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1、关于生物技术生物工程植物细胞工程第1页，讲稿共103张，创作于星期二 第一节 概述掌握植物细胞工程基本概念 及其主要内容 应用了解植物细胞工程的研究简史、现状 及发展前景 热点第2页，讲稿共103张，创作于星期二植物细胞工程的发展历史第3页，讲稿共103张，创作于星期二德国植物学家Haberlandt植物细胞培养创始人1902年根据细胞学说（celltheory）提出植物体细胞有再生完整植株的潜在全能性-细胞全能性细胞全能性（totipotency）植物细胞全能性是植物细胞工程的理论基础第4页，讲稿共103张，创作于星期二1904年，德国植物胚胎学家Hanning用萝卜和辣根的胚进行离体培养，
2、提早长成了小植株，首次获得胚培养成功。成熟发芽常规：幼胚种子植物培养组织培养：幼胚植株第5页，讲稿共103张，创作于星期二1922年，Knudson对兰花幼胚进行培养获得幼苗，克服了兰花种子发芽难的困难。1925年，Laibach进行亚麻种间杂种幼胚培养，成功地得到了杂种植物。1934年，White等用番茄根尖的组织培养，建立了第一个活跃生长的无性繁殖系。1934年，Gautheret培养山毛柳、黑杨的形成层组织，获得愈伤组织形成。第6页，讲稿共103张，创作于星期二1937年，White和Went等分别发现B族维生素和吲哚乙酸（IAA）对培养的离体根生长具有重要作用。1937-1938年，G
3、autheret在1934年培养山毛柳、黑杨成功获得愈伤组织的基础上，在培养柳树的培养基中，加入IAA和B族维生素等，使形成层的生长大为增加。第7页，讲稿共103张，创作于星期二1937-1938年，Nobecourt培养胡萝卜根和马铃薯的块茎薄壁组织，获得愈伤组织愈伤组织。将愈伤组织置于琼脂培养基上继续培养，可无限发生细胞增殖，形成愈伤组织。首次从液泡化的薄壁细胞建立愈伤组织培养物。第8页，讲稿共103张，创作于星期二White、Gautheret、Nobecourt等科学家被誉为植物组织培养的奠基人。在此基础上建立了植物组织培养的综合培养基，包括无机盐成分、无机盐成分、有机成分和生长刺激因
4、素有机成分和生长刺激因素。这是随后创立的各种培养基的基础，同时也建立了植物组织培养的基本方法，成为当今各种植物组织培养的技术基础。第9页，讲稿共103张，创作于星期二第10页，讲稿共103张，创作于星期二第11页，讲稿共103张，创作于星期二一一.植物细胞工程植物细胞工程基本概念基本概念：原理和方法：细胞学、生理学、分子生物学及工程学原理对象：植物细胞设计改造：植物细胞遗传性目标：创造新物种，提供名贵药品及服务第12页，讲稿共103张，创作于星期二二二.植物细胞工程植物细胞工程研究主要内容研究主要内容：植物细胞和组织培养技术原生质体培养和融合技术植物的快速繁殖和人工种子植物染色体工程转基因技术
5、第13页，讲稿共103张，创作于星期二 植物细胞工程植物细胞工程 热点热点1.在无菌和人工控制的条件下，采用植物细胞和组织培养技术培养植物的细胞，组织，器官以获得有药用价值的次生代谢产物。2.采用植物的遗传操作技术改变植物或植物细胞的原有性状和功能，获得具有优良性状的植株或植物细胞，生产有药用价值的次生代谢产物。第14页，讲稿共103张，创作于星期二第二节植物细胞培养特性及主要培养技术第15页，讲稿共103张，创作于星期二细胞的全能性:一个细胞具有产生完整生物个体的固有能力。一、重要概念一、重要概念第16页，讲稿共103张，创作于星期二植物干细胞：植物胚性细胞（embryogeniccells
