《SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的相对分子质量.pptx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的相对分子质量.pptx（27页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、【目的】学习学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。测定蛋白质分子量的原理。掌握垂直板电泳的操作方法。掌握垂直板电泳的操作方法。运用运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量及染色鉴定。测定蛋白质分子量及染色鉴定。第1页/共27页【原理】在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷基硫酸钠（量的十二烷基硫酸钠（SDS），使蛋白样品与），使蛋白样品与SDS结合形成带负电荷的复合物，由于复合物结合形成带负电荷的复合物，由于复合物分子量的不同，在电泳中反应出不同的迁移率。分子量的不同，在电泳中反应出不同的迁移率。根据标准样品在该系统电泳中所作出的标准曲根据标准样品在该系统
2、电泳中所作出的标准曲线，推算出被测蛋白样品分子量的近似值。线，推算出被测蛋白样品分子量的近似值。第2页/共27页 在蛋白质混合样品中各蛋白质组分的分子大小在蛋白质混合样品中各蛋白质组分的分子大小和形状以及所带电荷多少等因素所造成的电泳迁移率有和形状以及所带电荷多少等因素所造成的电泳迁移率有差别。在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷差别。在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷基硫酸钠（基硫酸钠（SDS），形成蛋白质），形成蛋白质SDS复合物，这种复合物，这种复合物由于结合了大量的复合物由于结合了大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的，使蛋白质丧失了原有的电荷状态，形成了仅保持原有分子大小为
3、特征的负离子电荷状态，形成了仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间的天然的团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间的天然的电荷差异，此时，蛋白质分子的电荷差异，此时，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于电泳迁移率主要取决于它的分子量大小它的分子量大小，而其它因素对电泳迁移率的影响几乎，而其它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。可以忽略不计。第3页/共27页电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。混合样品带孔胶 按分子大小分离电泳方向 电泳 小分子大分子第4页/共27页夹在两块玻璃板之间的凝胶 电泳缓冲液 电
4、泳缓冲液 加在槽中的经SDS处理的样品分子量小分子量大电源第5页/共27页 当蛋白质的分子量在当蛋白质的分子量在15000200000之间时，之间时，电泳迁移率与分子量的自然对数值呈反比，符合下列方电泳迁移率与分子量的自然对数值呈反比，符合下列方程：程：lnMr=bmR+K 式式中中：Mr为为蛋蛋白白质质分分子子量量，mR为为相相对对迁迁移移率率，b为为斜斜率，率，K为截距。在条件一定时，为截距。在条件一定时，b 和和K均为常数。均为常数。若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，可获得一条量的对数作图，可获得一条标准曲线标准曲线。未知蛋白质
5、在相。未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。线上求得分子量。第6页/共27页标准蛋白分子量未知蛋白在一定的凝胶浓度下，多肽链分子量的对数与多肽链的相对迁移率成线性关系，所以可以通过标准曲线求未知多肽链分子量。相对迁移率第7页/共27页【实验器材】直流稳压电泳仪直流稳压电泳仪垂直平板电泳槽垂直平板电泳槽移液器移液器微量注射器微量注射器烧杯、试管、滴管、培养皿、直尺等烧杯、试管、滴管、培养皿、直尺等第8页/共27页第9页/共27页第10页/共27页第11页/共27页第12页/共27页【实验试剂】凝胶贮备液凝胶贮
