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1、高中生物选修一基因工程的基本操作程序第1页，此课件共48页哦 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序目的基因的获取目的基因的获取基因表达载体的构建基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞操作过程操作过程操作过程操作过程目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定2023/4/32023/4/32 2第2页，此课件共48页哦n什么叫基因？基因基因有有遗传效应遗传效应的的DNADNA片段片段。n什么叫遗传效应？遗传效应遗传效应能转录为能转录为能转录为能转录为mRNAmRNAmRNAmRNA，继而翻译为蛋白质；，继而翻译为蛋白质；，继而翻译为蛋白质；，继而翻译为蛋白质；能转录
2、为核糖体能转录为核糖体能转录为核糖体能转录为核糖体RNARNARNARNA；能转录为转运能转录为转运RNARNA。第3页，此课件共48页哦原原 核核 细细 胞胞的的 基基 因因 结结 构构编码区编码区编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区编码区上游编码区上游编码区上游编码区上游编码区下游编码区下游编码区下游编码区下游调控遗传信息的表达调控遗传信息的表达调控遗传信息的表达调控遗传信息的表达(调控序列调控序列调控序列调控序列)转录转录RNA(编码序列编码序列)第4页，此课件共48页哦编码区编码区非编码区非编码区(下游下游下游下游)非编码区非编码区（上游）（上游）（上游）（上游
3、）(与与RNARNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点)启动子启动子(转录转录终止终止标记标记)终止子终止子原原 核核 细细 胞胞的的 基基 因因 结结 构构转录转录转录转录RNARNA(编码序列编码序列编码序列编码序列)第5页，此课件共48页哦 RNARNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。转录开始后，转录开始后，RNARNA聚合酶沿聚合酶沿DNADNA分子移动，并以分子移动，并以DNADNA分子分子的一条链为模板合成的一条链为模板合成RNARNA。转录完毕后，转录完毕后，RNARNA链释放出来，紧接着链释放出来，紧接着RNARNA聚合
4、酶也从聚合酶也从DNADNA模板链上脱落下来。模板链上脱落下来。启动子：启动子：位于基因的首端的一段特殊的位于基因的首端的一段特殊的DNADNA片断，片断，它是它是RNARNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出因转录出mRNAmRNA，最终获得蛋白质，最终获得蛋白质.终止子：终止子：位于基因的尾端的一段特殊的位于基因的尾端的一段特殊的DNADNA片断，片断，能终止能终止mRNAmRNA的转录的转录 RNA RNA聚合酶聚合酶:能够识别启动子上结合位点的一种蛋白质能够识别启动子上结合位点的一种蛋白质.第6页，此课件共48页哦编码区编码区非编码
5、区非编码区非编码区非编码区外显子外显子外显子外显子(能编码蛋白质能编码蛋白质能编码蛋白质能编码蛋白质)启动子启动子启动子启动子内含子内含子(不能编码蛋白质不能编码蛋白质不能编码蛋白质不能编码蛋白质)真真 核核 细细 胞胞的的 基基 因因 结结 构构上游上游上游上游终止子终止子下游下游下游下游真核细胞的一个基因的编码区转录出真核细胞的一个基因的编码区转录出mRNAmRNA，需把其中的需把其中的需把其中的需把其中的内含子内含子内含子内含子切除，切除，切除，切除，外显子外显子外显子外显子拼接成成熟拼接成成熟拼接成成熟拼接成成熟mRNAmRNAmRNAmRNA。(结构基因结构基因)第7页，此课件共48
6、页哦真核真核细胞细胞的的 基因基因结构结构编码区编码区非编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用的核苷酸序列，：有调控作用的核苷酸序列，包括位于编码区上游的包括位于编码区上游的RNARNA 聚合酶结合位点（启动子）。聚合酶结合位点（启动子）。非编码序列：非编码序列：包括非编码区和内含子包括非编码区和内含子第8页，此课件共48页哦获得目的基因的方法获得目的基因的方法 从基因文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因（1 1）什么是基因文库？）什么是基因文库？（2 2）怎样从基因文库中得到我们所需的目的基
7、因？）怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？种类：种类：基因组文库：基因组文库：部分基因文库：部分基因文库：(如如cDNAcDNA文库文库)利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因 人工合成人工合成 含有一种生物的含有一种生物的全部全部基因基因含有一种生物的含有一种生物的部分部分基因基因未知序列 基因较小已知序列已知序列2023/4/32023/4/39 9第9页，此课件共48页哦提取某种生物的全部提取某种生物的全部DNADNA用适当的限制酶切用适当的限制酶切一定大小的一定大小的DNADNA片段片段将将DNADNA片段与载体连接片段与载体连接导入受体菌中储存导入受体菌中储存基因组
