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1、关于生物技术生物工程植物细胞工程现在学习的是第1页，共103页 第一节 概述掌握植物细胞工程基本概念 及其主要内容 应用了解植物细胞工程的研究简史、现状 及发展前景 热点现在学习的是第2页，共103页植物细胞工程的发展历史现在学习的是第3页，共103页德国植物学家Haberlandt植物细胞培养创始人1902年根据细胞学说（celltheory）提出植物体细胞有再生完整植株的潜在全能性-细胞全能性细胞全能性（totipotency）植物细胞全能性是植物细胞工程的理论基础现在学习的是第4页，共103页1904年，德国植物胚胎学家Hanning用萝卜和辣根的胚进行离体培养，提早长成了小植株，首次获
2、得胚培养成功。成熟发芽常规：幼胚种子植物培养组织培养：幼胚植株现在学习的是第5页，共103页1922年，Knudson对兰花幼胚进行培养获得幼苗，克服了兰花种子发芽难的困难。1925年，Laibach进行亚麻种间杂种幼胚培养，成功地得到了杂种植物。1934年，White等用番茄根尖的组织培养，建立了第一个活跃生长的无性繁殖系。1934年，Gautheret培养山毛柳、黑杨的形成层组织，获得愈伤组织形成。现在学习的是第6页，共103页1937年，White和Went等分别发现B族维生素和吲哚乙酸（IAA）对培养的离体根生长具有重要作用。1937-1938年，Gautheret在1934年培养山毛
3、柳、黑杨成功获得愈伤组织的基础上，在培养柳树的培养基中，加入IAA和B族维生素等，使形成层的生长大为增加。现在学习的是第7页，共103页1937-1938年，Nobecourt培养胡萝卜根和马铃薯的块茎薄壁组织，获得愈伤组织愈伤组织。将愈伤组织置于琼脂培养基上继续培养，可无限发生细胞增殖，形成愈伤组织。首次从液泡化的薄壁细胞建立愈伤组织培养物。现在学习的是第8页，共103页White、Gautheret、Nobecourt等科学家被誉为植物组织培养的奠基人。在此基础上建立了植物组织培养的综合培养基，包括无机盐无机盐成分、有机成分和生长刺激因素成分、有机成分和生长刺激因素。这是随后创立的各种培养
4、基的基础，同时也建立了植物组织培养的基本方法，成为当今各种植物组织培养的技术基础。现在学习的是第9页，共103页现在学习的是第10页，共103页现在学习的是第11页，共103页一一.植物细胞工程植物细胞工程基本概念基本概念：原理和方法：细胞学、生理学、分子生物学及工程学原理对象：植物细胞设计改造：植物细胞遗传性目标：创造新物种，提供名贵药品及服务现在学习的是第12页，共103页二二.植物细胞工程植物细胞工程研究主要内容研究主要内容：植物细胞和组织培养技术原生质体培养和融合技术植物的快速繁殖和人工种子植物染色体工程转基因技术现在学习的是第13页，共103页 植物细胞工程植物细胞工程 热点热点1.
5、在无菌和人工控制的条件下，采用植物细胞和组织培养技术培养植物的细胞，组织，器官以获得有药用价值的次生代谢产物。2.采用植物的遗传操作技术改变植物或植物细胞的原有性状和功能，获得具有优良性状的植株或植物细胞，生产有药用价值的次生代谢产物。现在学习的是第14页，共103页第二节植物细胞培养特性及主要培养技术现在学习的是第15页，共103页细胞的全能性:一个细胞具有产生完整生物个体的固有能力。一、重要概念一、重要概念现在学习的是第16页，共103页植物干细胞：植物胚性细胞（embryogeniccells）即合子。分化的根茎叶中仍保留少数未分化或分化程度不高的细胞（遗留的胚性细胞）一、重要概念一、重
6、要概念现在学习的是第17页，共103页细胞的脱分化（dedifferentiation):特定条件下，分化细胞被诱导，基因活动模式发生变化，改变原有的发育途径，失去原有的分化状态，转变为具分生能力的胚性细胞。已分化细胞要表现全能性，先要脱分化成分生细胞，后再分化形成胚胎发育成植株脱分化条件：创伤和外源激素。一、重要概念一、重要概念现在学习的是第18页，共103页外植体(explant)：植物体上取出的用于培养和分离细胞的组织或器官愈伤组织：植物的伤口或外植体的伤口长出的细胞团，既是组织，又是脱分化细胞次生代谢产物：保持植物的抗逆性，抗病性和抗虫性，及担当信号分子。一、重要概念一、重要概念现在学