6、）即合子。分化的根茎叶中仍保留少数未分化或分化程度不高的细胞（遗留的胚性细胞）一、重要概念一、重要概念第17页，讲稿共103张，创作于星期二细胞的脱分化（dedifferentiation):特定条件下，分化细胞被诱导，基因活动模式发生变化，改变原有的发育途径，失去原有的分化状态，转变为具分生能力的胚性细胞。已分化细胞要表现全能性，先要脱分化成分生细胞，后再分化形成胚胎发育成植株脱分化条件：创伤和外源激素。一、重要概念一、重要概念第18页，讲稿共103张，创作于星期二外植体(explant)：植物体上取出的用于培养和分离细胞的组织或器官愈伤组织：植物的伤口或外植体的伤口长出的细胞团，既是组织，
7、又是脱分化细胞次生代谢产物：保持植物的抗逆性，抗病性和抗虫性，及担当信号分子。一、重要概念一、重要概念第19页，讲稿共103张，创作于星期二一、重要概念一、重要概念植物组织培养植物组织培养在无菌条件下，将离体的植物器官(如根尖、茎尖、叶、花、未成熟的果实、种子等)、组织(如形成层、花药组织、胚乳、皮层等)、细胞(如体细胞、生殖细胞等)、胚胎(如成熟和未成熟的胚)、原生质体(如脱壁后仍具有生活力的原生质体)，培养在人工培养基上，给予适宜的培养条件，诱发产生愈伤组织，或潜伏芽等，或长成完整的植株，又分为植株培养、胚胎培养、器官培养、组织培养、原生质体培养等。第20页，讲稿共103张，创作于星期二延
8、迟期：细胞数恒定，高RNA含量，高蛋白质合成能力；加速期：细胞快速生长期。细胞数、DNA和蛋白质浓度增加，有丝分裂活性、RNA含量和蛋白质合成能力减少；对数期：介于最大生长率和蛋白质合成完全停止期之间。增加细胞鲜重、干重及RNA酶活性，蛋白质合成能力完全减退；稳定期：细胞数稳定。细胞高液泡化，极度脆弱，高度分化及高浓度有机化合物。二、培养植物细胞二、培养植物细胞 四个生长时期四个生长时期第21页，讲稿共103张，创作于星期二（1）植物细胞有独特的培养时间及特征：重量的增加在对数期，次生代谢产物积累在稳定期（2）植物细胞很少单一细胞生长，对数生长后期分泌量蛋白和粘多糖，以非均相集合的细胞团悬浮生
9、长。（3）植物细胞好气，培养过程需供气及搅拌，（4）植物细胞较微生物细胞大得多，纤维素细胞壁，细胞壁脆弱，抗剪切能力小，传统的搅拌式反应器极易损伤细胞壁三、植物细胞的培养特点三、植物细胞的培养特点第22页，讲稿共103张，创作于星期二（5）具有群体效应、无锚定依赖性及接触抑制性；（6）培养细胞产物滞留于细胞内，且产量较低；（7）培养过程具有结构与功能全能性。经过增殖与分化，能发育成为植株三、植物细胞的培养特点三、植物细胞的培养特点第23页，讲稿共103张，创作于星期二（1）必需元素大量元素：氮、磷、钾、钙、镁、硫等微量元素：硼、锰、锌、钼、铜、钴、氯等（2）无机氮源，硝酸盐，铵盐为主。（3）碳
10、源，蔗糖（4）需多种维生素烟酸，B1，B6和植物生长激素(生长素，生长素，细胞分裂素，赤霉素，脱落酸，乙烯细胞分裂素，赤霉素，脱落酸，乙烯)。（5）需有机物：甘氨酸或水解络酪蛋白，酵母提取液等。四、植物细胞营养要求四、植物细胞营养要求第24页，讲稿共103张，创作于星期二A BA：6-BA(0 mg/L)，芽（减少），根（增多）愈伤组织（一定量）B：6-BA(0.1mg/L)，芽（适量），根（适量）愈伤组织（一定量）第25页，讲稿共103张，创作于星期二A A：NAA 0 mg/LNAA 0 mg/L，芽（少），根（无），芽（少），根（无）B B：NAA 0.1mg/LNAA 0.1mg/L，