8、文库基因组文库（1 1）直接分离法）直接分离法(鸟枪法鸟枪法)1.构建基因文库构建基因文库将含有某种生物将含有某种生物将含有某种生物将含有某种生物不同基因不同基因不同基因不同基因的的的的许多许多许多许多DNADNADNADNA片断片断片断片断，导入导入导入导入受体菌受体菌受体菌受体菌的群体中的群体中的群体中的群体中储存储存储存储存，各个受体菌分，各个受体菌分，各个受体菌分，各个受体菌分别含有这种生物的别含有这种生物的别含有这种生物的别含有这种生物的不同基因不同基因不同基因不同基因，称为基因文，称为基因文，称为基因文，称为基因文库。库。库。库。第10页，此课件共48页哦某种生物的单链某种生物的单
9、链mRNAmRNA单链互补单链互补DNADNA双链双链cDNAcDNA片段片段导入受体菌中储存导入受体菌中储存与载体连接与载体连接cDNAcDNA文库文库 反转录酶反转录酶DNADNA聚合酶聚合酶（2 2）反转录法：）反转录法：cDNAcDNA的合成流程图解的合成流程图解第11页，此课件共48页哦cDNA合成过程 第一步，反转录酶以第一步，反转录酶以RNARNA为模板合成一条与为模板合成一条与RNARNA互补的互补的DNADNA单链，单链，形成形成RNA-DNARNA-DNA杂交分子。杂交分子。第二步，核酸酶第二步，核酸酶H H使使RNA-DNARNA-DNA杂交分子中的杂交分子中的RNARN
10、A链降解，使之变链降解，使之变成单链的成单链的DNADNA。第三步，以单链第三步，以单链DNADNA为模板，在为模板，在DNADNA聚合酶的作用下合成另聚合酶的作用下合成另一条互补的一条互补的DNADNA链，形成双链链，形成双链DNADNA分子。分子。2023/4/32023/4/31212第12页，此课件共48页哦依据：目的基因的有关信息。依据：目的基因的有关信息。如：根据如：根据基因的核苷酸序列基因的核苷酸序列基因的功能、基因在染色体上的位置基因的功能、基因在染色体上的位置基因的转录产物基因的转录产物mRNAmRNA基因的表达产物蛋白质等特性。基因的表达产物蛋白质等特性。2如何从基因文库中
11、得到所需要的基因？如何从基因文库中得到所需要的基因？2023/4/32023/4/31313第13页，此课件共48页哦基因组文库：一般针对基因组文库：一般针对基因组文库：一般针对基因组文库：一般针对原核生物原核生物原核生物原核生物的基因，因为基因少的基因，因为基因少的基因，因为基因少的基因，因为基因少部分基因文库：一般针对部分基因文库：一般针对部分基因文库：一般针对部分基因文库：一般针对真核生物真核生物真核生物真核生物的基因，如的基因，如的基因，如的基因，如cDNAcDNAcDNAcDNA文库文库文库文库文库类型文库类型cDNAcDNA文库文库基因组文库基因组文库文库大小文库大小小小大大基因中
12、基因中启动子启动子无无有有基因中基因中内含子内含子无无有有基因多少基因多少某种生物的部分基因某种生物的部分基因某种生物的全部基因某种生物的全部基因物种之间的基物种之间的基因交流因交流可以可以部分基因可以部分基因可以说明说明基因文库的组建过程就包含基因工程的基本操作基因文库的组建过程就包含基因工程的基本操作步骤步骤。从基因文库中获取目的基因的优点是操作。从基因文库中获取目的基因的优点是操作简便，缺点是工作量大，具有一定的盲目性简便，缺点是工作量大，具有一定的盲目性.基因文库的构建方法基因文库的构建方法2023/4/32023/4/31414第14页，此课件共48页哦利用利用PCRPCR技术扩增目
13、的基因技术扩增目的基因2023/4/32023/4/31515山西省孝义市第二中学山西省孝义市第二中学第15页，此课件共48页哦 概念：概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成技术的核酸合成技术 条件：条件：_、_、_ _、_._.前提条件：前提条件：原理：原理：_方式：以方式：以_方式扩增，即方式扩增，即_（n n为扩增循为扩增循 环的次数）环的次数）结果：结果：选修选修3 P3 P1010聚合酶链式反应聚合酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段DNADNA双链复制双链复制已知基因的核苷酸序列已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸
14、一对引物一对引物DNADNA聚合酶聚合酶指数指数2 2n n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因2023/4/32023/4/31616第16页，此课件共48页哦过程：过程：a a、DNADNA变性（变性（90-9590-95）：双链）：双链DNADNA模板模板 在热作用下，在热作用下，_断裂，形成断裂，形成_b b、退火（、退火（复性复性55-6555-65）：系统温度降低，引）：系统温度降低，引 物物与与DNADNA模板结合，形成局部模板结合，形成局部_。c c、延伸（、延伸（70-7570-7