6、备液分离胶缓冲液分离胶缓冲液浓缩胶缓冲液浓缩胶缓冲液10%SDS2倍还原缓冲液倍还原缓冲液第13页/共27页【实验试剂】电极缓冲液电极缓冲液10%过硫酸铵过硫酸铵染色液染色液脱色液脱色液第14页/共27页【实验试剂】低分子量标准蛋白：低分子量标准蛋白：兔磷酸化酶兔磷酸化酶B Mr=97,400 牛血清白蛋白牛血清白蛋白 Mr=66,200 兔肌动蛋白兔肌动蛋白 Mr=43,000 牛碳酸酐酶牛碳酸酐酶 Mr=31,000 胰蛋白酶抑制剂胰蛋白酶抑制剂 Mr=20,100 鸡蛋清溶菌酶鸡蛋清溶菌酶 Mr=14,400第15页/共27页一、装板一、装板 将将垂垂直直板板型型电电泳泳装装置置内内的的
7、板板状状凝凝胶胶模模子子取取出出，将将玻玻璃璃片片洗洗净净、凉凉干干、嵌嵌入入凹凹槽槽中中，形形成成一一个个“夹夹心心”凝凝胶胶腔腔，把把装装好好的的凝凝胶胶腔腔置置于于仰仰放放的的电电极极上上槽槽。将将电电泳泳槽槽、凝凝胶胶模模子子串串成成一一体体的的垂垂直直板板型型电电泳泳装装置置，垂垂直直放放置置在在水水平平台台面上，灌注胶液。面上，灌注胶液。【操作方法】第16页/共27页二、分离胶的配制二、分离胶的配制（12%）试剂试剂 体积体积 H2O3.35（ml）凝胶贮备液凝胶贮备液2.5（ml）分离胶缓冲液分离胶缓冲液(pH8.8)2.5（ml）10%SDS 0.1（ml）TEMED 5（ul
8、）10%过硫酸铵过硫酸铵 50（ul）总体积总体积10（ml）第17页/共27页三、分离胶的灌注和聚合三、分离胶的灌注和聚合 用用移移液液管管将将所所配配制制的的分分离离胶胶缓缓冲冲液液沿沿着着凝凝胶胶腔腔的的长长玻玻璃璃板板的的内内面面缓缓缓缓注注入入，留留出出梳梳齿齿的的齿齿高高加加1cm的的空空间间以以便便灌灌注注浓浓缩缩胶胶，然然后后加加满满蒸蒸馏馏水水。待待分分离离胶胶凝凝固后，倒出蒸馏水，用滤纸吸干。固后，倒出蒸馏水，用滤纸吸干。第18页/共27页四、浓缩胶的配制四、浓缩胶的配制（5%）试剂试剂 体积体积 H2O2.92（ml）凝胶贮备液凝胶贮备液0.8（ml）分离胶缓冲液分离胶缓
9、冲液(pH6.8)1.25（ml）10%SDS 0.05（ml）TEMED 5（ul）10%过硫酸铵过硫酸铵 25（ul）总体积总体积5.05（ml）第19页/共27页五、浓缩胶的灌注和聚合五、浓缩胶的灌注和聚合 用用移移液液管管将将所所配配制制的的浓浓缩缩胶胶缓缓冲冲液液沿沿着着凝凝胶胶腔腔的的长长玻玻璃璃板板的的内内面面缓缓缓缓注注入入，将将梳梳子子插插入入胶胶液液顶顶部部，放放置置室室温温下下待待其其聚合。聚合。第20页/共27页六、样品的准备六、样品的准备 在在低低分分子子量量标标准准蛋蛋白白质质和和待待测测样样品品中中分分别别加加入入适适量量还还原原缓缓冲冲液液，放放入入沸沸水水浴中
10、加热浴中加热35min，取出冷至室温。，取出冷至室温。第21页/共27页七、加样七、加样 加加入入电电极极缓缓冲冲液液，小小心心拔拔出出梳梳齿齿，用用微微量量注注射射器器向向凝凝胶胶梳梳孔孔内内加加样样。同同 时时 加加 入入Marker。加样样品迁移方向第22页/共27页八、电泳八、电泳 上上槽槽接接负负极极，下下槽槽接接正正极极，打打开开直直流流电电源源，刚刚开开始始时时，电电压压控控制制在在不不高高于于100V，样样品品进进入入分分离离胶胶后后，电电压压控控制制在在不不高高于于140V。待待指指示示剂剂染染料料靠靠迁迁移移至至下沿下沿1处停止电泳。处停止电泳。第23页/共27页九、染色和
11、脱色九、染色和脱色小心将胶取出，放入一大培养皿中。小心将胶取出，放入一大培养皿中。染色：染色：加入染色液，置于摇床上染色加入染色液，置于摇床上染色2h。脱脱色色：染染色色完完毕毕，倒倒出出染染色色液液，加加入入脱脱色色液液，置置于于摇摇床床上上脱脱色色，数数小小时时更更换换一一次次脱色液，直至背景清晰，拍照。脱色液，直至背景清晰，拍照。第24页/共27页十、相对分子质量的计算十、相对分子质量的计算 量量出出分分离离胶胶顶顶端端距距溴溴酚酚蓝蓝间间的的距距离离(cm)以以及及各各蛋蛋白白质质样样品品区区带带中中心心与与分分离离胶顶端的距离胶顶端的距离(cm)，按下式计算相对迁移率，按下式计算相对
12、迁移率mR:相对迁移率mR=以标准蛋白质分子量的对数对相对迁移率作图，得到标准曲线，根据待测样以标准蛋白质分子量的对数对相对迁移率作图，得到标准曲线，根据待测样品相对迁移率，从标准曲线上计算出其分子量。品相对迁移率，从标准曲线上计算出其分子量。蛋白质样品距分离胶顶端迁移距离(cm)溴酚蓝区带中心距分离胶顶端距离(cm)第25页/共27页思考题思考题在不连续体系在不连续体系SDS-PAGE中，当分离胶加完后，需在其上加一层水，为什么中，当分离胶加完后，需在其上加一层水，为什么?电极缓冲液中甘氨酸的作用电极缓冲液中甘氨酸的作用?在在不不连连续续体体系系SDS-PAGE中中，分分离离胶胶与与浓浓缩缩胶胶中中均均含含有有TEMED和和AP，试试述述其其作用作用?样品液为何在加样前需在沸水中加热几分钟样品液为何在加样前需在沸水中加热几分钟?第26页/共27页感谢您的观看！第27页/共27页