11、芽（少），根（无），愈伤组织（少量），芽（少），根（无），愈伤组织（少量）C C：NAA 5.0mg/LNAA 5.0mg/L，芽（少），根（多），愈伤组织（一定量，芽（少），根（多），愈伤组织（一定量A B C第26页，讲稿共103张，创作于星期二常用培养基MS、N6、B6、RM-1964、KM-8p等。MS培养基是目前应用最多最普遍的培养基。无机培养基是目前应用最多最普遍的培养基。无机盐的浓度较高，能保证组织培养生长所需的矿物营盐的浓度较高，能保证组织培养生长所需的矿物营养。养。五、植物细胞培养基五、植物细胞培养基第27页，讲稿共103张，创作于星期二贮备液（母液）的配制贮备液（母液）的配
12、制 为什么要配制母液？为什么要配制母液？1 1）、方便）、方便 2 2）、准确（有些成分量太小）、准确（有些成分量太小）以以MS培养基配制培养基配制为为例：例：第28页，讲稿共103张，创作于星期二1 1、大量元素母液的配制、大量元素母液的配制各成分按照表各成分按照表1培养基培养基浓浓度含量度含量扩扩大大10倍，按倍，按顺顺序逐步混合。序逐步混合。后用蒸后用蒸馏馏水定容到水定容到1000ml的容量瓶中，即的容量瓶中，即为为10倍的大量元素倍的大量元素母液。倒入母液。倒入细细口瓶，口瓶，贴贴好好标签标签保存于冰箱中。配制培养基保存于冰箱中。配制培养基时时，每，每配配1L培养基取此液培养基取此液1
13、00ml。第29页，讲稿共103张，创作于星期二注意：注意：(1)(1)某些无机成分如某些无机成分如CaCa2+2+、SOSO4 42 2一一、Mg Mg 2 2十十和和H H2 2POPO4 4一一等等在一起可能在一起可能发发生化学反生化学反应应，产产生沉淀物。生沉淀物。为为避免此避免此现现象象发发生，母液配制生，母液配制时时要用要用纯纯度高的重蒸度高的重蒸馏馏水溶解，水溶解，药药品采用等品采用等级较级较高的分析高的分析纯纯，各种化学，各种化学药药品必品必须须先以少量重蒸先以少量重蒸馏馏水使其充分溶水使其充分溶解后才能混合，混合解后才能混合，混合时应时应注意先后注意先后顺顺序。特序。特别应别
14、应将将CaCa2+2+、SOSO4 42 2一一、Mg Mg 2 2十十和和H H2 2POPO4 4一一等离子等离子错错开混合，速度宜慢，开混合，速度宜慢，边搅边搅拌拌边边混合。混合。(2)CaCl(2)CaCl2 22H2H2 2O O要在最后要在最后单单独加入，在溶解独加入，在溶解CaClCaCl2 22H2H2 2O O时时，蒸蒸馏馏水需加水需加热热沸沸腾腾，除去水中的，除去水中的COCO2 2，以防沉淀。另外，以防沉淀。另外，CaClCaCl2 22H2H2 2O O放入沸水中易沸放入沸水中易沸腾腾，操作，操作时时要防止其溢出。要防止其溢出。第30页，讲稿共103张，创作于星期二、微
15、量元素母液的配制、微量元素母液的配制MSMS培养基的微量元素无机培养基的微量元素无机盐盐由由7 7种化合物（除种化合物（除FeFe）组组成。微成。微量元素用量量元素用量较较少，特少，特别别是是CuSOCuSO4 45H5H2 2O O、CoClCoCl2 26H6H2 2OO，因此在配制中分微量因此在配制中分微量、配制。按照表配制。按照表2 2，表，表3 3配方，用感量配方，用感量为为0.0001g0.0001g的分析天平称量，其它同大量元素。配制培养基的分析天平称量，其它同大量元素。配制培养基时时，每配制，每配制1L1L培养基，取微量培养基，取微量10ml10ml，微量，微量mlml第31页