15、5）：在）：在TaqTaq酶的作用下，从酶的作用下，从 引物的引物的55端端33端端延伸，合成与模板互补延伸，合成与模板互补 的的_。氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链2023/4/32023/4/31717PCR扩增仪扩增仪第17页，此课件共48页哦2023/4/32023/4/31818第18页，此课件共48页哦PCRPCR技术技术DNADNA复制复制过程过程DNADNA变性（变性（90909595）退火退火（复性（复性55556060）子链延伸子链延伸（70707575）重复循环重复循环DNADNA复制起始，复制起始，RNARNA引物形成引物形成DNADNA片段生成片段
16、生成RNARNA引物水解引物水解完整的完整的DNADNA分子形成分子形成相同相同点点原则原则碱基互补配对碱基互补配对条件条件模板、原料（模板、原料（dCTPdCTP、dATPdATP、dGTPdGTP、dTTPdTTP）、能量、酶、引物等）、能量、酶、引物等不同不同点点解旋方解旋方式式氢键在高温下断裂，氢键在高温下断裂，双链全部解开双链全部解开解旋酶催化氢键逐步断裂解旋酶催化氢键逐步断裂场所场所体外体外主要在细胞核中主要在细胞核中引物引物DNADNARNARNA酶酶热稳定热稳定DNADNA聚合酶聚合酶（TaqTaq酶）酶）解旋酶、解旋酶、DNADNA聚合酶、聚合酶、DNADNA连接酶等连接酶等
17、结果结果在短时间内形成大在短时间内形成大量的量的DNADNA片段片段形成完整的形成完整的DNADNA分子分子利用利用利用利用PCRPCRPCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因技术扩增目的基因技术扩增目的基因2023/4/32023/4/31919第19页，此课件共48页哦目的基因的目的基因的目的基因的目的基因的mRNA单链单链DNA(cDNA）双链双链双链双链DNADNA(即目的基因即目的基因)反转录反转录反转录反转录合成合成1）反转录法：）反转录法：以目的基因转录成的信使以目的基因转录成的信使RNARNA为模板，反转录成互补的为模板，反转录成互补的单链单链DNADNA，然后在酶的作用下
18、，然后在酶的作用下合成双链合成双链DNADNA，从而获得所需，从而获得所需的基因。的基因。蛋白质蛋白质的氨基的氨基酸序列酸序列mRNA的核苷的核苷的核苷的核苷酸序列酸序列酸序列酸序列结构基因的结构基因的结构基因的结构基因的核苷酸序列核苷酸序列核苷酸序列核苷酸序列目的基目的基目的基目的基因因因因推测推测推测化学化学合成合成2）根据已知的氨基酸序列合成）根据已知的氨基酸序列合成DNA法法：2023/4/32023/4/32020人工合成的目的基因人工合成的目的基因第20页，此课件共48页哦2023/4/32023/4/32121第21页，此课件共48页哦 基因工程的核心基因工程的核心1、目的：、目
19、的：使目的基因在受体细胞中使目的基因在受体细胞中稳定存在稳定存在，并且，并且可以可以遗传遗传给下一代，同时使目的基因能给下一代，同时使目的基因能够够表达和发挥表达和发挥作用。作用。(二二)基因表达载体的构建基因表达载体的构建第22页，此课件共48页哦2 2、基因表达载体的组成：、基因表达载体的组成：复制原点复制原点+目的基因目的基因+启动子启动子+终止子终止子+标记基因标记基因它们各自的它们各自的作用是什么作用是什么?第23页，此课件共48页哦启动子：启动子：位于基因的首端的一位于基因的首端的一段特殊的段特殊的DNADNA片断，它是片断，它是RNARNA聚聚合酶识别和结合的部位，有了合酶识别和
20、结合的部位，有了它才能它才能驱动基因转录出驱动基因转录出mRNAmRNA，最终获得蛋白质最终获得蛋白质终止子：终止子：位于基因的尾端的位于基因的尾端的一段特殊的一段特殊的DNADNA片断，片断，能终止能终止mRNAmRNA的转录的转录标记基因标记基因的作用是的作用是为了为了鉴别鉴别受受体细胞中是否含有目的基因，体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选从而将有目的基因的细胞筛选出来出来第24页，此课件共48页哦载体载体与与表达载体表达载体的区别：二者都有标记基因和的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分复制原点两部分DNADNA片段。表达载体在载体基础上片段。表达载体在载体基础上增加
21、了增加了目的基因、启动子、终止子目的基因、启动子、终止子三部分结构三部分结构用到的工具酶：用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到既用到限制酶切割载体，又用到DNADNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键化学键都是磷酸二酯键启动子、终止子启动子、终止子对于目的基因表达必不可少对于目的基因表达必不可少目的基因不能单独进入受体细胞，目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达必需以表达载体的方式携带进去。载体的方式携带进去。注意注意第25页，此课件共48页哦(三三)将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞常用的受体细胞：常用的受体