7、习的是第19页，共103页一、重要概念一、重要概念植物组织培养植物组织培养在无菌条件下，将离体的植物器官(如根尖、茎尖、叶、花、未成熟的果实、种子等)、组织(如形成层、花药组织、胚乳、皮层等)、细胞(如体细胞、生殖细胞等)、胚胎(如成熟和未成熟的胚)、原生质体(如脱壁后仍具有生活力的原生质体)，培养在人工培养基上，给予适宜的培养条件，诱发产生愈伤组织，或潜伏芽等，或长成完整的植株，又分为植株培养、胚胎培养、器官培养、组织培养、原生质体培养等。现在学习的是第20页，共103页延迟期：细胞数恒定，高RNA含量，高蛋白质合成能力；加速期：细胞快速生长期。细胞数、DNA和蛋白质浓度增加，有丝分裂活性、
8、RNA含量和蛋白质合成能力减少；对数期：介于最大生长率和蛋白质合成完全停止期之间。增加细胞鲜重、干重及RNA酶活性，蛋白质合成能力完全减退；稳定期：细胞数稳定。细胞高液泡化，极度脆弱，高度分化及高浓度有机化合物。二、培养植物细胞二、培养植物细胞 四个生长时期四个生长时期现在学习的是第21页，共103页（1）植物细胞有独特的培养时间及特征：重量的增加在对数期，次生代谢产物积累在稳定期（2）植物细胞很少单一细胞生长，对数生长后期分泌量蛋白和粘多糖，以非均相集合的细胞团悬浮生长。（3）植物细胞好气，培养过程需供气及搅拌，（4）植物细胞较微生物细胞大得多，纤维素细胞壁，细胞壁脆弱，抗剪切能力小，传统的
9、搅拌式反应器极易损伤细胞壁三、植物细胞的培养特点三、植物细胞的培养特点现在学习的是第22页，共103页（5）具有群体效应、无锚定依赖性及接触抑制性；（6）培养细胞产物滞留于细胞内，且产量较低；（7）培养过程具有结构与功能全能性。经过增殖与分化，能发育成为植株三、植物细胞的培养特点三、植物细胞的培养特点现在学习的是第23页，共103页（1）必需元素大量元素：氮、磷、钾、钙、镁、硫等微量元素：硼、锰、锌、钼、铜、钴、氯等（2）无机氮源，硝酸盐，铵盐为主。（3）碳源，蔗糖（4）需多种维生素烟酸，B1，B6和植物生长激素(生长素，生长素，细胞分裂素，赤霉素，脱落酸，乙烯细胞分裂素，赤霉素，脱落酸，乙烯
10、)。（5）需有机物：甘氨酸或水解络酪蛋白，酵母提取液等。四、植物细胞营养要求四、植物细胞营养要求现在学习的是第24页，共103页A BA：6-BA(0 mg/L)，芽（减少），根（增多）愈伤组织（一定量）B：6-BA(0.1mg/L)，芽（适量），根（适量）愈伤组织（一定量）现在学习的是第25页，共103页A A：NAA 0 mg/LNAA 0 mg/L，芽（少），根（无），芽（少），根（无）B B：NAA 0.1mg/LNAA 0.1mg/L，芽（少），根（无），愈伤组织（少量），芽（少），根（无），愈伤组织（少量）C C：NAA 5.0mg/LNAA 5.0mg/L，芽（少），根（多），愈
11、伤组织（一定量，芽（少），根（多），愈伤组织（一定量A B C现在学习的是第26页，共103页常用培养基MS、N6、B6、RM-1964、KM-8p等。MS培养基是目前应用最多最普遍的培养基。无机培养基是目前应用最多最普遍的培养基。无机盐的浓度较高，能保证组织培养生长所需的矿物营盐的浓度较高，能保证组织培养生长所需的矿物营养。养。五、植物细胞培养基五、植物细胞培养基现在学习的是第27页，共103页贮备液（母液）的配制贮备液（母液）的配制 为什么要配制母液？为什么要配制母液？1 1）、方便）、方便 2 2）、准确（有些成分量太小）、准确（有些成分量太小）以以MS培养基配制为例：培养基配制为例：现
12、在学习的是第28页，共103页1 1、大量元素母液的配制、大量元素母液的配制各成分按照表各成分按照表1培养基浓度含量扩大培养基浓度含量扩大10倍，按顺序逐步混合。倍，按顺序逐步混合。后用蒸馏水定容到后用蒸馏水定容到1000ml的容量瓶中，即为的容量瓶中，即为10倍的大量元素母倍的大量元素母液。倒入细口瓶，贴好标签保存于冰箱中。配制培养基时，每配液。倒入细口瓶，贴好标签保存于冰箱中。配制培养基时，每配1L培养基取此液培养基取此液100ml。现在学习的是第29页，共103页注意：注意：(1)(1)某些无机成分如某些无机成分如CaCa2+2+、SOSO4 42 2一一、Mg Mg 2 2十十和和H
13、H2 2POPO4 4一一等在等在一起可能发生化学反应，产生沉淀物。一起可能发生化学反应，产生沉淀物。为避免此现象发生，为避免此现象发生，母液配制时要用纯度高的重蒸馏水溶解，药品采用等级较高的分母液配制时要用纯度高的重蒸馏水溶解，药品采用等级较高的分析纯，各种化学药品必须先以少量重蒸馏水使其充分溶解后才能析纯，各种化学药品必须先以少量重蒸馏水使其充分溶解后才能混合，混合时应注意先后顺序。特别应将混合，混合时应注意先后顺序。特别应将CaCa2+2+、SOSO4 42 2一一、Mg Mg 2 2十十和和H H2 2POPO4 4一一等离子错开混合，速度宜慢，边搅拌边混合。等离子错开混合，速度宜慢，