16、，讲稿共103张，创作于星期二第32页，讲稿共103张，创作于星期二3 3、铁盐铁盐母液的配制母液的配制铁盐铁盐不是都需要不是都需要单单独配成母液，如独配成母液，如柠柠檬酸檬酸铁铁，只需和大量元，只需和大量元素一起配成母液即可。目前常用的素一起配成母液即可。目前常用的铁盐铁盐是硫酸是硫酸亚铁亚铁和乙二胺和乙二胺四乙酸二四乙酸二钠钠的螯合物，必的螯合物，必须单须单独配成母液。独配成母液。这这种螯合物使用种螯合物使用起来方便，又比起来方便，又比较稳较稳定，不易定，不易发发生沉淀。配制方法同上，直生沉淀。配制方法同上，直接用蒸接用蒸馏馏水加水加热搅热搅拌溶解。配制培养基拌溶解。配制培养基时时，配制，
17、配制1L1L取此液取此液10ml10ml。第33页，讲稿共103张，创作于星期二在在配配制制铁铁盐盐时时，如如果果加加热热搅搅拌拌时时间间过过短短，会会造造成成Fe S 04和和Na2EDTA鳌鳌合合不不彻彻底底，此此时时若若将将其其冷冷藏藏，Fe S 04会会结结晶晶析析出出。为为避避免免此此现现象象发发生生，配配制制铁铁盐盐母母液液时时，Fe S 04和和Na2EDTA应应分分别别加加热热溶溶解解后后混混合合，并并置置于于加加热热搅搅拌拌器器上上不不断断搅搅拌拌至至溶溶液液呈呈金金黄黄色色(约约加加热热20-30 min)，调调pH值值至至5.5，室温放置冷却后，再冷藏。，室温放置冷却后，
18、再冷藏。第34页，讲稿共103张，创作于星期二4 4、有机母液的配制、有机母液的配制MSMS培养基的有机成分有甘氨酸、肌醇、烟酸、培养基的有机成分有甘氨酸、肌醇、烟酸、盐盐酸酸硫胺素和硫胺素和盐盐酸吡哆素。培养基中的有机成分原酸吡哆素。培养基中的有机成分原则则上上应应分分别单别单独配制。配制直接用蒸独配制。配制直接用蒸馏馏水溶解，注水溶解，注意称量意称量时时用用电电子分析天平。并子分析天平。并贮贮存在棕色无菌瓶存在棕色无菌瓶中中 。配制生物素、叶酸，用稀氨水溶解，然后定容。配制生物素、叶酸，用稀氨水溶解，然后定容。第35页，讲稿共103张，创作于星期二 5 5、植物生、植物生长调节剂长调节剂母
19、液配制母液配制一般植物生一般植物生长调节剂长调节剂母液的配制的母液的配制的终浓终浓度以度以0.5mg/ml0.5mg/ml为为好，好，需要注意的是：需要注意的是：（）配制生（）配制生长长素素类类，例如，例如IAAIAA、NAANAA、2.4-D2.4-D、IBAIBA，应应先用先用少量少量95%95%乙醇或无水乙醇充分溶解，或者用乙醇或无水乙醇充分溶解，或者用1mol/L1mol/L的的NaOHNaOH溶溶解，然后用蒸解，然后用蒸馏馏水定容到一定的水定容到一定的浓浓度。以后者效果好。度。以后者效果好。（）（）细细胞分裂素，例如胞分裂素，例如KTKT，应应先用少量先用少量95%95%乙醇或无水乙
20、乙醇或无水乙醇加醇加3434滴滴1mol/L1mol/L的的盐盐酸溶解，或直接用酸溶解，或直接用1mol/L HCl1mol/L HCl溶解，溶解，再用蒸再用蒸馏馏水定容。水定容。（）（）GA3GA3以以95%95%酒精溶解（不耐高温，酒精溶解（不耐高温，过滤灭过滤灭菌）菌）保存在棕色保存在棕色试剂试剂瓶中。瓶中。第36页，讲稿共103张，创作于星期二注意：注意：所有母液都要所有母液都要贴贴上上标签标签，注明名称、配制倍数、日期，注明名称、配制倍数、日期，所有的母液都所有的母液都应应保存在保存在0404冰箱中，若母液出冰箱中，若母液出现现沉淀沉淀或霉或霉团则团则不能不能继续继续使用。使用。第3
21、7页，讲稿共103张，创作于星期二White的无机盐含量较低，适于生根培养。KM-8p主要用于原生质体培养，含几乎所有单糖和维生素、呼吸代谢中的主要有机酸。凡花药培养中常用培养基，成分较简单，且KN03和(NH)2N04含高。第38页，讲稿共103张，创作于星期二培养基的配制培养基的配制 1 1、计计量量 根据配制培养基的量和母液的根据配制培养基的量和母液的浓浓度度计计算需要吸取母液的量，算需要吸取母液的量，计计算公式：吸取量算公式：吸取量 ml=ml=培养基中物培养基中物质质的含量（的含量（mg/Lmg/L）1000ml/1000ml/母液母液浓浓度（度（mg/Lmg/L）。）。2 2、移液