22、细胞：动植物细胞、大肠杆菌、土壤农杆菌、枯草杆菌等。动植物细胞、大肠杆菌、土壤农杆菌、枯草杆菌等。动植物细胞、大肠杆菌、土壤农杆菌、枯草杆菌等。动植物细胞、大肠杆菌、土壤农杆菌、枯草杆菌等。将目的基因导入受体细胞的原理：将目的基因导入受体细胞的原理：借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。转化转化目的基因进入目的基因进入_内，并且在内，并且在 受受体细胞内维持体细胞内维持_和和_的过程的过程受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达2023/4/32023/4/32626第26页，此课件共48页哦方法方法导入植物细胞导入植物
23、细胞导入动物细胞导入动物细胞导入微生物细胞导入微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法 感受态细胞吸收感受态细胞吸收DNADNA分子分子(三三)将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞2023/4/32023/4/32727第27页，此课件共48页哦1 1、将目的基因导入植物细胞的方法：、将目的基因导入植物细胞的方法：（1）农杆菌转化法农杆菌转化法 农杆菌特点：农杆菌特点：易感染易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力单子叶植物没有感染能力原理：原理：Ti质粒上质粒上的的T-DNA可以可以
24、转移转移到受体细胞到受体细胞，并，并整合整合到受体细胞染色体的到受体细胞染色体的DNA上。上。第28页，此课件共48页哦过程：过程：优点优点:经济和有效经济和有效 目的基因插入目的基因插入TiTi质粒的质粒的T-DNAT-DNA上上 农杆菌农杆菌 导入植物细胞导入植物细胞 整合到受体细胞的染色体上整合到受体细胞的染色体上 目的基因的遗传特性得以维持稳定和表达目的基因的遗传特性得以维持稳定和表达第29页，此课件共48页哦（2）基因枪法基因枪法（3）花粉管通道法花粉管通道法第30页，此课件共48页哦2 2、将目的基因导入动物细胞、将目的基因导入动物细胞方法：显微注射法方法：显微注射法程序：程序：目
25、的基因表达载体提纯目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵）取卵（受精卵）显显微注射微注射 受精卵培养受精卵培养 新性状动物新性状动物第31页，此课件共48页哦3 3、将目的基因导入微生物细胞、将目的基因导入微生物细胞原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少方法：方法：用用Ca2+处理细胞处理细胞 感受态细胞感受态细胞 表达表达载体与感受态细胞混合载体与感受态细胞混合 感受态细胞吸感受态细胞吸收收DNA分子分子第32页，此课件共48页哦细胞细胞类型类型常用方法常用方法受体细胞受体细胞 转化过程转化过程植物植物细胞细胞农杆菌转农杆菌转化法化法体细胞体细胞将目的基
26、因插入将目的基因插入TiTi质粒的质粒的T-DNAT-DNA上上转入农杆菌转入农杆菌导入植物细胞导入植物细胞整合整合到受体细胞的到受体细胞的DNADNA动物动物细胞细胞显微注射显微注射技术技术受精卵受精卵将含有目的基因的表达载体提纯将含有目的基因的表达载体提纯取卵取卵受精卵受精卵显微注射显微注射早期胚早期胚胎培养胎培养胚胎移植胚胎移植发育成为具有发育成为具有新性状的动物新性状的动物微生微生物细物细胞胞CaCa2+2+处理处理法法原核细胞原核细胞 用用CaCa2+2+处理细胞处理细胞感受态细胞感受态细胞重组重组表达载体表达载体DNADNA分子与感受态细胞混合分子与感受态细胞混合感受态细胞吸收感受
27、态细胞吸收DNADNA分子分子将目的基因导入受体的方法将目的基因导入受体的方法将目的基因导入受体的方法将目的基因导入受体的方法2023/4/32023/4/33333第33页，此课件共48页哦（一）、检测（一）、检测1 1、检测转基因生物染色体的、检测转基因生物染色体的DNADNA上是否插入了上是否插入了目的基因目的基因.首先取出转基因生物的基因组首先取出转基因生物的基因组DNA.用含目的基因的用含目的基因的DNA片段用放射性同位素片段用放射性同位素等作标记等作标记,以此做探针以此做探针.使探针和转基因生物的基因组杂交使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示若显示出杂交带出杂交带,表明染色体已插