14、边搅拌边混合。(2)CaCl(2)CaCl2 22H2H2 2O O要在最后单独加入，在溶解要在最后单独加入，在溶解CaClCaCl2 22H2H2 2O O时，时，蒸馏水需加热沸腾，除去水中的蒸馏水需加热沸腾，除去水中的COCO2 2，以防沉淀。另外，以防沉淀。另外，CaClCaCl2 22H2H2 2O O放入沸水中易沸腾，操作时要防止其溢出。放入沸水中易沸腾，操作时要防止其溢出。现在学习的是第30页，共103页、微量元素母液的配制、微量元素母液的配制MSMS培养基的微量元素无机盐由培养基的微量元素无机盐由7 7种化合物（除种化合物（除FeFe）组成。微量）组成。微量元素用量较少，特别是元
15、素用量较少，特别是CuSOCuSO4 45H5H2 2O O、CoClCoCl2 26H6H2 2OO，因，因此在配制中分微量此在配制中分微量、配制。按照表配制。按照表2 2，表，表3 3配方，用感量为配方，用感量为0.0001g0.0001g的分析天平称量，其它同大量元素。配制培养基时，每配的分析天平称量，其它同大量元素。配制培养基时，每配制制1L1L培养基，取微量培养基，取微量10ml10ml，微量，微量mlml现在学习的是第31页，共103页现在学习的是第32页，共103页3 3、铁盐母液的配制、铁盐母液的配制铁盐不是都需要单独配成母液，如柠檬酸铁，只需和大铁盐不是都需要单独配成母液，如
16、柠檬酸铁，只需和大量元素一起配成母液即可。目前常用的铁盐是硫酸亚铁量元素一起配成母液即可。目前常用的铁盐是硫酸亚铁和乙二胺四乙酸二钠的螯合物，必须单独配成母液。这和乙二胺四乙酸二钠的螯合物，必须单独配成母液。这种螯合物使用起来方便，又比较稳定，不易发生沉淀。种螯合物使用起来方便，又比较稳定，不易发生沉淀。配制方法同上，直接用蒸馏水加热搅拌溶解。配制培养配制方法同上，直接用蒸馏水加热搅拌溶解。配制培养基时，配制基时，配制1L1L取此液取此液10ml10ml。现在学习的是第33页，共103页在在配配制制铁铁盐盐时时，如如果果加加热热搅搅拌拌时时间间过过短短，会会造造成成Fe S 04和和Na2ED
17、TA鳌鳌合合不不彻彻底底，此此时时若若将将其其冷冷藏藏，Fe S 04会会结结晶晶析析出出。为为避避免免此此现现象象发发生生，配配制制铁铁盐盐母母液液时时，Fe S 04和和Na2EDTA应应分分别别加加热热溶溶解解后后混混合合，并并置置于于加加热热搅搅拌拌器器上上不不断断搅搅拌拌至至溶溶液液呈呈金金黄黄色色(约约加加热热20-30 min)，调，调pH值至值至5.5，室温放置冷却后，再冷藏。，室温放置冷却后，再冷藏。现在学习的是第34页，共103页4 4、有机母液的配制、有机母液的配制MSMS培养基的有机成分有甘氨酸、肌醇、烟酸、盐酸硫培养基的有机成分有甘氨酸、肌醇、烟酸、盐酸硫胺素和盐酸吡
18、哆素。培养基中的有机成分原则上应分胺素和盐酸吡哆素。培养基中的有机成分原则上应分别单独配制。配制直接用蒸馏水溶解，注意称量时用别单独配制。配制直接用蒸馏水溶解，注意称量时用电子分析天平。并贮存在棕色无菌瓶中电子分析天平。并贮存在棕色无菌瓶中 。配制生物素、叶酸，用稀氨水溶解，然后定容。配制生物素、叶酸，用稀氨水溶解，然后定容。现在学习的是第35页，共103页 5 5、植物生长调节剂母液配制、植物生长调节剂母液配制一般植物生长调节剂母液的配制的终浓度以一般植物生长调节剂母液的配制的终浓度以0.5mg/ml0.5mg/ml为为好，需要注意的是：好，需要注意的是：（）配制生长素类，例如（）配制生长素
19、类，例如IAAIAA、NAANAA、2.4-D2.4-D、IBAIBA，应先，应先用少量用少量95%95%乙醇或无水乙醇充分溶解，或者用乙醇或无水乙醇充分溶解，或者用1mol/L1mol/L的的NaOHNaOH溶解，然后用蒸馏水定容到一定的浓度。以后者效果好。溶解，然后用蒸馏水定容到一定的浓度。以后者效果好。（）细胞分裂素，例如（）细胞分裂素，例如KTKT，应先用少量，应先用少量95%95%乙醇或无水乙乙醇或无水乙醇加醇加3434滴滴1mol/L1mol/L的盐酸溶解，或直接用的盐酸溶解，或直接用1mol/L HCl1mol/L HCl溶解，溶解，再用蒸馏水定容。再用蒸馏水定容。（）（）GA3
