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1、关于病毒与细胞的相互作用第一页，讲稿共四十六页哦第四章第四章 病毒与细胞间的相互作用病毒与细胞间的相互作用第一节第一节 病毒的细胞培养病毒的细胞培养第二节第二节 病毒与细胞的相互作用病毒与细胞的相互作用第二页，讲稿共四十六页哦第一节第一节 病毒的细胞培养病毒的细胞培养 病毒是严格的细胞内寄生微生物，培养病毒病毒是严格的细胞内寄生微生物，培养病毒必须使用细胞。根据病毒的不同选用敏感动物必须使用细胞。根据病毒的不同选用敏感动物（动物接种动物接种）、鸡胚（）、鸡胚（鸡胚接种鸡胚接种）或离体细胞进行）或离体细胞进行分离培养（分离培养（细胞培养细胞培养）。）。第三页，讲稿共四十六页哦一、动物接种一、动物
2、接种接种后通常以动物发病、死亡作为感染的指标。接种后通常以动物发病、死亡作为感染的指标。按病毒侵袭部位不同选择适当的接按病毒侵袭部位不同选择适当的接种途径。嗜神经病毒接种在小鼠的种途径。嗜神经病毒接种在小鼠的脑内。痘苗病毒和单纯疱疹病毒接脑内。痘苗病毒和单纯疱疹病毒接种于家兔角膜。种于家兔角膜。第四页，讲稿共四十六页哦动物接种的优缺点：动物接种的优缺点：优点：优点：（1）不需要复杂的仪器设备；不需要复杂的仪器设备；（2）技术简单；）技术简单；（3）易成功）易成功缺点：缺点：（1）个体差异大）个体差异大 （2）价格昂贵）价格昂贵 （3）数量有限）数量有限 （4）需要隔离畜舍）需要隔离畜舍第五页，
3、讲稿共四十六页哦二、鸡胚接种二、鸡胚接种一种比较经济简便的方法。一种比较经济简便的方法。卵壳卵壳壳膜壳膜第六页，讲稿共四十六页哦接种途径接种途径 绒毛尿囊膜接种绒毛尿囊膜接种 9-13日龄日龄尿囊腔接种尿囊腔接种 9-10 日龄日龄 卵黄囊接种卵黄囊接种 6-8日龄日龄 羊膜腔接种羊膜腔接种 10日龄日龄 脑内接种脑内接种 10日龄日龄第七页，讲稿共四十六页哦 1气室气室 2卵壳卵壳 3卵黄囊卵黄囊 4卵白卵白 5 尿囊腔尿囊腔 6绒毛尿囊绒毛尿囊 7胚胎胚胎 8羊水腔羊水腔 9胚胎胚胎外腔外腔第八页，讲稿共四十六页哦第九页，讲稿共四十六页哦第十页，讲稿共四十六页哦鸡胚接种的优缺点：鸡胚接种的
4、优缺点：优点：优点：技术简单、来源充沛、价格低廉、数量可大，技术简单、来源充沛、价格低廉、数量可大，不需特殊设备不需特殊设备 缺点：缺点：很多病毒不能适应，主要是哺乳动物的病毒。很多病毒不能适应，主要是哺乳动物的病毒。第十一页，讲稿共四十六页哦 细细胞胞培培养养(cell culture)是是指指利利用用机机械械、酶酶或或化化学学方方法法使使动动物物组织或传代细胞分散成单个乃至组织或传代细胞分散成单个乃至24个细胞团悬液进行培养。个细胞团悬液进行培养。三、细胞培养三、细胞培养第十二页，讲稿共四十六页哦n每个细胞生理特性基本一致，对病毒易感性相等每个细胞生理特性基本一致，对病毒易感性相等n无个体
5、差异，准确性和重复性好无个体差异，准确性和重复性好n可严格执行无菌操作可严格执行无菌操作n细胞培养本身就能显示病毒的生长特征细胞培养本身就能显示病毒的生长特征n应用空斑技术可进行病毒的克隆化应用空斑技术可进行病毒的克隆化优点：优点：第十三页，讲稿共四十六页哦根据细胞来源、染色体特征及传代次数，可分为三种类型：根据细胞来源、染色体特征及传代次数，可分为三种类型：n原原代代细细胞胞：动动物物组组织织经经胰胰蛋蛋白白酶酶消消化化处处理理，使使细细胞胞分分散散而而得得到到的的细细胞。胞。n二二倍倍体体细细胞胞：将将长长成成单单层层的的原原代代细细胞胞消消化化分分散散成成单单个个细细胞胞，继继续续培培养
