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1、关于病毒与细胞的相互作用现在学习的是第1页，共46页第四章第四章 病毒与细胞间的相互作用病毒与细胞间的相互作用第一节第一节 病毒的细胞培养病毒的细胞培养第二节第二节 病毒与细胞的相互作用病毒与细胞的相互作用现在学习的是第2页，共46页第一节第一节 病毒的细胞培养病毒的细胞培养 病毒是严格的细胞内寄生微生物，培养病毒必病毒是严格的细胞内寄生微生物，培养病毒必须使用细胞。根据病毒的不同选用敏感动物（须使用细胞。根据病毒的不同选用敏感动物（动物动物接种接种）、鸡胚（）、鸡胚（鸡胚接种鸡胚接种）或离体细胞进行分离培）或离体细胞进行分离培养（养（细胞培养细胞培养）。）。现在学习的是第3页，共46页一、动
2、物接种一、动物接种接种后通常以动物发病、死亡作为感染的指标。接种后通常以动物发病、死亡作为感染的指标。按病毒侵袭部位不同选择适当的接按病毒侵袭部位不同选择适当的接种途径。嗜神经病毒接种在小鼠的种途径。嗜神经病毒接种在小鼠的脑内。痘苗病毒和单纯疱疹病毒接脑内。痘苗病毒和单纯疱疹病毒接种于家兔角膜。种于家兔角膜。现在学习的是第4页，共46页动物接种的优缺点：动物接种的优缺点：优点：优点：（1）不需要复杂的仪器设备；不需要复杂的仪器设备；（2）技术简单；）技术简单；（3）易成功）易成功缺点：缺点：（1）个体差异大）个体差异大 （2）价格昂贵）价格昂贵 （3）数量有限）数量有限 （4）需要隔离畜舍）需
3、要隔离畜舍现在学习的是第5页，共46页二、鸡胚接种二、鸡胚接种一种比较经济简便的方法。一种比较经济简便的方法。卵壳卵壳壳膜壳膜现在学习的是第6页，共46页接种途径接种途径 绒毛尿囊膜接种绒毛尿囊膜接种 9-13日龄日龄尿囊腔接种尿囊腔接种 9-10 日龄日龄 卵黄囊接种卵黄囊接种 6-8日龄日龄 羊膜腔接种羊膜腔接种 10日龄日龄 脑内接种脑内接种 10日龄日龄现在学习的是第7页，共46页 1气室气室 2卵壳卵壳 3卵黄囊卵黄囊 4卵白卵白 5 尿囊腔尿囊腔 6绒毛尿囊绒毛尿囊 7胚胎胚胎 8羊水腔羊水腔 9胚胎外腔胚胎外腔现在学习的是第8页，共46页现在学习的是第9页，共46页现在学习的是第
4、10页，共46页鸡胚接种的优缺点：鸡胚接种的优缺点：优点：优点：技术简单、来源充沛、价格低廉、数量可大，技术简单、来源充沛、价格低廉、数量可大，不需特殊设备不需特殊设备 缺点：缺点：很多病毒不能适应，主要是哺乳动物的病毒。很多病毒不能适应，主要是哺乳动物的病毒。现在学习的是第11页，共46页 细细胞胞培培养养(cell culture)是是指指利利用用机机械械、酶酶或或化化学学方方法法使使动动物物组组织织或或传传代代细细胞胞分分散散成成单单个个乃乃至至24个个细细胞胞团团悬悬液液进进行行培培养。养。三、细胞培养三、细胞培养现在学习的是第12页，共46页n每个细胞生理特性基本一致，对病毒易感性相
5、等每个细胞生理特性基本一致，对病毒易感性相等n无个体差异，准确性和重复性好无个体差异，准确性和重复性好n可严格执行无菌操作可严格执行无菌操作n细胞培养本身就能显示病毒的生长特征细胞培养本身就能显示病毒的生长特征n应用空斑技术可进行病毒的克隆化应用空斑技术可进行病毒的克隆化优点：优点：现在学习的是第13页，共46页根据细胞来源、染色体特征及传代次数，可分为三种类型：根据细胞来源、染色体特征及传代次数，可分为三种类型：n原原代代细细胞胞：动动物物组组织织经经胰胰蛋蛋白白酶酶消消化化处处理理，使使细细胞胞分分散散而而得得到到的细胞。的细胞。n二二倍倍体体细细胞胞：将将长长成成单单层层的的原原代代细细