20、GA3以以95%95%酒精溶解（不耐高温，过滤灭菌）酒精溶解（不耐高温，过滤灭菌）保存在棕色试剂瓶中。保存在棕色试剂瓶中。现在学习的是第36页，共103页注意：注意：所有母液都要贴上标签，注明名称、配制倍数、日所有母液都要贴上标签，注明名称、配制倍数、日期，所有的母液都应保存在期，所有的母液都应保存在0404冰箱中，若母液出冰箱中，若母液出现沉淀或霉团则不能继续使用。现沉淀或霉团则不能继续使用。现在学习的是第37页，共103页White的无机盐含量较低，适于生根培养。KM-8p主要用于原生质体培养，含几乎所有单糖和维生素、呼吸代谢中的主要有机酸。凡花药培养中常用培养基，成分较简单，且KN03和
21、(NH)2N04含高。现在学习的是第38页，共103页培养基的配制培养基的配制 1 1、计量、计量 根据配制培养基的量和母液的浓度计算需要吸取母液的量，计根据配制培养基的量和母液的浓度计算需要吸取母液的量，计算公式：吸取量算公式：吸取量 ml=ml=培养基中物质的含量（培养基中物质的含量（mg/Lmg/L）1000ml/1000ml/母液浓度（母液浓度（mg/Lmg/L）。）。2 2、移液、移液取烧杯一只，加入少量的蒸馏水，按照计算吸取母液的量依次取烧杯一只，加入少量的蒸馏水，按照计算吸取母液的量依次吸取各母液置于烧杯中备用。吸取各母液置于烧杯中备用。现在学习的是第39页，共103页3 3、称
22、取琼脂蔗糖备用、称取琼脂蔗糖备用4 4、融化、融化用量杯量取用量杯量取600600700ml700ml的蒸馏水放在电炉上，加入琼脂，的蒸馏水放在电炉上，加入琼脂，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状将其取边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状将其取下，加入蔗糖。下，加入蔗糖。大烧杯底的外表面不能沾水，否则加热时烧杯容易炸大烧杯底的外表面不能沾水，否则加热时烧杯容易炸裂，使溶液外溢，造成烫伤。裂，使溶液外溢，造成烫伤。现在学习的是第40页，共103页5 5、混合、混合将融化的琼脂和母液充分混合，用蒸馏水定容到将融化的琼脂和母液充分混合，用蒸馏水定容到1000ml1000ml，来回混合几次。
23、来回混合几次。6 6、调、调pHpH用滴管吸取物质的量浓度为用滴管吸取物质的量浓度为1 mol/L1 mol/L的的NaOHNaOH或或HClHCl溶液，逐溶液，逐滴滴入溶化的培养基中，边滴边搅拌，并随时用精密的滴滴入溶化的培养基中，边滴边搅拌，并随时用精密的pHpH试试纸纸(5.4(5.47.0)7.0)测培养基的测培养基的pHpH，一直到培养基的，一直到培养基的pHpH达到要求为达到要求为止止(在调制时要比目标在调制时要比目标pHpH值偏高值偏高0.20.20.50.5个单位，因为个单位，因为培养基培养基在灭菌过程中由于糖等物质的降解，在灭菌过程中由于糖等物质的降解，pHpH值会下降值会下
24、降0.20.20.50.5个单个单位左右位左右)。现在学习的是第41页，共103页7 7、分装、分装溶化的培养基应该趁热分装。注意不要让培养基沾到溶化的培养基应该趁热分装。注意不要让培养基沾到瓶口和瓶壁上。锥形瓶中培养基的量约为锥形瓶容量瓶口和瓶壁上。锥形瓶中培养基的量约为锥形瓶容量的的1/51/51/41/4。每。每1L1L培养基，可分装培养基，可分装20203030瓶。瓶。8 8、包扎、包扎用封口膜封口，外边可加一层牛皮纸，扎好绳子，用铅用封口膜封口，外边可加一层牛皮纸，扎好绳子，用铅笔或碳素墨水笔在牛皮纸上写上培养基的代号。笔或碳素墨水笔在牛皮纸上写上培养基的代号。9 9、培养基的灭菌、
25、培养基的灭菌现在学习的是第42页，共103页（一）植物细胞的获得1.外植体直接分离法：机械切割、组织破碎2.愈伤组织分离法：制备小细胞团或单细胞悬液3.原生质体再生法：纤维素和果胶酶混合处理外植体或愈伤组织，分离原生质体，再生培养基中培养，原生质体细胞壁再生。六、植物细胞的六、植物细胞的培养技术培养技术现在学习的是第43页，共103页1.单细胞的培养（1）看护培养法（nurseculture）：在单细胞的生长环境里加入愈伤组织同时培养。愈伤组织提供促细胞分裂的物质等，传递生物信息，使细胞分裂增殖。即愈伤组织看护单细胞适用于难于培养的植物种类（二）植物细胞的培养方法（二）植物细胞的培养方法现在学