22、、移液取取烧烧杯一只，加入少量的蒸杯一只，加入少量的蒸馏馏水，按照水，按照计计算吸取母液的量算吸取母液的量依次吸取各母液置于依次吸取各母液置于烧烧杯中杯中备备用。用。第39页，讲稿共103张，创作于星期二3 3、称取、称取琼琼脂蔗糖脂蔗糖备备用用4 4、融化、融化用量杯量取用量杯量取600600700ml700ml的蒸的蒸馏馏水放在水放在电电炉上，加入炉上，加入琼琼脂，脂，边边加加热边热边用玻璃棒用玻璃棒搅搅拌，直到液体呈半透明状将其取拌，直到液体呈半透明状将其取下，加入蔗糖。下，加入蔗糖。大大烧烧杯底的外表面不能沾水，否杯底的外表面不能沾水，否则则加加热时烧热时烧杯容易炸杯容易炸裂，使溶液外
23、溢，造成裂，使溶液外溢，造成烫伤烫伤。第40页，讲稿共103张，创作于星期二5 5、混合、混合将融化的将融化的琼琼脂和母液充分混合，用蒸脂和母液充分混合，用蒸馏馏水定容到水定容到1000ml1000ml，来回，来回混合几次。混合几次。6 6、调调pHpH用滴管吸取物用滴管吸取物质质的量的量浓浓度度为为1 mol/L1 mol/L的的NaOHNaOH或或HClHCl溶液，逐滴溶液，逐滴滴入溶化的培养基中，滴入溶化的培养基中，边边滴滴边搅边搅拌，并随拌，并随时时用精密的用精密的pHpH试纸试纸(5.4(5.47.0)7.0)测测培养基的培养基的pHpH，一直到培养基的，一直到培养基的pHpH达到要
24、求达到要求为为止止(在在调调制制时时要比目要比目标标pHpH值值偏高偏高0.20.20.50.5个个单单位，因位，因为为培养基培养基在在灭灭菌菌过过程中由于糖等物程中由于糖等物质质的降解，的降解，pHpH值值会下降会下降0.20.20.50.5个个单单位左右位左右)。第41页，讲稿共103张，创作于星期二7 7、分装、分装溶化的培养基溶化的培养基应该应该趁趁热热分装。注意不要分装。注意不要让让培养基沾到瓶口和培养基沾到瓶口和瓶壁上。瓶壁上。锥锥形瓶中培养基的量形瓶中培养基的量约为锥约为锥形瓶容量的形瓶容量的1/51/51/41/4。每每1L1L培养基，可分装培养基，可分装20203030瓶。瓶
25、。8 8、包扎、包扎用封口膜封口，外用封口膜封口，外边边可加一可加一层层牛皮牛皮纸纸，扎好，扎好绳绳子，用子，用铅铅笔或碳素墨水笔在牛皮笔或碳素墨水笔在牛皮纸纸上写上培养基的代号。上写上培养基的代号。9 9、培养基的、培养基的灭灭菌菌第42页，讲稿共103张，创作于星期二（一）植物细胞的获得1.外植体直接分离法：机械切割、组织破碎2.愈伤组织分离法：制备小细胞团或单细胞悬液3.原生质体再生法：纤维素和果胶酶混合处理外植体或愈伤组织，分离原生质体，再生培养基中培养，原生质体细胞壁再生。六、植物细胞的六、植物细胞的培养技术培养技术第43页，讲稿共103张，创作于星期二1.单细胞的培养（1）看护培养
26、法（nurseculture）：在单细胞的生长环境里加入愈伤组织同时培养。愈伤组织提供促细胞分裂的物质等，传递生物信息，使细胞分裂增殖。即愈伤组织看护单细胞适用于难于培养的植物种类（二）植物细胞的培养方法（二）植物细胞的培养方法第44页，讲稿共103张，创作于星期二（2）微室培养法：单细胞悬液接种到人工制造一个小室（如凹玻片与盖玻片组成的微室），内含少量培养基，密封培养，使其分裂增殖形成细胞团的方法连续观察，通气性差1.单细胞单细胞的培养的培养第45页，讲稿共103张，创作于星期二（3）平板培养法：将制备好的单细胞悬液，按一定的细胞密度，接种于固体培养基上，或与融化的琼脂培养基均匀混合，并平铺
