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1、关于基因工程的基本操作程序(2)第一张，PPT共五十一页，创作于2022年6月基因工程基本操作的四个步骤1 1、目的基因的获取、目的基因的获取2 2、基因表达载体的构建、基因表达载体的构建3 3、目的基因导入受体细胞、目的基因导入受体细胞4 4、目的基因的检测与鉴定、目的基因的检测与鉴定有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用 载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。1.2 基因工程的基本操作程序第二张，PPT共五十一页，创作于20
2、22年6月第三张，PPT共五十一页，创作于2022年6月一、目的基因的获取1目的基因主要是主要是编码蛋白质的基因编码蛋白质的基因：如：与生物抗性相关的基因、与优良品质相关的基因、与生物药物和保健品相关的基因、与毒物降解相关的基因、与工业用酶相关的基因、具调控作用的因子等。2获取目的基因的常用方法：1、从已有物种中分离：如从基因文库中获取2、利用PCR技术扩增目的基因3、人工合成目的基因第四张，PPT共五十一页，创作于2022年6月1.从基因文库中获取目的基因1).基因文库的概念:将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。基因文库的种类:
3、基因组文库：含有一种生物的全部基因部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，如：cDNA文库第五张，PPT共五十一页，创作于2022年6月基因组文库1.从基因文库中获取目的基因各个受体菌分别含有这种生物各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。的不同基因。受体菌群受体菌群包含了包含了这种生物所有的基因，这种生物所有的基因，该受该受体菌群称为这种生物的基因体菌群称为这种生物的基因组文库。组文库。受体菌群受体菌群包含了一种包含了一种生物部分基因生物部分基因。部分基因文库第六张，PPT共五十一页，创作于2022年6月2.利用PCR技术扩增目的基因1概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物
4、在生物_复制复制_的核酸合成技术。的核酸合成技术。2模板DNA；两种引物；4种脱氧核苷酸；热稳定DNA聚合酶（Taq酶）；ATP等多聚酶链式反应多聚酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段3前提：前提：已知目的基因的一段核苷酸序列原理：DNA复制条件：第七张，PPT共五十一页，创作于2022年6月4 PCR技术的操作过程a a、DNADNA变性变性（90-9590-95）：双）：双链链DNADNA模板模板高温解旋高温解旋，_断断裂，形成裂，形成_b b、复性、复性（55-6555-65）：系统）：系统温度降低，温度降低，引物引物与与DNADNA模板结合，模板结合，形成局部形成局部_。c
5、c、延伸、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶酶的作用下，合成与模板互补的作用下，合成与模板互补的的_。氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链d.重复重复a.b.ca.b.c步骤：每重复一步骤：每重复一次，目的基因增加次，目的基因增加_倍，成指倍，成指数形式扩增（数形式扩增（2 2n n)。一第八张，PPT共五十一页，创作于2022年6月PCR技术的操作过程第九张，PPT共五十一页，创作于2022年6月PCR技术扩增与DNA复制的比较DNA复制PCR技术场所原理条件解旋方式酶特点结果碱基互补配对原则碱基互补配对原则四种脱氧核苷酸、模板、酶、ATP、适宜的温度和PH
6、四种脱氧核苷酸、模板、酶、ATP、适宜的温度和适宜的温度和PHPH、两两种种引物DNA在高温下变性解旋解旋酶催化解旋半保留复制、边解旋边复制半保留复制、全解旋再复制体外复制主要在细胞核内大量的DNA片段形成整个DNA分子热稳定的DNA聚合酶细胞内的DNA聚合酶、解旋酶等第十张，PPT共五十一页，创作于2022年6月3.人工合成法 在基因较小，核苷酸序列已知的情况下，可以利用DNA合成仪人工合成蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列基因的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因目的基因化学合成化学合成推测推测推测推测化学合成法化学合成法反转录法反转录法目的基因的目
7、的基因的mRNAmRNARNA-DNARNA-DNA杂交双链杂交双链双链双链双链双链DNADNADNADNA(即目的基因即目的基因即目的基因即目的基因)DNADNADNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶反转录酶反转录酶第十一张，PPT共五十一页，创作于2022年6月二、基因表达载体的构建 基因工程的核心1 使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。2基因表达载体的组成：目的：目的基因+启动子+终止子+标记基因等第十二张，PPT共五十一页，创作于2022年6月表达载体目的基因：编码蛋白质的基因启动子：位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，以