28、入染色体表明染色体已插入染色体DNA中中（1）方法方法:DNADNA分子杂交分子杂交（2）过程）过程:(四四)目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定检查是否成功检查是否成功第34页，此课件共48页哦归纳步骤第35页，此课件共48页哦DNA分子杂交技术过程详解分子杂交技术过程详解n从转基因生物中取出含有目的基因片段的双链从转基因生物中取出含有目的基因片段的双链DNADNA，然后加热使之变性成两条单链。，然后加热使之变性成两条单链。n再用再用DNADNA探针与这两条单链分别杂交（即复性，探针与这两条单链分别杂交（即复性，产生双链）。产生双链）。n所谓的探针就是含有目的基因的同位素标记过的所谓的探
29、针就是含有目的基因的同位素标记过的DNADNA片段。片段。n当目的基因成功导入我们要测的基因上时，探针当目的基因成功导入我们要测的基因上时，探针就可以与之进行碱基配对。当目的基因未成功导就可以与之进行碱基配对。当目的基因未成功导入时，探针便无法与之正确配对形成双链产物。入时，探针便无法与之正确配对形成双链产物。n这样，通过检测新合成双链产物的放射性就可以这样，通过检测新合成双链产物的放射性就可以判断导入是否成功了。判断导入是否成功了。第36页，此课件共48页哦（二）、鉴定（个体生物学水平）（二）、鉴定（个体生物学水平）2 2、检测目的基因是否转录出了、检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA3
30、 3、检测目的基因是否翻译成蛋白质、检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法方法:分分 子子 杂杂 交交方法方法:抗原抗体杂交抗原抗体杂交过程过程:用上述探针和转基因生物的用上述探针和转基因生物的mRNA杂交杂交,若出现若出现杂交带杂交带,表明目的基因转录出了表明目的基因转录出了mRNA第37页，此课件共48页哦 Western杂交（抗原杂交（抗原抗体杂交）抗体杂交）n具体做法是：具体做法是：n第一步，将目的基因在大肠杆菌中表达出蛋白质；第一步，将目的基因在大肠杆菌中表达出蛋白质；n第二步，将表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的第二步，
31、将表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出抗体（一抗）；抗体，并提取出抗体（一抗）；n第三步，从转基因生物中提取蛋白质，走凝胶电泳；第三步，从转基因生物中提取蛋白质，走凝胶电泳；n第四步，将凝胶中的蛋白转移到硝酸纤维素膜上；第四步，将凝胶中的蛋白转移到硝酸纤维素膜上；n第五步，将抗体（一抗）与硝酸纤维素膜上的蛋白杂交，这第五步，将抗体（一抗）与硝酸纤维素膜上的蛋白杂交，这时抗体（一抗）与目的基因表达的蛋白（抗原）会特异结合。时抗体（一抗）与目的基因表达的蛋白（抗原）会特异结合。n 由于这种抗原由于这种抗原抗体的结合显示不出条带，所以加入一抗体的结合显示不出条带，所以加入一种称为
32、二抗的抗体，它可以与一抗结合，二抗抗体上带有特种称为二抗的抗体，它可以与一抗结合，二抗抗体上带有特殊的标记。如果目的基因表达出了蛋白质，则结果为阳性。殊的标记。如果目的基因表达出了蛋白质，则结果为阳性。第38页，此课件共48页哦归纳步骤第39页，此课件共48页哦 目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定检测检测步骤步骤目的目的方法方法原理原理工具工具现象现象1 1DNADNA分子杂分子杂交技术交技术碱基互碱基互补配对补配对放射性同位素作放射性同位素作标记的含目的基标记的含目的基因的因的DNADNA片段片段杂交带杂交带2 2检测目的基因是检测目的基因是否转录出了否转录出了mRNAmRNADNAD
33、NA分子杂分子杂交技术交技术碱基互碱基互补配对补配对放射性同位素作放射性同位素作标记的含目的基标记的含目的基因的因的DNADNA片段片段杂交带杂交带3 3检测目的基因是检测目的基因是否翻译成蛋白质否翻译成蛋白质抗原抗原-抗体抗体杂交杂交抗体的抗体的专一性专一性特定抗体特定抗体杂交带杂交带(阳阳性反应性反应)检测转基因生物的染色检测转基因生物的染色体体DNA上是否插入了上是否插入了目的基因目的基因2023/4/32023/4/34040第40页，此课件共48页哦归纳:基因工程的基本操作程序1.1.获取目的基因获取目的基因u从基因文库从基因文库u利用利用PCRPCRu化学方法人工合成化学方法人工合
34、成2.2.构建基因表达载体构建基因表达载体u目的基因、启动子、终止子、标记基因目的基因、启动子、终止子、标记基因3.3.将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞u农杆菌转化法、显微注射法农杆菌转化法、显微注射法4.4.目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定u检测：是否插入、转录、翻译检测：是否插入、转录、翻译u鉴定：鉴定：第41页，此课件共48页哦2023/4/32023/4/34242第42页，此课件共48页哦寻根问底P9为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗？提示：构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是惟一提示：构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是