26、习的是第44页，共103页（2）微室培养法：单细胞悬液接种到人工制造一个小室（如凹玻片与盖玻片组成的微室），内含少量培养基，密封培养，使其分裂增殖形成细胞团的方法连续观察，通气性差1.单细胞单细胞的培养的培养现在学习的是第45页，共103页（3）平板培养法：将制备好的单细胞悬液，按一定的细胞密度，接种于固体培养基上，或与融化的琼脂培养基均匀混合，并平铺一薄层在培养皿底上的培养方法每个平板上形成的细胞团数植板率（%）=-100%该平板上接种的细胞数1.单细胞单细胞的培养的培养现在学习的是第46页，共103页（4）条件培养法：接种于条件培养基上形成的细胞系条件培养基：培养过细胞的培养基上清，有植物
27、生长激素等残留，用于制备成固体培养基。1.单细胞单细胞的培养的培养现在学习的是第47页，共103页指将植物单倍体细胞花药培养成单倍体植株或经过染色体加倍成纯二倍体植株。花药培养的基本程序是：外植体(花蕾)选择预处理花蕾消毒取花药接种诱导培养分化培养2.单倍体细胞单倍体细胞的培养的培养（花药花药培养）培养）现在学习的是第48页，共103页3.愈伤组织培养愈伤组织培养愈伤组织，为脱分化细胞，具再分化的能力，可培养用于次生代谢物的生产，或再生为植株。现在学习的是第49页，共103页(cellsuspensionculture)游离植物细胞悬浮于液体培养基中振荡培养，细胞总数不断增加，产量达最高点后生
28、长趋于停止，然后进行移植继代培养方法4 细胞悬浮培养法细胞悬浮培养法单细胞悬浮0.251050.5105细胞/ml,现在学习的是第50页，共103页 1、直接筛选法直接筛选法有新表型或感观上出现可测定的差异进行选择的方法 2、间接筛选法、间接筛选法用与突变表现型具有某种相关的特性为指标筛选 3、绿岛法、绿岛法在植株上使叶面细胞产生突变并创造选择压力，令抗性突变细胞正常生长形成绿色斑点，谓之“绿岛”，切下绿岛即是突变细胞，经分散和培养后即可分化为完整突变植株七、细胞突变体筛选技术七、细胞突变体筛选技术现在学习的是第51页，共103页干燥保存法、液体石蜡覆盖法、低温保存法低压低氧保存法超低温深冻保
29、存法八、种质保存八、种质保存 现在学习的是第52页，共103页超低温深冻保存法材料：愈伤组织、悬浮培养细胞、原生质体、花粉、花粉胚、体细胞胚状体、茎尖分生组织、小植株及茎芽-196液氮冰冻保护剂二甲亚砜（DMSO）、甘油、山梨糖及蔗糖等，复合成分较单一成分效果佳，5%DMSO+1mol/L山梨醇存活率提高10倍左右。八、种质保存八、种质保存 现在学习的是第53页，共103页 第三节原生质体培养 和融合技术 现在学习的是第54页，共103页指除去细胞壁的细胞或一个被质膜所包围的且具有生活力的裸露细胞。一、一、原生质体的概念原生质体的概念现在学习的是第55页，共103页二、二、原生质体培养技术原生
30、质体培养技术用酶除去植物体细胞的细胞壁，获得原生质体。原生质体在良好的培养基上生长分裂，细胞壁再生，形成愈伤组织，诱导愈伤组织分化，长出茎、叶，根而形成植株。现在学习的是第56页，共103页（一）（一）材料准备材料准备无菌试管苗叶片上胚轴和子叶培养细胞现在学习的是第57页，共103页（二）（二）原生质体的制备原生质体的制备1，酶处理纤维素酶类半纤维素酶果胶酶类酶溶剂：原生质体培养基或特殊配制。渗透压调节剂：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等。现在学习的是第58页，共103页2，原生质体的收集和纯化飘浮法：常用的飘浮剂有蔗糖沉淀法：常用甘露醇作为渗透压调节剂，先将酶液洗出干净，再用Percoll飘浮一次。
31、Percoll一种包有乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒。（二）（二）原生质体的制备原生质体的制备现在学习的是第59页，共103页目测法：在显微镜下观察，根据细胞形态、流动性确定原生质体活力。FDA法：FDA（二乙酸荧光素）是一种非极性物质，能自由地穿越细胞质膜，在活细胞内，FDA被酯酶裂解即发荧光（荧光素），荧光素不能自由通过质膜。伊凡蓝法：质膜受到严重损坏使细胞被染色（三）（三）原生质体活力检测原生质体活力检测现在学习的是第60页，共103页1.液体浅层培养2.固体培养3.液固双层培养4.琼脂糖珠培养（四）（四）原生质体培养方法原生质体培养方法等渗培养基现在学习的是第61页，共103页或体细胞种子概念