27、一薄层在培养皿底上的培养方法每个平板上形成的细胞团数植板率（%）=-100%该平板上接种的细胞数1.单细胞单细胞的培养的培养第46页，讲稿共103张，创作于星期二（4）条件培养法：接种于条件培养基上形成的细胞系条件培养基：培养过细胞的培养基上清，有植物生长激素等残留，用于制备成固体培养基。1.单细胞单细胞的培养的培养第47页，讲稿共103张，创作于星期二指将植物单倍体细胞花药培养成单倍体植株或经过染色体加倍成纯二倍体植株。花药培养的基本程序是：外植体(花蕾)选择预处理花蕾消毒取花药接种诱导培养分化培养2.单倍体细胞单倍体细胞的培养的培养（花药花药培养）培养）第48页，讲稿共103张，创作于星期
28、二3.愈伤组织培养愈伤组织培养愈伤组织，为脱分化细胞，具再分化的能力，可培养用于次生代谢物的生产，或再生为植株。第49页，讲稿共103张，创作于星期二(cellsuspensionculture)游离植物细胞悬浮于液体培养基中振荡培养，细胞总数不断增加，产量达最高点后生长趋于停止，然后进行移植继代培养方法4 细胞悬浮培养法细胞悬浮培养法单细胞悬浮0.251050.5105细胞/ml,第50页，讲稿共103张，创作于星期二 1、直接筛选法直接筛选法有新表型或感观上出现可测定的差异进行选择的方法 2、间接筛选法、间接筛选法用与突变表现型具有某种相关的特性为指标筛选 3、绿岛法、绿岛法在植株上使叶面
29、细胞产生突变并创造选择压力，令抗性突变细胞正常生长形成绿色斑点，谓之“绿岛”，切下绿岛即是突变细胞，经分散和培养后即可分化为完整突变植株七、细胞突变体筛选技术七、细胞突变体筛选技术第51页，讲稿共103张，创作于星期二干燥保存法、液体石蜡覆盖法、低温保存法低压低氧保存法超低温深冻保存法八、种质保存八、种质保存 第52页，讲稿共103张，创作于星期二超低温深冻保存法材料：愈伤组织、悬浮培养细胞、原生质体、花粉、花粉胚、体细胞胚状体、茎尖分生组织、小植株及茎芽-196液氮冰冻保护剂二甲亚砜（DMSO）、甘油、山梨糖及蔗糖等，复合成分较单一成分效果佳，5%DMSO+1mol/L山梨醇存活率提高10倍
30、左右。八、种质保存八、种质保存 第53页，讲稿共103张，创作于星期二 第三节原生质体培养 和融合技术 第54页，讲稿共103张，创作于星期二指除去细胞壁的细胞或一个被质膜所包围的且具有生活力的裸露细胞。一、一、原生质体的概念原生质体的概念第55页，讲稿共103张，创作于星期二二、二、原生质体培养技术原生质体培养技术用酶除去植物体细胞的细胞壁，获得原生质体。原生质体在良好的培养基上生长分裂，细胞壁再生，形成愈伤组织，诱导愈伤组织分化，长出茎、叶，根而形成植株。第56页，讲稿共103张，创作于星期二（一）（一）材料准备材料准备无菌试管苗叶片上胚轴和子叶培养细胞第57页，讲稿共103张，创作于星期
31、二（二）（二）原生质体的制备原生质体的制备1，酶处理纤维素酶类半纤维素酶果胶酶类酶溶剂：原生质体培养基或特殊配制。渗透压调节剂：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等。第58页，讲稿共103张，创作于星期二2，原生质体的收集和纯化飘浮法：常用的飘浮剂有蔗糖沉淀法：常用甘露醇作为渗透压调节剂，先将酶液洗出干净，再用Percoll飘浮一次。Percoll一种包有乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒。（二）（二）原生质体的制备原生质体的制备第59页，讲稿共103张，创作于星期二目测法：在显微镜下观察，根据细胞形态、流动性确定原生质体活力。FDA法：FDA（二乙酸荧光素）是一种非极性物质，能自由地穿越细胞质膜，在活细胞内，FDA