6、养传传代代，其其染染色色体体数数与与原原代代细细胞胞一一样样，保保持持其其二二倍倍染染色体数目的细胞，称为二倍体细胞。色体数目的细胞，称为二倍体细胞。n传代细胞：传代细胞：能在体外持续增殖传代的细胞，大多数由癌细胞或二能在体外持续增殖传代的细胞，大多数由癌细胞或二倍体细胞突变而成。倍体细胞突变而成。（一）细胞的类型（一）细胞的类型第十四页，讲稿共四十六页哦（二）细胞培养的方法（二）细胞培养的方法1.静置培养：静置培养：实验室常用。细胞悬液装瓶，实验室常用。细胞悬液装瓶，5%CO2温箱静置培养，细胞沉降并贴附在玻面上生长分裂，温箱静置培养，细胞沉降并贴附在玻面上生长分裂，最后长成单层。最后长成单
7、层。2.旋转培养：旋转培养：大规模生产疫苗。细胞在玻瓶内生长时，大规模生产疫苗。细胞在玻瓶内生长时，玻瓶不断缓慢旋转，细胞贴附于玻瓶四周，长成单层。玻瓶不断缓慢旋转，细胞贴附于玻瓶四周，长成单层。3.悬浮培养悬浮培养4.微载体培养：微载体培养：悬浮、微载体悬浮、微载体第十五页，讲稿共四十六页哦第二节第二节 病毒与细胞的相互作用病毒与细胞的相互作用n杀细胞感染杀细胞感染n非杀细胞感染非杀细胞感染 引致持续感染，对细胞代谢无影响。引致持续感染，对细胞代谢无影响。nRNARNA干扰干扰 n产生干扰素产生干扰素 第十六页，讲稿共四十六页哦生产性感染（生产性感染（productive）：）：病毒感染后能
8、产生完整的子病毒感染后能产生完整的子代病毒颗粒。宿主细胞感染病毒发生的变化可能是细胞死代病毒颗粒。宿主细胞感染病毒发生的变化可能是细胞死亡或细胞转化。亡或细胞转化。非生产性感染（非生产性感染（nonproductive）或称顿挫感染或称顿挫感染（abortive infection）:病毒感染后不形成完整的病毒病毒感染后不形成完整的病毒颗粒。颗粒。持续性感染（持续性感染（persistent infection）:持续长时间的持续长时间的感染，感染过程中不形成感染性的病毒颗粒。感染，感染过程中不形成感染性的病毒颗粒。第十七页，讲稿共四十六页哦第十八页，讲稿共四十六页哦病病毒毒在在宿宿主主易易感
9、感细细胞胞内内增增殖殖造造成成细细胞胞损损伤伤与与死死亡亡，这这种种感感染染称称为为杀杀细细胞性变化胞性变化。一、病毒引致的杀细胞变化一、病毒引致的杀细胞变化杀细胞变化杀细胞变化第十九页，讲稿共四十六页哦由病毒感染导致的细胞损伤。由病毒感染导致的细胞损伤。CPECPE能在光学显微镜下观察。能在光学显微镜下观察。细胞圆缩，如痘病毒和呼肠孤病毒等；细胞圆缩，如痘病毒和呼肠孤病毒等；细胞聚合，如腺病毒；细胞聚合，如腺病毒；细胞融合形成合胞体，如副粘病毒和疱疹病毒；细胞融合形成合胞体，如副粘病毒和疱疹病毒；有些病毒能形成包涵体有些病毒能形成包涵体。（一）细胞病变效应（一）细胞病变效应(cytopath