35、惟一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过PCRPCR方方式从含有该基因的生物的式从含有该基因的生物的DNA中，直接获得，也可以通过反转录，用PCRPCR方式从mRNAmRNA中获得，不一定要构建基因文库。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。2023/4/32023/4/34343第43页，此课件共48页哦寻根
36、问底：将目的基因直接导入受体细胞不是更简便吗？如果将目的基因直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，结果会怎样？这么做，结果会怎样？P11P11提示：有人采用总提示：有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物中的总DNADNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行表达载体的构建，这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因导入了受体植物。此法目前争议颇多，严格来讲不算基因工程。4444第44页，此课件共48页哦思考与探究：1.作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启
37、动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：（1 1 1 1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；子才能比较有利于基因的表达；子才能比较有利于基因的表达；子才能比较有利于基因的表达；（2 2 2 2）通过通过通过通过cDNAcDNAcDNAcDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生文库获得的目的基因没有启动子，只将编
38、码序列导入受体生文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；物中无法转录；物中无法转录；物中无法转录；（3 3 3 3）目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；（4 4 4 4）为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等；如增强子等；如增强子等；如增
39、强子等；（5 5 5 5）有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。绿色荧光蛋白基因等。绿色荧光蛋白基因等。绿色荧光蛋
40、白基因等。4545第45页，此课件共48页哦思考与探究2.根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理,你能分析出不能导入单子叶植物的原因吗?若将一个抗病基因导入小麦中,理论上讲你应该怎样做?要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；都可以侵染单子叶植物；要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的Vir区（诱导）的基因，使T-DNA转移并插入到染色体DNA上。2023/4/32023/4/34646第46页，此课件共48页哦3.3.利用大肠杆菌可以生产出人的胰
41、岛素，联系前面有关细胞器利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的
42、。在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。思考与探究：思考与探究：2023/4/32023/4/34747第47页，此课件共48页哦（1）从小鼠中克隆出-珠蛋白基因的编码序列（cDNA）。（2 2）将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。（3 3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大大肠杆菌会因不含有抗四环素
43、基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明肠杆菌菌落，则表明-珠蛋白基因已进入其中。珠蛋白基因已进入其中。（4 4）培养进入了）培养进入了-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取提取-珠蛋白。珠蛋白。4.-4.-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的-珠蛋白，珠蛋白，想一想，应如何进行设计？想一想，应如何进行设计？2023/4/32023/4/34848第48页，此课件共48页哦