32、任何一种离体繁殖体包埋在含有营养成分和保护功能的物质中,在适宜条件下发芽出苗，发育成完整的植株，均可称之为人工种子。第一类是裸露的或休眠的繁殖体，适当干燥的体细胞胚、休眠的微鳞茎和微块茎等第二类为人工种皮包被的繁殖体，一些体细胞胚、原球茎等海藻酸钠作包埋第三类是水凝胶包埋再包被人工种皮的繁殖体，大多数体细胞胚、不定芽、茎尖等人工种子人工种子现在学习的是第62页，共103页细胞分裂与细胞壁再生愈伤组织形成愈伤组织分化植株再生（五）（五）愈伤组织形成和植株再生愈伤组织形成和植株再生现在学习的是第63页，共103页1.提高变异频率提高变异频率2.细胞工程技术进行遗传重组的材料，细胞融合细胞工程技术进
33、行遗传重组的材料，细胞融合和基因转移必需在原生质体上进行。和基因转移必需在原生质体上进行。三三 原生质体培养意义原生质体培养意义现在学习的是第64页，共103页 体细胞杂交体细胞杂交一）类型两大类：对称融合（asymmetricfusion）两个完整的细胞原生质体融合。非对称融合（symmetricfusion）利用物理或化学方法使某亲本的核或细胞质失活后再进行融合。核失活X射线，碘乙酰胺（IOA）、碘乙酸质失活罗丹明（R6G，抑制线粒体氧化磷酸化。四、原生质体融合技术四、原生质体融合技术现在学习的是第65页，共103页 1材料准备2原生质体的制备3融合方法PEG，电融合4杂种细胞选择系统与杂
34、种植株鉴定5.细胞壁再生愈伤组织形成和植株再生二）融合过程二）融合过程现在学习的是第66页，共103页 3融合方法PEG，电融合二）融合过程二）融合过程按比例混合双亲原生质体滴加PEG摇匀静置滴加高钙高pH液，摇匀静置滴加原生质体培养液洗涤数次离心得原生质体细胞团筛选再生杂合细胞。现在学习的是第67页，共103页 1）杂种细胞的选择系统外观选择互补选择荧光标记选择4.杂种细胞选择系统与杂种植株鉴定杂种细胞选择系统与杂种植株鉴定现在学习的是第68页，共103页2）体细胞杂种的鉴定形态鉴定：根据双亲的形态学性状观察进行鉴定。细胞学鉴定：细胞器鉴定、染色体鉴定。生化鉴定：同功酶鉴定。分子鉴定：RFL
35、P鉴定、RAPD标记鉴定。4 杂种细胞选择系统与杂种植株的鉴定杂种细胞选择系统与杂种植株的鉴定现在学习的是第69页，共103页RFLP基因型之间限制性片段长度的差异RAPD建立在PCR基础之上的一种可对整个未知序列的基因组进行多态性分析的分子技术4 杂种细胞选择系统与杂种植株的鉴定杂种细胞选择系统与杂种植株的鉴定现在学习的是第70页，共103页现在学习的是第71页，共103页原生质体培养13天，细胞壁再生再生细胞一旦分裂，继续生长1形成细胞团，发育成愈伤组织，诱导分化出芽及根再生为完整植株；2形成胚状体，再产生植株；5、细胞壁再生愈伤组织形成和植株再生、细胞壁再生愈伤组织形成和植株再生现在学习
36、的是第72页，共103页1、植物育种中的核质替换2、细胞质杂种的获得3、远缘杂交创造新物种4、细胞器的互作研究三）、融合技术应用三）、融合技术应用现在学习的是第73页，共103页第四节 植物细胞大规模培养技术 现在学习的是第74页，共103页植物细胞规模培养技术要点植物细胞规模培养技术要点（1 1）细胞系的建立和选择）细胞系的建立和选择有效成分分析有效成分分析悬浮细胞系悬浮细胞系单细胞培养与筛选单细胞培养与筛选细胞增殖细胞增殖现在学习的是第75页，共103页（2 2）优良细胞系的增殖培养）优良细胞系的增殖培养 所选择的优良细胞系，进行大规模繁殖，得所选择的优良细胞系，进行大规模繁殖，得到足够的
37、细胞是建立细胞规模化培养体系的中间环到足够的细胞是建立细胞规模化培养体系的中间环节。节。现在学习的是第76页，共103页 （3 3）大规模培养体系的建立）大规模培养体系的建立 一步法逐级放大：对于细胞生长与目的产物合成同步一步法逐级放大：对于细胞生长与目的产物合成同步的类型，一般采用此方法建立大规模培养系统。的类型，一般采用此方法建立大规模培养系统。两步法：用于目的产物合成在细胞生长发育到一定时两步法：用于目的产物合成在细胞生长发育到一定时期进行，细胞生长和产物合成需要不同的培养基的类型。期进行，细胞生长和产物合成需要不同的培养基的类型。先在细胞生长培养基中培养大批量细胞，当细胞生长至合先在细