10、ic effect,cytopathic effect,CPECPE)第二十页，讲稿共四十六页哦CPE观察观察第二十一页，讲稿共四十六页哦CPE观察观察第二十二页，讲稿共四十六页哦CPE观察观察第二十三页，讲稿共四十六页哦正常细胞正常细胞CPECPE观察观察第二十四页，讲稿共四十六页哦正常单层正常单层A72A72细胞细胞接种接种CCVCCV后出现细胞拉网后出现细胞拉网的的单层的的单层A72A72细胞细胞CPE观察观察第二十五页，讲稿共四十六页哦CPE观察正常单层正常单层A72A72细胞细胞接种犬冠状病毒（接种犬冠状病毒（CCVCCV）后形成后形成合胞体的的单层合胞体的的单层A72A72细胞细胞
11、第二十六页，讲稿共四十六页哦合胞体（合胞体（syncytia）是病毒感染后导致感染细胞及相邻细胞是病毒感染后导致感染细胞及相邻细胞细胞膜融合的产物，表现为若干细胞的相邻细胞膜消失，成为细胞膜融合的产物，表现为若干细胞的相邻细胞膜消失，成为多核巨细胞。多核巨细胞。可以使病毒从感染的细胞直接进入相邻的正常细胞，有利于病毒在细胞间可以使病毒从感染的细胞直接进入相邻的正常细胞，有利于病毒在细胞间的扩散。的扩散。第二十七页，讲稿共四十六页哦病毒引致的细胞凋亡和坏死病毒引致的细胞凋亡和坏死细细胞胞死死亡亡（cell cell deathdeath）:病病毒毒的的繁繁殖殖、产产物物等等直直接接引引起起细胞的
12、死亡。细胞的死亡。细细胞胞凋凋亡亡（cell apoptosis）是是病病毒毒感感染染引引起起细细胞胞的的生生理性死亡，即程序性死亡。理性死亡，即程序性死亡。由于病毒的杀细胞感染导致的死亡，总是发生在病毒复制完成之后。病毒抗由于病毒的杀细胞感染导致的死亡，总是发生在病毒复制完成之后。病毒抗凋亡，以延长细胞生命，直至完成子代病毒的复制周期。凋亡，以延长细胞生命，直至完成子代病毒的复制周期。细胞总是在子代病毒产出之前自行死亡；是宿主细胞的重要防御细胞总是在子代病毒产出之前自行死亡；是宿主细胞的重要防御机制。可及早清除感染病毒的细胞，延缓病毒在体内蔓延。机制。可及早清除感染病毒的细胞，延缓病毒在体内
13、蔓延。第二十八页，讲稿共四十六页哦第二十九页，讲稿共四十六页哦病病毒毒感感染染抗抗体体依依赖赖的的增增强强作作用用（antibody-dependent enhancement of viral infection,ADEsyncytia）:在在病病毒毒感感染染过过程程中中，宿宿主主产产生生的的抗抗体体与与病病毒毒结结合合，非非但但未未能能阻阻断断病病毒毒吸吸附附宿宿主主细细胞胞，反反而而增增强强了了病病毒毒对对细细胞胞的的感感染，提高了病毒的滴度。染，提高了病毒的滴度。第三十页，讲稿共四十六页哦能够使半数组织细胞在一定条件下发生细能够使半数组织细胞在一定条件下发生细胞病变的病毒量。用于判定病
14、毒的毒力胞病变的病毒量。用于判定病毒的毒力。50%50%组织细胞感染量（组织细胞感染量（TCIDTCID5050）第三十一页，讲稿共四十六页哦（二）（二）空斑试验空斑试验 plaque assay细细胞胞单单层层接接种种病病毒毒后后再再覆覆盖盖一一层层含含营营养养液液的的琼琼脂脂层层。这这样样病病毒毒自自然然感感染染释释放放后后不不能能悬悬浮浮于于液液体体中中，只只能能感感染染邻邻近近与与之之接接触触的的细细胞胞，以以致致感感染染区区由由原原始始病病灶灶向向四四周周扩扩大大，形成类似细菌的菌落，此即形成类似细菌的菌落，此即空斑试验空斑试验。第三十二页，讲稿共四十六页哦第三十三页，讲稿共四十六页