32、被酯酶裂解即发荧光（荧光素），荧光素不能自由通过质膜。伊凡蓝法：质膜受到严重损坏使细胞被染色（三）（三）原生质体活力检测原生质体活力检测第60页，讲稿共103张，创作于星期二1.液体浅层培养2.固体培养3.液固双层培养4.琼脂糖珠培养（四）（四）原生质体培养方法原生质体培养方法等渗培养基第61页，讲稿共103张，创作于星期二或体细胞种子概念任何一种离体繁殖体包埋在含有营养成分和保护功能的物质中,在适宜条件下发芽出苗，发育成完整的植株，均可称之为人工种子。第一类是裸露的或休眠的繁殖体，适当干燥的体细胞胚、休眠的微鳞茎和微块茎等第二类为人工种皮包被的繁殖体，一些体细胞胚、原球茎等海藻酸钠作包埋第三
33、类是水凝胶包埋再包被人工种皮的繁殖体，大多数体细胞胚、不定芽、茎尖等人工种子人工种子第62页，讲稿共103张，创作于星期二细胞分裂与细胞壁再生愈伤组织形成愈伤组织分化植株再生（五）（五）愈伤组织形成和植株再生愈伤组织形成和植株再生第63页，讲稿共103张，创作于星期二1.提高变异频率提高变异频率2.细胞工程技术进行遗传重组的材料，细胞融合细胞工程技术进行遗传重组的材料，细胞融合和基因转移必需在原生质体上进行。和基因转移必需在原生质体上进行。三三 原生质体培养意义原生质体培养意义第64页，讲稿共103张，创作于星期二 体细胞杂交体细胞杂交一）类型两大类：对称融合（asymmetricfusion
34、）两个完整的细胞原生质体融合。非对称融合（symmetricfusion）利用物理或化学方法使某亲本的核或细胞质失活后再进行融合。核失活X射线，碘乙酰胺（IOA）、碘乙酸质失活罗丹明（R6G，抑制线粒体氧化磷酸化。四、原生质体融合技术四、原生质体融合技术第65页，讲稿共103张，创作于星期二 1材料准备2原生质体的制备3融合方法PEG，电融合4杂种细胞选择系统与杂种植株鉴定5.细胞壁再生愈伤组织形成和植株再生二）融合过程二）融合过程第66页，讲稿共103张，创作于星期二 3融合方法PEG，电融合二）融合过程二）融合过程按比例混合双亲原生质体滴加PEG摇匀静置滴加高钙高pH液，摇匀静置滴加原生质
35、体培养液洗涤数次离心得原生质体细胞团筛选再生杂合细胞。第67页，讲稿共103张，创作于星期二 1）杂种细胞的选择系统外观选择互补选择荧光标记选择4.杂种细胞选择系统与杂种植株鉴定杂种细胞选择系统与杂种植株鉴定第68页，讲稿共103张，创作于星期二2）体细胞杂种的鉴定形态鉴定：根据双亲的形态学性状观察进行鉴定。细胞学鉴定：细胞器鉴定、染色体鉴定。生化鉴定：同功酶鉴定。分子鉴定：RFLP鉴定、RAPD标记鉴定。4 杂种细胞选择系统与杂种植株的鉴定杂种细胞选择系统与杂种植株的鉴定第69页，讲稿共103张，创作于星期二RFLP基因型之间限制性片段长度的差异RAPD建立在PCR基础之上的一种可对整个未知
36、序列的基因组进行多态性分析的分子技术4 杂种细胞选择系统与杂种植株的鉴定杂种细胞选择系统与杂种植株的鉴定第70页，讲稿共103张，创作于星期二第71页，讲稿共103张，创作于星期二原生质体培养13天，细胞壁再生再生细胞一旦分裂，继续生长1形成细胞团，发育成愈伤组织，诱导分化出芽及根再生为完整植株；2形成胚状体，再产生植株；5、细胞壁再生愈伤组织形成和植株再生、细胞壁再生愈伤组织形成和植株再生第72页，讲稿共103张，创作于星期二1、植物育种中的核质替换2、细胞质杂种的获得3、远缘杂交创造新物种4、细胞器的互作研究三）、融合技术应用三）、融合技术应用第73页，讲稿共103张，创作于星期二第四节