38、胞生长培养基中培养大批量细胞，当细胞生长至合成产物的阶段后，再将其转入到产物合成培养基中培养。成产物的阶段后，再将其转入到产物合成培养基中培养。如果采用固相培养方式生产次生产物，一般均需采用两如果采用固相培养方式生产次生产物，一般均需采用两步法建立体系。步法建立体系。现在学习的是第77页，共103页培养方式的选择：培养方式的选择：分批培养分批培养 间歇培养流加间歇培养间歇培养流加间歇培养 两级或多级间歇培养两级或多级间歇培养 连续培养单级连续培养连续培养单级连续培养 多级连续培养多级连续培养 回流式连续培养回流式连续培养 固定化细胞培养固定化细胞培养现在学习的是第78页，共103页提高细胞次生
39、代谢产物的途径提高细胞次生代谢产物的途径 （1 1）明确植物细胞生长与产物合成的关系）明确植物细胞生长与产物合成的关系 生生长长偶偶联联型型 产产物物合合成成与与细细胞胞生生长长成成正正比比。如如长长春春花花属属植植物物中中的的长长春春花花碱碱的的合合成成、烟烟草草细细胞胞的的烟烟碱碱合合成成、薯薯蓣蓣属属植植物物中中的薯蓣皂甙的合成等；的薯蓣皂甙的合成等；中中间间型型 产产物物仅仅在在细细胞胞生生长长下下降降时时合合成成，细细胞胞处处于于指指数数生生长长期期或或停停止止生生长长产产物物都都不不合合成成。蒽蒽醌醌类类物物质质合合成成的的植植物物细细胞，托品类生物碱类合成的植物细胞等属于此类型；
40、胞，托品类生物碱类合成的植物细胞等属于此类型；非生长偶联型非生长偶联型 产物合成在细胞生长停止以后。如紫草宁的合成。产物合成在细胞生长停止以后。如紫草宁的合成。现在学习的是第79页，共103页（2 2）选择适宜的起始材料）选择适宜的起始材料 首先必须选择能够高效合成目的产物的植物种类。首先必须选择能够高效合成目的产物的植物种类。再此前提下，起始培养材料还应考虑器官和组织特异性，再此前提下，起始培养材料还应考虑器官和组织特异性，通常选取自然状态下能够积累次生产物的部位，这样的通常选取自然状态下能够积累次生产物的部位，这样的细胞经过培养后常具有合成目的产物的能力，或比较容细胞经过培养后常具有合成目
41、的产物的能力，或比较容易诱导合成目的产物。同时要筛选高产、稳产的细胞株易诱导合成目的产物。同时要筛选高产、稳产的细胞株系。系。现在学习的是第80页，共103页（3 3）选择合适的培养基成分）选择合适的培养基成分 一般来说，增加培养基的一般来说，增加培养基的N N，P P、K K的浓度能促进细的浓度能促进细胞生长，而适当增加糖浓度有利于次生产物的合成。培胞生长，而适当增加糖浓度有利于次生产物的合成。培养基的成分包括培养条件要通过一定的实验才能选择出养基的成分包括培养条件要通过一定的实验才能选择出既有利于细胞大量生长繁殖又有利于次生代谢产物大量既有利于细胞大量生长繁殖又有利于次生代谢产物大量产生的
42、培养基。产生的培养基。现在学习的是第81页，共103页 （4 4）外因）外因 温度温度 pHpH 营养状况营养状况 通气状况通气状况 现在学习的是第82页，共103页（5 5）激发子的应用）激发子的应用 植物细胞次生代谢除了自身的遗传或发育基础外，通常还与植物细胞次生代谢除了自身的遗传或发育基础外，通常还与诱导因子有关。在一些不良环境或有微生物侵入的情况下，细胞诱导因子有关。在一些不良环境或有微生物侵入的情况下，细胞次生代谢活动显著增强。因此，人为合理的应用这些诱导因子，次生代谢活动显著增强。因此，人为合理的应用这些诱导因子，就有可能提高目的产物的产量。就有可能提高目的产物的产量。激发子也称诱
43、导子，是指能够诱导植物细胞中一个反应，并激发子也称诱导子，是指能够诱导植物细胞中一个反应，并形成细胞特征性自身防御反应的分子。形成细胞特征性自身防御反应的分子。A A、非生物激发子，如辐射、金属离子等、非生物激发子，如辐射、金属离子等B B、生物激发子，（外源激发子，多来源于微生物，内源激发子，来、生物激发子，（外源激发子，多来源于微生物，内源激发子，来源于植物本身的物质，如降解细胞壁的酶类，细胞碎片、寡聚糖等。源于植物本身的物质，如降解细胞壁的酶类，细胞碎片、寡聚糖等。现在学习的是第83页，共103页（6 6）培养技术的选择）培养技术的选择 包括对反应器的选择和对培养方式的选择，就目前的技术
44、基础包括对反应器的选择和对培养方式的选择，就目前的技术基础来讲，固定化培养是植物细胞规模化生产较为理想的系统。来讲，固定化培养是植物细胞规模化生产较为理想的系统。为了同时满足细胞生长和产物合成的需要，通常需要在不同阶段使为了同时满足细胞生长和产物合成的需要，通常需要在不同阶段使用不同的培养基，即两阶段培养用不同的培养基，即两阶段培养 为了解决产物对合成的反馈抑制可以采用两相培养技术，为了解决产物对合成的反馈抑制可以采用两相培养技术，液液-液系统：分离相常用的有液体石蜡、烷类化合物、甘油等液系统：分离相常用的有液体石蜡、烷类化合物、甘油等液液-固系统：常用的有活性炭、硅酸镁载体、沸石、蚕丝、树脂