6、胞胞消消化化分分散散成成单单个个细细胞胞，继继续续培培养养传传代代，其其染染色色体体数数与与原原代代细细胞胞一一样样，保保持持其其二二倍倍染染色体数目的细胞，称为二倍体细胞。色体数目的细胞，称为二倍体细胞。n传代细胞：传代细胞：能在体外持续增殖传代的细胞，大多数由癌细胞或二能在体外持续增殖传代的细胞，大多数由癌细胞或二倍体细胞突变而成。倍体细胞突变而成。（一）细胞的类型（一）细胞的类型现在学习的是第14页，共46页（二）细胞培养的方法（二）细胞培养的方法1.静置培养：静置培养：实验室常用。细胞悬液装瓶，实验室常用。细胞悬液装瓶，5%CO2温箱静置培养，细胞沉降并贴附在玻面上生长分裂，温箱静置培
7、养，细胞沉降并贴附在玻面上生长分裂，最后长成单层。最后长成单层。2.旋转培养：旋转培养：大规模生产疫苗。细胞在玻瓶内生长时，大规模生产疫苗。细胞在玻瓶内生长时，玻瓶不断缓慢旋转，细胞贴附于玻瓶四周，长成单层。玻瓶不断缓慢旋转，细胞贴附于玻瓶四周，长成单层。3.悬浮培养悬浮培养4.微载体培养：微载体培养：悬浮、微载体悬浮、微载体现在学习的是第15页，共46页第二节第二节 病毒与细胞的相互作用病毒与细胞的相互作用n杀细胞感染杀细胞感染n非杀细胞感染非杀细胞感染 引致持续感染，对细胞代谢无影响。引致持续感染，对细胞代谢无影响。nRNARNA干扰干扰 n产生干扰素产生干扰素 现在学习的是第16页，共4
8、6页生产性感染（生产性感染（productive）：）：病毒感染后能产生完整病毒感染后能产生完整的子代病毒颗粒。宿主细胞感染病毒发生的变化可能的子代病毒颗粒。宿主细胞感染病毒发生的变化可能是细胞死亡或细胞转化。是细胞死亡或细胞转化。非生产性感染（非生产性感染（nonproductive）或称顿挫感染或称顿挫感染（abortive infection）:病毒感染后不形成完整的病毒颗病毒感染后不形成完整的病毒颗粒。粒。持续性感染（持续性感染（persistent infection）:持续长时间的感持续长时间的感染，感染过程中不形成感染性的病毒颗粒。染，感染过程中不形成感染性的病毒颗粒。现在学习的
9、是第17页，共46页现在学习的是第18页，共46页病病毒毒在在宿宿主主易易感感细细胞胞内内增增殖殖造造成成细细胞胞损损伤伤与与死死亡亡，这这种种感感染染称为称为杀细胞性变化杀细胞性变化。一、病毒引致的杀细胞变化一、病毒引致的杀细胞变化杀细胞变化杀细胞变化现在学习的是第19页，共46页由病毒感染导致的细胞损伤。由病毒感染导致的细胞损伤。CPECPE能在光学显微镜下观察。能在光学显微镜下观察。细胞圆缩，如痘病毒和呼肠孤病毒等；细胞圆缩，如痘病毒和呼肠孤病毒等；细胞聚合，如腺病毒；细胞聚合，如腺病毒；细胞融合形成合胞体，如副粘病毒和疱疹病毒；细胞融合形成合胞体，如副粘病毒和疱疹病毒；有些病毒能形成包