8、驱动目的基因转录出mRNA终止子：位于基因的尾端，能终止mRNA的转录标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来第十三张，PPT共五十一页，创作于2022年6月用用_切割目的基因和质粒，使其生切割目的基因和质粒，使其生 。用用_将目的基因插入将目的基因插入质粒切口处，形成了一个重组质粒切口处，形成了一个重组DNADNA分子分子(重组质粒重组质粒)。同种限制酶同种限制酶相同相同黏性末端黏性末端DNADNA连接酶连接酶3.3.表达载体的构建方法：表达载体的构建方法：不同受体细胞其构建方法不不同受体细胞其构建方法不完全相同完全相同第十四张，PPT共五十一页，创
9、作于2022年6月注意：载体载体与与表达载体表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分点两部分DNADNA片段。表达载体在载体基础上增加了片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、目的基因、启动子、终止子启动子、终止子三部分结构三部分结构用到的工具酶：用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到既用到限制酶切割载体，又用到DNADNA连接连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键键启动子、终止子启动子、终止子对于目的基因表达必不可少对于目的基因表达必不可少目的基因不能单独进入受体细胞，目
10、的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式必需以表达载体的方式携带进去。携带进去。第十五张，PPT共五十一页，创作于2022年6月 三、将目的基因导入受体细胞1 目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定（复制）和表达（转录和翻译）的过程。2大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。转化：常用的受体细胞：第十六张，PPT共五十一页，创作于2022年6月1、目的基因导入植物细胞（体细胞）的方法（1）农杆菌转化法 易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力。Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。农杆菌特点：原理：第十七张
11、，PPT共五十一页，创作于2022年6月三、目的基因导入受体细胞三、目的基因导入受体细胞过程：植物组织培养技术第十八张，PPT共五十一页，创作于2022年6月1、目的基因导入植物细胞的方法（2）基因枪法：目的基因导入单子叶植物细胞（3）花粉管通道法：将目的基因导入植物细胞 例：转基因抗虫棉第十九张，PPT共五十一页，创作于2022年6月2、将目的基因导入动物细胞（动物受精卵）方法：方法：程序程序 为什么将目的基因导入动物为什么将目的基因导入动物细胞常用的受体细胞是受精卵？细胞常用的受体细胞是受精卵？含目的基因的表达载体取动物的受精卵含目的基因的受精卵转基因动物显微注射发育显微注射法第二十张，P
12、PT共五十一页，创作于2022年6月3、将目的基因导入微生物细胞微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少常用菌：大肠杆菌常用法：Ca2+处理获得感受态细胞过程：CaCa2+2+处理处理大肠杆菌大肠杆菌感受态感受态 细胞细胞感受态细胞感受态细胞 吸收吸收DNADNA表达载体表达载体与感受态与感受态细胞混合细胞混合第二十一张，PPT共五十一页，创作于2022年6月 四、目的基因的检测与鉴定导入过程完成后，全部受体细胞都能摄导入过程完成后，全部受体细胞都能摄 入重入重组组DNADNA分子吗？分子吗？1真正能摄入重组真正能摄入重组DNADNA分子的受体细胞很少。分子的受体细胞很少。2目
13、的基因进入受体细胞后，是否都能稳定目的基因进入受体细胞后，是否都能稳定维持和表达？维持和表达？不一定，需要检测不一定，需要检测第二十二张，PPT共五十一页，创作于2022年6月1、鉴定分子水平的鉴定转基因生物的DNA（目的基因）探针15N N15N N14N N14N N（1）导入检测：是目的基因能否在受体细胞内稳定遗传的关键。基因探针：用用放射性同位素标记放射性同位素标记的目的基因片段的目的基因片段方法DNA分子杂交技术(DNA与DNA)变性变性变性变性第二十三张，PPT共五十一页，创作于2022年6月第二十五张，PPT共五十一页，创作于2022年6月1、鉴定分子水平的鉴定变性变性方法 分子