15、哦第三十四页，讲稿共四十六页哦第三十五页，讲稿共四十六页哦第三十六页，讲稿共四十六页哦空斑是由一个感染性病毒粒子复制形成的，类似于细菌的菌落，称空斑是由一个感染性病毒粒子复制形成的，类似于细菌的菌落，称为为空斑形成单位（空斑形成单位（PFU）。病毒悬液中的感染性病毒量以每毫升含有的病毒悬液中的感染性病毒量以每毫升含有的PFU来表示。来表示。CELLS第三十七页，讲稿共四十六页哦第三十八页，讲稿共四十六页哦空斑试验的用途：空斑试验的用途：1.测定病毒数量测定病毒数量2.纯化病毒纯化病毒 单个空斑作悬液，梯度稀释后再作空斑，可单个空斑作悬液，梯度稀释后再作空斑，可获得病毒克隆。获得病毒克隆。3.鉴
16、定病毒鉴定病毒 不同病毒的空斑具有不同的特征。不同病毒的空斑具有不同的特征。第三十九页，讲稿共四十六页哦（三）包涵体（三）包涵体（inclusion body)定义：定义：是某些病毒感染细胞产生的特征性的形态是某些病毒感染细胞产生的特征性的形态变化，在普通光学显微镜下可见胞浆或胞核内变化，在普通光学显微镜下可见胞浆或胞核内出现的呈出现的呈嗜酸性嗜酸性或或嗜碱性嗜碱性染色、大小数量不等的染色、大小数量不等的圆形圆形或或不规则形不规则形的的团块状结构团块状结构，称为包涵体，称为包涵体，又称为内基氏小体（又称为内基氏小体（Negri body）。）。第四十页，讲稿共四十六页哦包涵体的性质包涵体的性质
17、n病毒成分的蓄积，如狂犬病毒的病毒成分的蓄积，如狂犬病毒的Negri氏体氏体n大量晶格样排列的病毒颗粒组成，如腺病毒的包大量晶格样排列的病毒颗粒组成，如腺病毒的包涵体涵体n细胞变性的产物，不含病毒，如疱疹病毒的包细胞变性的产物，不含病毒，如疱疹病毒的包涵体涵体第四十一页，讲稿共四十六页哦狂犬病毒包涵体（狂犬病毒包涵体（Negri body）第四十二页，讲稿共四十六页哦定定义义：细细胞胞利利用用內內源源或或外外源源的的小小分分子子双双股股RNA片片段段，特特异异性性地地降降解解同同源源基基因因的的mRNA，从从 而而 导导 致致 靶靶 基基 因因 转转 录录 后后基基 因因 沉沉 默默（post
18、 translational gene silence,PTGS）的现象。）的现象。二、二、RNA干扰（干扰（RNA interference,RNAi）第四十三页，讲稿共四十六页哦定义：定义：由病毒或诱生剂刺激机体细胞产生的具有抗病毒、由病毒或诱生剂刺激机体细胞产生的具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用的糖蛋白。抗肿瘤和免疫调节作用的糖蛋白。种类：种类：、干扰素。干扰素。抗病毒作用：抗病毒作用：干扰素不直接作用于病毒，而是作用于邻近的干扰素不直接作用于病毒，而是作用于邻近的细胞，使其产生抗病毒蛋白，这些抗病毒蛋白降解病毒细胞，使其产生抗病毒蛋白，这些抗病毒蛋白降解病毒mRNA、抑制蛋白合成。抑制蛋白合成。干扰素作用具有宿主特异性，而无病毒特异性。干扰素作用具有宿主特异性，而无病毒特异性。三、干扰素（三、干扰素（IFN）第四十四页，讲稿共四十六页哦干扰素抗病毒机制干扰素抗病毒机制 第四十五页，讲稿共四十六页哦感感谢谢大大家家观观看看第四十六页，讲稿共四十六页哦