10、涵体有些病毒能形成包涵体。（一）细胞病变效应（一）细胞病变效应(cytopathic effect,cytopathic effect,CPECPE)现在学习的是第20页，共46页CPE观察观察现在学习的是第21页，共46页CPE观察观察现在学习的是第22页，共46页CPE观察观察现在学习的是第23页，共46页正常细胞正常细胞CPECPE观察观察现在学习的是第24页，共46页正常单层正常单层A72A72细胞细胞接种接种CCVCCV后出现细胞拉网后出现细胞拉网的的单层的的单层A72A72细胞细胞CPE观察观察现在学习的是第25页，共46页CPE观察正常单层正常单层A72A72细胞细胞接种犬冠状病
11、毒（接种犬冠状病毒（CCVCCV）后形成后形成合胞体的的单层合胞体的的单层A72A72细胞细胞现在学习的是第26页，共46页合胞体（合胞体（syncytia）是病毒感染后导致感染细胞及相邻细胞是病毒感染后导致感染细胞及相邻细胞细胞膜融合的产物，表现为若干细胞的相邻细胞膜消失，成为细胞膜融合的产物，表现为若干细胞的相邻细胞膜消失，成为多核巨细胞。多核巨细胞。可以使病毒从感染的细胞直接进入相邻的正常细胞，有利于病毒在细胞间可以使病毒从感染的细胞直接进入相邻的正常细胞，有利于病毒在细胞间的扩散。的扩散。现在学习的是第27页，共46页病毒引致的细胞凋亡和坏死病毒引致的细胞凋亡和坏死细细胞胞死死亡亡（c
12、ell cell deathdeath）:病病毒毒的的繁繁殖殖、产产物物等等直直接接引引起起细细胞的死亡。胞的死亡。细细胞胞凋凋亡亡（cell apoptosis）是是病病毒毒感感染染引引起起细细胞胞的的生生理理性死亡，即程序性死亡。性死亡，即程序性死亡。由于病毒的杀细胞感染导致的死亡，总是发生在病毒复制完成之后。病毒由于病毒的杀细胞感染导致的死亡，总是发生在病毒复制完成之后。病毒抗凋亡，以延长细胞生命，直至完成子代病毒的复制周期。抗凋亡，以延长细胞生命，直至完成子代病毒的复制周期。细胞总是在子代病毒产出之前自行死亡；是宿主细胞的重要防御机制。可细胞总是在子代病毒产出之前自行死亡；是宿主细胞的
13、重要防御机制。可及早清除感染病毒的细胞，延缓病毒在体内蔓延。及早清除感染病毒的细胞，延缓病毒在体内蔓延。现在学习的是第28页，共46页现在学习的是第29页，共46页病病毒毒感感染染抗抗体体依依赖赖的的增增强强作作用用（antibody-dependent enhancement of viral infection,ADEsyncytia）:在在病病毒毒感感染染过过程程中中，宿宿主主产产生生的的抗抗体体与与病病毒毒结结合合，非非但但未未能能阻阻断断病病毒毒吸吸附附宿宿主主细细胞胞，反反而而增增强强了了病病毒毒对对细细胞胞的的感感染染，提提高高了了病毒的滴度。病毒的滴度。现在学习的是第30页，共
14、46页能够使半数组织细胞在一定条件下发生细能够使半数组织细胞在一定条件下发生细胞病变的病毒量。用于判定病毒的毒力胞病变的病毒量。用于判定病毒的毒力。50%50%组织细胞感染量（组织细胞感染量（TCIDTCID5050）现在学习的是第31页，共46页（二）（二）空斑试验空斑试验 plaque assay细细胞胞单单层层接接种种病病毒毒后后再再覆覆盖盖一一层层含含营营养养液液的的琼琼脂脂层层。这这样样病病毒毒自自然然感感染染释释放放后后不不能能悬悬浮浮于于液液体体中中，只只能能感感染染邻邻近近与与之之接接触触的的细细胞胞，以以致致感感染染区区由由原原始始病病灶灶向向四四周周扩扩大大，形形成成类似细