45、等。固系统：常用的有活性炭、硅酸镁载体、沸石、蚕丝、树脂等。一般来说，提取相的选择目标是具有较大的分离能力，同时对于一般来说，提取相的选择目标是具有较大的分离能力，同时对于没有毒副作用，不影响产物的化学稳定性。没有毒副作用，不影响产物的化学稳定性。现在学习的是第84页，共103页第五节 植物转基因技术 现在学习的是第85页，共103页The world according to Monsanto现在学习的是第86页，共103页将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染将目的基因稳定的整合到植物的基因组中，并在子代中得到有效的表达，然后通过细胞和组织培养技术再生出转基因植株.转基因
46、植物（Transgeneplant）利用植物遗传工程进行DNA重组，将优良的目的基因稳定的整合到植物的基因组中，并在子代中得到有效的表达，获得具有新的遗传性状的植物体。一植物转基因技术植物转基因技术现在学习的是第87页，共103页1生产抗体、重组疫苗和多肽类药物2作为生物反应器系统大规模地生产各种蛋白质和多肽等药物，促红细胞生成素、表皮生长因子、生长激素、单克隆抗体、干扰素和疫苗用抗原蛋白。转基因植物应用转基因植物应用现在学习的是第88页，共103页基因的获得、载体系统、基因转化、基因的表达与分析、细胞和组织培养再生出植株。二植物转基因技术过程：植物转基因技术过程：农杆菌转化法现在学习的是第8
47、9页，共103页基因转化-将外源基因导入细胞方法第一类：农杆菌转化技术，间接转化利用农杆菌的Ti质粒将外源基因转入植物细胞。转基因植物中约80%是此转化而来第二类：直接转化技术。基因枪法、电激法、原生质体转化法、碳化硅纤维介导法和花粉管通道法等。三三 基因导入技术基因导入技术现在学习的是第90页，共103页农 杆 菌 在 VirD2蛋 白 帮 助 下，选 择 性 将 T-DNA（转移DNA）（插入Ti质粒上两个25bp重复序列之间）转移到植物染色体上。四四 农杆菌转化系统农杆菌转化系统现在学习的是第91页，共103页三个功能区。三个功能区。转转 移移 DNA区区（T-DNA区）。区）。毒性区（
48、毒性区（Vir区）区）冠冠瘿瘿碱碱代代谢谢基基因因的的编编码区。码区。天然的野生型天然的野生型Ti质粒质粒（Vir区），区），25bp的重复序列的重复序列现在学习的是第92页，共103页构建根癌农杆根瘤菌-大肠杆菌穿梭质粒筛选标记基因启动子信号序列；人工多克隆位点；缩短载体长度。对野生型对野生型Ti质粒的改造：质粒的改造：现在学习的是第93页，共103页1原生质体受体系统改变膜的通透性，烟草、番茄、水稻、小麦和玉米等250多种成功2愈伤组织受体系统外植体，愈伤组织，易接受外源DNA，遗传稳定性较差。3种质系统生殖细胞如花粉粒、卵细胞为受体细胞，是单倍体细胞，成功率高 五受体系统五受体系统现在学
49、习的是第94页，共103页4胚状体再生系统最理想体细胞胚是由具有卵细胞特性的胚性细胞发育而来，接受外源DNA的能力强，繁殖效率高，可通过生物反应器进行大规模生产。5直接分化芽受体系统由未分化的细胞直接分化形成，稳定遗传。操作简单、周期短。转化频率最低受体系统受体系统现在学习的是第95页，共103页1基因水平的检测，限制性内切酶分析、DNA序列分析、聚合酶链式反应(PCR)、Southernblot分析、Northernblot分析、原位杂交六转入基因表达分析转入基因表达分析现在学习的是第96页，共103页酶联免疫吸附法(ELISA)Western杂交-D-葡糖醛酸糖苷酶的组织化学定位分析、-D
50、-葡糖醛酸糖苷酶的荧光分析、-D-葡糖醛酸糖苷酶的化学发光分析荧光素酶分析。定量实时PCR(quantitativereal-timePCR)术通过荧光报告物对PCR反应对基因组中的某个单拷贝基因进行实时检测转基因的拷贝数。PCR产物量与起始模板量成正比。2 表达分析的方法表达分析的方法现在学习的是第97页，共103页Outline植物细胞工程基本概念：定义内容植物细胞培养特性。现在学习的是第98页，共103页植物细胞一般培养技术植物细胞营养需求培养方式培养条件植物细胞种质保藏。现在学习的是第99页，共103页植物细胞原生质体培养技术原生质体制备培养方法及其再生原生质体培养意义。现在学习的是第