14、杂交技术（DNA与mRNA杂交）（2）转录检测（目的基因）探针15N N15N N转基因生物的mRNA14N N第二十六张，PPT共五十一页，创作于2022年6月与相应抗体与相应抗体杂交杂交1、鉴定分子水平的鉴定（3）翻译检测方法抗原-抗体杂交提取转基因提取转基因生物的蛋白生物的蛋白质质显出杂交带显出杂交带（表明目的基因已形成蛋白（表明目的基因已形成蛋白质产品）质产品）第二十七张，PPT共五十一页，创作于2022年6月2、鉴定个体水平的鉴定抗虫、抗病接种实验，活性比较实验例：用棉铃饲喂棉铃虫，例：用棉铃饲喂棉铃虫，A.A.虫吃后中毒死亡，说明摄入了抗虫吃后中毒死亡，说明摄入了抗虫基因并得到表达
15、。虫基因并得到表达。B.B.虫吃后不出现中毒症状，虫吃后不出现中毒症状，说明说明:未摄入目的基因未摄入目的基因摄入目的基因未表达。摄入目的基因未表达。目的基因表达的标志：目的基因在受体细胞内转录、翻译合成相应的蛋白质，并赋予其特定性状。第二十九张，PPT共五十一页，创作于2022年6月第三十张，PPT共五十一页，创作于2022年6月归纳:基因工程的基本操作程序1.获取目的基因u从基因文库u利用PCR技术扩增目的基因u人工合成（反转录法，化学人工合成）2.构建基因表达载体u目的基因、启动子、终止子、标记基因等3.将目的基因导入受体细胞u农杆菌转化法、显微注射法、Ca2+处理法4.目的基因的检测与
16、鉴定u检测(分子水平检测)：是否插入、转录、翻译u鉴定（个体水平鉴定）：抗虫、抗病的接种实验第三十一张，PPT共五十一页，创作于2022年6月课堂练习1 1、有关基因工程的叙述中，错误的是有关基因工程的叙述中，错误的是()()A A、DNADNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B B、限制性内切酶用于目的基因的获得、限制性内切酶用于目的基因的获得 C C、目的基因须由运载体导入受体细胞、目的基因须由运载体导入受体细胞 D D、人工合成目的基因不用限制性内切酶、人工合成目的基因不用限制性内切酶A第三十二张，PPT共五十一页，创作于2022年6月课堂练习2 2、下
17、列属于获取目的基因的方法的是下列属于获取目的基因的方法的是()()利用利用mRNAmRNA反转录形成反转录形成 从基因组文库中提取从基因组文库中提取 从受体细胞中提取从受体细胞中提取 利用利用PCRPCR技术技术 利用利用DNADNA转录转录 人工合成人工合成 A.B.A.B.C.D.C.D.D第三十三张，PPT共五十一页，创作于2022年6月课堂练习3 3、有关基因工程的叙述正确的是、有关基因工程的叙述正确的是 （）A A、限制酶只在获得目的基因时才用、限制酶只在获得目的基因时才用 B B、重组质粒的形成在细胞内完成、重组质粒的形成在细胞内完成 C C、质粒都可作为运载体、质粒都可作为运载体
18、 D D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料料D第三十四张，PPT共五十一页，创作于2022年6月课堂练习4(2009年高考浙江卷年高考浙江卷)下列关于基因工程的叙下列关于基因工程的叙述，错误的是述，错误的是()A目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物生物B限制酶和限制酶和DNA连接酶是连接酶是两类两类常用的工具常用的工具酶酶C人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性原无生物活性D载体上的抗性基因有利于筛选含重组载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞和促进目的基
19、因的表达的细胞和促进目的基因的表达D D第三十六张，PPT共五十一页，创作于2022年6月提取某种生物的提取某种生物的全部全部DNADNA用适当的限制酶酶切用适当的限制酶酶切一定大小的一定大小的DNADNA片段片段将将DNADNA片段与载体连接片段与载体连接重组载体重组载体基因组文库基因组文库导入受体菌中储存导入受体菌中储存（2 2）.基因文库的构建方法基因文库的构建方法基因组文库的构建基因组文库的构建第三十七张，PPT共五十一页，创作于2022年6月基因组DNA文库与cDNA文库某生物体内全部某生物体内全部DNADNA 许多许多DNADNA片段片段受体菌群体受体菌群体限制酶限制酶与运载体连接
20、导入与运载体连接导入基因组文库基因组文库cDNAcDNA反转录反转录受体菌群体受体菌群体与运载体连接导入与运载体连接导入cDNA文库文库某种生物某个时期的某种生物某个时期的mRNAmRNA第三十八张，PPT共五十一页，创作于2022年6月基因的结构非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区RNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点外显子外显子内含子内含子终止子终止子启动子启动子原核原核真核真核第三十九张，PPT共五十一页，创作于2022年6月原核细胞的基因结构非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 与与RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点启动子启动