15、菌的菌落，此即类似细菌的菌落，此即空斑试验空斑试验。现在学习的是第32页，共46页现在学习的是第33页，共46页现在学习的是第34页，共46页现在学习的是第35页，共46页现在学习的是第36页，共46页空斑是由一个感染性病毒粒子复制形成的，类似于细菌的菌落，空斑是由一个感染性病毒粒子复制形成的，类似于细菌的菌落，称为称为空斑形成单位（空斑形成单位（PFU）。病毒悬液中的感染性病毒量以每毫升含病毒悬液中的感染性病毒量以每毫升含有的有的PFU来表示。来表示。CELLS现在学习的是第37页，共46页现在学习的是第38页，共46页空斑试验的用途：空斑试验的用途：1.测定病毒数量测定病毒数量2.纯化病毒
16、纯化病毒 单个空斑作悬液，梯度稀释后再作空斑，可获单个空斑作悬液，梯度稀释后再作空斑，可获得病毒克隆。得病毒克隆。3.鉴定病毒鉴定病毒 不同病毒的空斑具有不同的特征。不同病毒的空斑具有不同的特征。现在学习的是第39页，共46页（三）包涵体（三）包涵体（inclusion body)定义：定义：是某些病毒感染细胞产生的特征性的形态变是某些病毒感染细胞产生的特征性的形态变化，在普通光学显微镜下可见胞浆或胞核内出现的化，在普通光学显微镜下可见胞浆或胞核内出现的呈呈嗜酸性嗜酸性或或嗜碱性嗜碱性染色、大小数量不等的染色、大小数量不等的圆形圆形或或不规则形不规则形的的团块状结构团块状结构，称为包涵体，又称
17、为，称为包涵体，又称为内基氏小体（内基氏小体（Negri body）。）。现在学习的是第40页，共46页包涵体的性质包涵体的性质n病毒成分的蓄积，如狂犬病毒的病毒成分的蓄积，如狂犬病毒的Negri氏体氏体n大量晶格样排列的病毒颗粒组成，如腺病毒的大量晶格样排列的病毒颗粒组成，如腺病毒的包涵体包涵体n细胞变性的产物，不含病毒，如疱疹病毒的包涵细胞变性的产物，不含病毒，如疱疹病毒的包涵体体现在学习的是第41页，共46页狂犬病毒包涵体（狂犬病毒包涵体（Negri body）现在学习的是第42页，共46页定定义义：细细胞胞利利用用內內源源或或外外源源的的小小分分子子双双股股RNA片片段段，特特异异性性
18、地地降降解解同同源源基基因因的的mRNA，从从而而导导致致靶靶基基因因转转录录后后基基因因沉沉默默（post translational gene silence,PTGS）的现象。）的现象。二、二、RNA干扰（干扰（RNA interference,RNAi）现在学习的是第43页，共46页定义：定义：由病毒或诱生剂刺激机体细胞产生的具有抗病毒、抗肿由病毒或诱生剂刺激机体细胞产生的具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用的糖蛋白。瘤和免疫调节作用的糖蛋白。种类：种类：、干扰素。干扰素。抗病毒作用：抗病毒作用：干扰素不直接作用于病毒，而是作用于邻近的细干扰素不直接作用于病毒，而是作用于邻近的细胞，使其产生抗病毒蛋白，这些抗病毒蛋白降解病毒胞，使其产生抗病毒蛋白，这些抗病毒蛋白降解病毒mRNA、抑制、抑制蛋白合成。蛋白合成。干扰素作用具有宿主特异性，而无病毒特异性。干扰素作用具有宿主特异性，而无病毒特异性。三、干扰素（三、干扰素（IFN）现在学习的是第44页，共46页干扰素抗病毒机制干扰素抗病毒机制 现在学习的是第45页，共46页感感谢谢大大家家观观看看现在学习的是第46页，共46页