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1、生物选修基因工程操作程序现在学习的是第1页，共33页真核细胞的基因结构（补充内容）真核细胞的基因结构（补充内容）编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区与与RNARNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点内含子内含子 外显子外显子 启动子启动子终止子终止子编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 真核细真核细胞胞：的的 基因结基因结构构编码区编码区非编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列非编码序列：非编码序列：包括非编码区和内含子包括非编码区和内含子有调控作用的核苷酸序列，包括位于有调控作用的核苷酸序列，包括位于
2、编码区上游的编码区上游的RNARNA聚合酶结合位点。聚合酶结合位点。现在学习的是第2页，共33页原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞不同点不同点编码区是编码区是_的的编码区是间隔的、编码区是间隔的、_的的相同点相同点都由能够编码蛋白质的都由能够编码蛋白质的_和具有和具有调控作用的调控作用的_区组成的区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞与真核细胞的基因结构比较思思考考编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？与真核细胞基因结构一样长吗？连续连续不连续不连续编码区编码区非编码非编码现在学习的是第3页，共33页现在学习的是第4页，共3
3、3页基因工程基本操作的四个步骤基因工程基本操作的四个步骤1 1、目的基因的获取、目的基因的获取2 2、基因表达载体的构建、基因表达载体的构建 3 3、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞4 4、目的基因的检测与鉴定、目的基因的检测与鉴定现在学习的是第5页，共33页一、目的基因的获取一、目的基因的获取1 1、目的基因主要是指、目的基因主要是指_编码蛋白质的结构基因编码蛋白质的结构基因请举出三个以上的例子请举出三个以上的例子2 2、获取目的基因的常用方法有哪些、获取目的基因的常用方法有哪些?（1 1）从基因文库中获取）从基因文库中获取（2 2）利用）利用PCRPCR技术扩增技术扩增(PC
4、R(PCR仪仪)（3 3）人工合成（）人工合成（DNADNA合成仪）合成仪）目的基因是人们所需要转移或改造的基因目的基因是人们所需要转移或改造的基因,获取目的基因是实施基因工程的第一步获取目的基因是实施基因工程的第一步。如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因，还有植物的如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因，还有植物的抗病（抗病毒、抗细菌）基因、种子贮藏蛋白的抗病（抗病毒、抗细菌）基因、种子贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因、干扰素基因等。基因，以及人的胰岛素基因、干扰素基因等。现在学习的是第6页，共33页(一一)从基因文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因 将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许
5、多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库称为基因文库基因文库基因文库 基因组文库基因组文库部分基因文库部分基因文库（如（如:cDNA文库）文库）1.1.基因文库基因文库现在学习的是第7页，共33页基因组基因组文库与文库与部分基部分基因文库因文库的关系的关系现在学习的是第8页，共33页2.2.基因组基因组 文库的构建文库的构建供体细胞中的全部供体细胞中的全部DNADNA许多许多DNADNA片段片段重组重组DNADNA分子分子限制酶限制酶与载体连接与载体连接与载体连接与载体连接受体细胞受
6、体细胞产生特定性状产生特定性状导入导入外源外源外源外源DNADNADNADNA扩增扩增扩增扩增目的基因目的基因分离分离用限制酶用限制酶切断成许多切断成许多片段片段现在学习的是第9页，共33页3、cDNA文库的构建文库的构建mRNA 反转录cDNA(互补DNA）DNA聚合酶聚合酶双链DNA反转录法：反转录法：基因重组基因重组反转录酶反转录酶mRNAmRNAcDNAcDNA重组重组DNA分子分子现在学习的是第10页，共33页PCRPCR技术技术扩增扩增目的目的基因基因现在学习的是第11页，共33页 概念：概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成技术的核酸
7、合成技术 条件：条件：_、_、_(_(做启动子做启动子)、_._.原理：原理：_方式：以方式：以_方式扩增，即方式扩增，即_（n n为扩增循为扩增循 环的次数）环的次数）结果：结果：多聚酶链式反应多聚酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段DNADNA复制复制已知基因的核苷酸序列已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸一对引物一对引物DNADNA聚合酶聚合酶指数指数2 2n n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增(二二)利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因现在学习的是第12页，共33页过程：过程：a a、DNADNA变性