21、子终止子终止子不编码蛋白质。不编码蛋白质。：编码蛋白质：编码蛋白质 ,连续不间断连续不间断编码区编码区非编码区非编码区调控遗传信息表达调控遗传信息表达,上上 游的游的RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点:基基因因结结构构第四十张，PPT共五十一页，创作于2022年6月真核细胞的基因结构编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区内含子内含子 外显子外显子 启动子启动子终止子终止子编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 编码区编码区非编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用：有调控作用,上游有上
22、游有RNARNA聚合聚合 酶结合位点酶结合位点(启动子启动子)。与与RNARNA聚合酶结聚合酶结合位点合位点基基因因结结构构第四十一张，PPT共五十一页，创作于2022年6月原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞不同点不同点编码区是编码区是_的，边的，边_边边_编码区是间隔的、编码区是间隔的、_的，先的，先_后后_相同点相同点都由能够编码蛋白质的都由能够编码蛋白质的_和具有和具有调控作用的调控作用的_区组成的区组成的连续连续不连续不连续编码区编码区非编码非编码转录转录翻译翻译转录转录翻译翻译第四十二张，PPT共五十一页，创作于2022年6月基因文库的构建方法 基因组文
23、库的构建基因组文库的构建提取某种生物的提取某种生物的全部全部DNADNA用适当的限制酶酶切用适当的限制酶酶切一定大小的一定大小的DNADNA片段片段将将DNADNA片段与载体连接片段与载体连接重组载体重组载体基因组文库基因组文库导入受体菌中储存导入受体菌中储存第四十三张，PPT共五十一页，创作于2022年6月 cDNA文库的构建文库的构建-逆转录法：逆转录法：提取某种生物的某器官或提取某种生物的某器官或特特定定发育时期的发育时期的mRNAmRNA单链单链DNADNA双链双链cDNAcDNA片段片段重组载体重组载体与载体连接与载体连接cDNAcDNA文库文库反（逆）转录酶反（逆）转录酶DNADN
24、A聚合酶聚合酶导入受体菌中储存导入受体菌中储存第四十四张，PPT共五十一页，创作于2022年6月思考？思考？真核生物的基因用逆转录法得到的真核生物的基因用逆转录法得到的cDNAcDNA与原基因相同吗？与原基因相同吗？第四十五张，PPT共五十一页，创作于2022年6月真核细胞的cDNA的获取编码区编码区编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区DNA聚合酶聚合酶剪接有关的酶剪接有关的酶RNA聚合酶聚合酶mRNA前体前体mRNA单链单链DNAcDNA逆转录酶逆转录酶转录转录剪接剪接逆转录逆转录复制复制启动子启动子启动子启动子终止子终止子基因基因不含不含非编码序非编
25、码序列列。即不含。即不含非编码区非编码区和和内含子内含子第四十六张，PPT共五十一页，创作于2022年6月基因组DNA文库与cDNA文库的比较 文库类型文库类型 cDNA文库文库 基因组文库基因组文库 文库大小文库大小基因中启动子（具有启基因中启动子（具有启动作用的动作用的DNA片段）片段）基因中内含子基因中内含子(位于编位于编码蛋白质序列的非编码码蛋白质序列的非编码DNA片段）片段）基因多少基因多少 物种间的基因交流物种间的基因交流小小大大无无有有无无有有某种生物的部分基因某种生物的部分基因某种生物的全部基因某种生物的全部基因可以可以部分基因可以部分基因可以第四十七张，PPT共五十一页，创作
26、于2022年6月PCR技术的操作过程PCRPCR反应体系中目的基因成反应体系中目的基因成反应体系中目的基因成反应体系中目的基因成指数指数指数指数(2(2n n)形式扩增形式扩增形式扩增形式扩增第四十八张，PPT共五十一页，创作于2022年6月小结：将目的基因导入受体细胞生物种类生物种类植物细胞植物细胞动物细胞动物细胞微生物细胞微生物细胞常用方法常用方法农杆菌转化法农杆菌转化法显微注射技术显微注射技术CaCa2+2+处理法处理法受体细胞受体细胞体细胞体细胞受精卵受精卵原核细胞原核细胞转化过程转化过程将目的基因插入到将目的基因插入到TiTi质粒的质粒的T-DNAT-DNA上上农杆菌农杆菌导入植物导
27、入植物细胞细胞整合到受体整合到受体细胞的细胞的DNADNA表达表达将含有目的基因将含有目的基因的表达载体提纯的表达载体提纯取卵（受精卵）取卵（受精卵）显微注射显微注射受受精卵发育精卵发育获得获得具有新性状的动具有新性状的动物物CaCa2+2+处理细胞处理细胞感受态细胞感受态细胞重组表达载重组表达载体与感受态细体与感受态细胞混合胞混合感受感受态细胞吸收态细胞吸收DNADNA分子分子第四十九张，PPT共五十一页，创作于2022年6月提取目的基因的提取目的基因的mRNAmRNA单链单链DNADNA双链双链DNADNA（目的基因）（目的基因）重组载体重组载体与载体连接cDNAcDNA文库文库反（逆）转录酶DNA聚合酶导入受体菌中储存 cDNA文库的构建-逆转录法：第五十张，PPT共五十一页，创作于2022年6月感谢大家观看第五十一张，PPT共五十一页，创作于2022年6月