肠杆菌大肠杆菌感感 受受 态态 细细 胞胞表达载体表达载体与感受态与感受态细胞混合细胞混合感受态细胞感受态细胞 吸收吸收DNA
23、DNA_感受态细胞法感受态细胞法（3）将目的基因导入微生物细胞）将目的基因导入微生物细胞第39页/共53页（3 3）.将目的基因导入微生物细胞 大肠杆菌细胞最常用的转化方法是大肠杆菌细胞最常用的转化方法是:首先用首先用CaCa2+2+处理细胞处理细胞,以以以以增大增大增大增大细菌细菌细菌细菌细胞壁的细胞壁的细胞壁的细胞壁的通透性通透性通透性通透性,使细胞处于一种能吸收周围环境中使细胞处于一种能吸收周围环境中DNADNA分分子的生理状态子的生理状态,这种细胞称为感受态细胞这种细胞称为感受态细胞.第二步是将重组表达载体第二步是将重组表达载体DNADNA分子溶于缓分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合冲液
24、中与感受态细胞混合,在一定的温度下促进感在一定的温度下促进感受态细胞吸收受态细胞吸收DNADNA分子分子,完成转化过程完成转化过程.第二步第二步目的基因在受体细胞内，随其繁目的基因在受体细胞内，随其繁目的基因在受体细胞内，随其繁目的基因在受体细胞内，随其繁殖而殖而殖而殖而复制复制复制复制，由于细菌，由于细菌，由于细菌，由于细菌繁殖的速度繁殖的速度繁殖的速度繁殖的速度非常快，在很短非常快，在很短非常快，在很短非常快，在很短的时间内就能获得的时间内就能获得的时间内就能获得的时间内就能获得大量大量大量大量的目的基因。的目的基因。的目的基因。的目的基因。第40页/共53页四四 目的基因的检测与鉴定目的
25、基因的检测与鉴定导入过程完成后，全部受体细胞都能摄入重组导入过程完成后，全部受体细胞都能摄入重组 DNADNA分子吗？分子吗？真正能摄入重组真正能摄入重组DNADNADNADNA分子的受体细胞很少。分子的受体细胞很少。目的基因进入受体细胞后，是否都能稳定维持目的基因进入受体细胞后，是否都能稳定维持和表达？和表达？不一定，需要检测不一定，需要检测1.检测方法：分子杂交技术：（1 1）DNA分子与DNA分子的之间杂交（2 2）DNA分子与RNA分子的之间杂交（3）蛋白质分子（抗原与抗体）之间杂交2.个体生物学水平的鉴定：抗虫、抗病接种实验，活性比较实验第41页/共53页1.检测检测转基因生物的DN
26、A探针15N N15N N14N N14N N（1 1）检测转基因生物染色体的DNADNA上是否插入了目的基因基因探针：放射性同位素等标记的DNA分子方法：DNA分子杂交技术变性变性变性变性第42页/共53页 如果显示出杂交带，就表明待测样品含有目的基因。如果显示出杂交带，就表明待测样品含有目的基因。第44页/共53页变性变性方法：DNA分子杂交技术（2）检测目的基因是否转录出了mRNA探针15N N15N N转基因生物的mRNA14N N14N N如果显示出杂交带，就表明待测样品目的基因已经转录。如果显示出杂交带，就表明待测样品目的基因已经转录。第45页/共53页提取（3）检测目的基因是否翻
27、译成蛋白质方法：抗原-抗体杂交苏云金杆菌Bt毒素蛋白将Bt毒蛋白注射小鼠体内从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体抗体蛋白质出现杂交带脱分化组织培养证明：提取蛋白质与Bt毒素蛋白质一样第46页/共53页例：用棉铃饲喂棉铃虫，例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因则说明摄入了抗虫基因并得到表达。并得到表达。2 2.鉴定个体生物学水平的鉴定（1）多细胞个体抗虫、抗病接种实验，活性比较实验第47页/共53页 不能，受体细胞必须表现出
28、特定的性状，不能，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了才能说明目的基因完成了表达表达。受体细胞摄入受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因分子后就说明目的基因完成了表达吗？完成了表达吗？若不能表达，若不能表达，要对抗虫基因要对抗虫基因再进行再进行修饰修饰。第48页/共53页细菌的检测，将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测细菌的检测，将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。（2）单细胞生物无表达产物无表达产物无表
29、达产物无表达产物有表达产物有表达产物无表达产物无表达产物第49页/共53页基基因因工工程程的的基基本本操操作作程程序序目的基因的获取目的基因的获取基因表达载体的构建基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定1、从基因文库中获取目的基因2、利用PCR技术扩增目的基因3、化学方法人工合成复制原点复制原点 +目的基因目的基因 +启动子启动子 +终止子终止子 +标记基因标记基因农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法、显微注射法、农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法、显微注射法、CaCa2+2+处理法处理法DNADNA分子杂交技术、分子杂交技术、抗原分子杂交技术、分子杂交技术、抗原抗体杂交技术抗体杂交技术分子检测外的个体水平鉴定分子检测外的个体水平鉴定第50页/共53页第51页/共53页第52页/共53页感谢您的观看！第53页/共53页