8、（变性（9595）：双链）：双链DNADNA模板模板 在热作用下，在热作用下，_断裂，形成断裂，形成_b b、退火（、退火（复性复性5555）：系统温度降低，引物与）：系统温度降低，引物与DNADNA模模板结合，形成局部板结合，形成局部_。c c、延伸（、延伸（7272）：在）：在TaqTaq酶的作用下，从酶的作用下，从 引物的引物的55端端33端延伸，合成与模板互补端延伸，合成与模板互补 的的_。氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链现在学习的是第13页，共33页(三三)直接人工合成直接人工合成 通过通过DNADNA合成仪用化合成仪用化学方法直接人工合成学方法直接人工合成DNA
9、DNADNADNA合成仪合成仪合成仪合成仪 根据已知的结构基因根据已知的结构基因的核苷酸序列，再通过的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸化学方法，以单核苷酸为原料直接合成目的基为原料直接合成目的基因。因。仅限于合成核苷酸对仅限于合成核苷酸对较少的简单基因较少的简单基因现在学习的是第14页，共33页（3）人工合成人工合成根据已知的氨基酸序列合成根据已知的氨基酸序列合成DNADNA 蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测推测推测目的基因目的基因化学合成化学合成现在学习的是第15页，共33页1.1.用一定的用一
10、定的_切割切割 质粒，使其出现一个切质粒，使其出现一个切 口，露出口，露出_。2.2.用用_切断目切断目 的基因，使其产生的基因，使其产生_ _ _。3.3.将切下的目的基因片段插入质粒的将切下的目的基因片段插入质粒的_ _处，处，再加入适量再加入适量_，形成了一个重组，形成了一个重组 DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一种限制酶同一种限制酶的黏性末端的黏性末端切口切口DNADNA连接酶连接酶相同相同 核心核心二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建现在学习的是第16页，共33页质粒质粒DNADNA分子分子限制酶处理限制酶处理一个切口一个切口两个黏性
11、末端两个黏性末端两个切口两个切口获得目的基因获得目的基因DNADNA连接酶连接酶重组重组DNADNA分子分子（重组质粒）（重组质粒）同一种同一种4.4.过程过程:现在学习的是第17页，共33页5.5.基因表达载体的组成：基因表达载体的组成：复制原点复制原点、目的基因目的基因目的基因目的基因、启动子、终止子、标记基因启动子、终止子、标记基因它们各有它们各有什么作用什么作用?现在学习的是第18页，共33页a、目的基因、目的基因b、启动子、启动子c、终止子、终止子d、标记基因标记基因位于基因的首端位于基因的首端,是是mRNA结合位点结合位点位于基因的末端位于基因的末端,终止转录终止转录检测目的基因是
12、否导入受体细胞检测目的基因是否导入受体细胞现在学习的是第19页，共33页转化转化 方法方法将目的基因导入将目的基因导入植物植物细胞细胞将目的基因导入将目的基因导入动物动物细胞细胞将目的基因导入将目的基因导入微生物微生物细胞细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法感受态细胞感受态细胞目的基因进入目的基因进入_内，并且在内，并且在 受体受体细胞内维持细胞内维持_和和_的过程的过程受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞现在学习的是第20页，共33页1、将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞（1）农杆菌
13、转）农杆菌转化法化法特点特点:能感染双子叶植物和祼子植物能感染双子叶植物和祼子植物,对单子叶植物无感染能力对单子叶植物无感染能力Ti质粒的质粒的TDNA可转移至受体可转移至受体细胞并整合到其染色体上细胞并整合到其染色体上转化过程转化过程:Ti质粒质粒目的基因目的基因构建构建表表达达载载体体导入导入植植物物细细胞胞整合整合植物细植物细胞染色胞染色DNA表达表达新新性性状状转入转入农农杆杆菌菌现在学习的是第21页，共33页现在学习的是第22页，共33页（2）基因枪法）基因枪法 基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体生
14、的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。的方法。现在学习的是第23页，共33页（3）花粉通道法）花粉通道法 植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。进入受体细胞。现在学习的是第24页，共33页
15、2、将目的基因导入动物细胞将目的基因导入动物细胞方法方法:显微注射技术显微注射技术操作程序操作程序:提纯含目提纯含目的基因表的基因表达载体达载体取取卵（卵（受受精卵）精卵）显微显微注射注射移植到子宫移植到子宫（受精卵发育）（受精卵发育）新性状新性状动物动物获得现在学习的是第25页，共33页3、将目的基因导入微生物细胞、将目的基因导入微生物细胞（1）常用法：）常用法：Ca2+处理（处理（以增大细菌以增大细菌细胞壁的通透性）细胞壁的通透性）（2）常用菌：大肠杆菌）常用菌：大肠杆菌（3）微生物作受体细胞原因：）微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少
16、（4）过程：）过程：Ca2+处理处理大大肠杆菌肠杆菌感受态感受态细胞细胞表达载体表达载体与感受态与感受态细胞混合细胞混合感受态细感受态细胞吸收胞吸收DNA现在学习的是第26页，共33页检测检测鉴定鉴定检测转基因生物检测转基因生物染色体的染色体的DNADNA 上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因检测目的基因是否检测目的基因是否转录出了转录出了mRNAmRNA检测目的基因是否翻译成检测目的基因是否翻译成蛋白质蛋白质抗虫或抗病鉴定、功能活性鉴定抗虫或抗病鉴定、功能活性鉴定方法方法方法方法方法方法DNADNA分子杂交分子杂交分子杂交分子杂交抗原抗体杂交抗原抗体杂交四、目的基因的检测与鉴定四、目的基
17、因的检测与鉴定现在学习的是第27页，共33页DNADNA分子杂交示意图分子杂交示意图 采用一定的技术手段，将两种生物的采用一定的技术手段，将两种生物的DNADNA分子的分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。两条游离的单链。现在学习的是第28页，共33页受体细胞中真正摄入了受体细胞中真正摄入了受体细胞中真正摄入了受体细胞中真正摄入了含目的基因含目的基因
18、的的的的重组质粒重组质粒重组质粒重组质粒很少，必须很少，必须将它从中检测出来。利用将它从中检测出来。利用标记基因（抗生素抗性基因）标记基因（抗生素抗性基因）标记基因（抗生素抗性基因）标记基因（抗生素抗性基因）进行筛进行筛进行筛进行筛选。过程如下：选。过程如下：选。过程如下：选。过程如下：1.1.1.1.选择选择选择选择不含标记基因不含标记基因的大肠的大肠的大肠的大肠杆菌，并用杆菌，并用CaCaCaCa2+2+2+2+处理受体细胞。处理受体细胞。处理受体细胞。处理受体细胞。2.2.2.2.将将“重组质粒重组质粒重组质粒重组质粒”与上述大肠杆菌与上述大肠杆菌与上述大肠杆菌与上述大肠杆菌在缓冲液中混
19、合培养。在缓冲液中混合培养。3.3.3.3.将每个受体细胞单独培养在将每个受体细胞单独培养在含抗生素含抗生素含抗生素含抗生素的培养基上，有菌落的培养基上，有菌落的培养基上，有菌落的培养基上，有菌落出现则说明导入出现则说明导入出现则说明导入出现则说明导入“重组质粒重组质粒”成功。成功。成功。成功。重组质粒的重组质粒的导入导入是否成功呢？是否成功呢？进一步检测菌落中是否有目的基因的进一步检测菌落中是否有目的基因的进一步检测菌落中是否有目的基因的进一步检测菌落中是否有目的基因的”表达产物表达产物表达产物表达产物”。淘汰无。淘汰无。淘汰无。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。表达产
20、物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。现在学习的是第29页，共33页 不能，受体细胞必须表现出特定的性状，不能，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了才能说明目的基因完成了表达表达。受体细胞摄入受体细胞摄入DNADNA分子后就说明目的基因完成了分子后就说明目的基因完成了表达吗？表达吗？若不能表达，若不能表达，要对抗虫基因要对抗虫基因再进行再进行修饰修饰。现在学习的是第30页，共33页1.目的基因的获取目的基因的获取从基因文库中获取从基因文库中获取从基因文库中获取从基因文库中获
21、取 (建库的方法：直接分离法、反转录法、建库的方法：直接分离法、反转录法、建库的方法：直接分离法、反转录法、建库的方法：直接分离法、反转录法、根据已知氨基酸合成根据已知氨基酸合成根据已知氨基酸合成根据已知氨基酸合成DNADNADNADNA法法法法)利用利用利用利用PCRPCR技术扩增技术扩增技术扩增技术扩增化学方法人工合成化学方法人工合成2.构建基因表达载体构建基因表达载体 目的基因、启动子、终止子、标记基因目的基因、启动子、终止子、标记基因3.将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞 农杆菌转化法（植物）、显微注射技术（动物）、微生物农杆菌转化法（植物）、显微注射技术（动物）、微生物农杆
22、菌转化法（植物）、显微注射技术（动物）、微生物农杆菌转化法（植物）、显微注射技术（动物）、微生物4.目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定 检测：是否插入、转录、翻译检测：是否插入、转录、翻译检测：是否插入、转录、翻译检测：是否插入、转录、翻译 鉴定：抗性鉴定、功能活性鉴定鉴定：抗性鉴定、功能活性鉴定鉴定：抗性鉴定、功能活性鉴定鉴定：抗性鉴定、功能活性鉴定本节总结本节总结现在学习的是第31页，共33页1）以下说法正确的是）以下说法正确的是 （）A、所所有有的的限限制制酶酶只只能能识识别别一一种种特特定定的的核核苷苷酸序列酸序列 B、质粒是基因工程中唯一的运载体、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、运运载载体体必必须须具具备备的的条条件件之之一一是是：具具有有多多个个限制酶切点，以便与外源基因连接限制酶切点，以便与外源基因连接 D、基因控制的性状都能在后代表现出来、基因控制的性状都能在后代表现出来C C典型例题典型例题现在学习的是第32页，共33页2）不属于质粒被选为基因运载体的理由是）不属于质粒被选为基因运载体的理由是 A、能复制、能复制 （）B、有多个限制酶切点、有多个限制酶切点 C、具有标记基因、具有标记基因 D、它是环状、它是环状DNAD D现在学习的是第33页，共33页