37、植物细胞大规模培养技术 第74页，讲稿共103张，创作于星期二植物细胞规模培养技术要点植物细胞规模培养技术要点（1 1）细胞系的建立和选择）细胞系的建立和选择有效成分分析有效成分分析悬浮细胞系悬浮细胞系单细胞培养与筛选单细胞培养与筛选细胞增殖细胞增殖第75页，讲稿共103张，创作于星期二（2 2）优良细胞系的增殖培养）优良细胞系的增殖培养 所选择的优良细胞系，进行大规模繁殖，所选择的优良细胞系，进行大规模繁殖，得到足够的细胞是建立细胞规模化培养体系的中得到足够的细胞是建立细胞规模化培养体系的中间环节。间环节。第76页，讲稿共103张，创作于星期二 （3 3）大规模培养体系的建立）大规模培养体系
38、的建立 一步法逐级放大：对于细胞生长与目的产物合成同步的类型，一步法逐级放大：对于细胞生长与目的产物合成同步的类型，一般采用此方法建立大规模培养系统。一般采用此方法建立大规模培养系统。两步法：用于目的产物合成在细胞生长发育到一定时期进两步法：用于目的产物合成在细胞生长发育到一定时期进行，细胞生长和产物合成需要不同的培养基的类型。先在细胞行，细胞生长和产物合成需要不同的培养基的类型。先在细胞生长培养基中培养大批量细胞，当细胞生长至合成产物的阶段生长培养基中培养大批量细胞，当细胞生长至合成产物的阶段后，再将其转入到产物合成培养基中培养。后，再将其转入到产物合成培养基中培养。如果采用固相培养方式生产
39、次生产物，一般均需采用如果采用固相培养方式生产次生产物，一般均需采用两步法建立体系。两步法建立体系。第77页，讲稿共103张，创作于星期二培养方式的选择：培养方式的选择：分批培养分批培养 间歇培养流加间歇培养间歇培养流加间歇培养 两级或多级间歇培养两级或多级间歇培养 连续培养单级连续培养连续培养单级连续培养 多级连续培养多级连续培养 回流式连续培养回流式连续培养 固定化细胞培养固定化细胞培养第78页，讲稿共103张，创作于星期二提高细胞次生代谢产物的途径提高细胞次生代谢产物的途径 （1 1）明确植物细胞生长与产物合成的关系）明确植物细胞生长与产物合成的关系 生生长长偶偶联联型型 产产物物合合成
40、成与与细细胞胞生生长长成成正正比比。如如长长春春花花属属植植物物中中的的长长春春花花碱碱的的合合成成、烟烟草草细细胞胞的的烟烟碱碱合合成成、薯薯蓣蓣属属植植物物中中的的薯薯蓣蓣皂皂甙甙的的合成等；合成等；中中间间型型 产产物物仅仅在在细细胞胞生生长长下下降降时时合合成成，细细胞胞处处于于指指数数生生长长期期或或停停止止生生长长产产物物都都不不合合成成。蒽蒽醌醌类类物物质质合合成成的的植植物物细细胞胞，托品类生物碱类合成的植物细胞等属于此类型；托品类生物碱类合成的植物细胞等属于此类型；非生长偶联型非生长偶联型 产物合成在细胞生长停止以后。如紫草宁的合成。产物合成在细胞生长停止以后。如紫草宁的合成
41、。第79页，讲稿共103张，创作于星期二（2 2）选择适宜的起始材料）选择适宜的起始材料 首先必须选择能够高效合成目的产物的植物种类。再首先必须选择能够高效合成目的产物的植物种类。再此前提下，起始培养材料还应考虑器官和组织特异性，通此前提下，起始培养材料还应考虑器官和组织特异性，通常选取自然状态下能够积累次生产物的部位，这样的细胞常选取自然状态下能够积累次生产物的部位，这样的细胞经过培养后常具有合成目的产物的能力，或比较容易诱导经过培养后常具有合成目的产物的能力，或比较容易诱导合成目的产物。同时要筛选高产、稳产的细胞株系。合成目的产物。同时要筛选高产、稳产的细胞株系。第80页，讲稿共103张，
42、创作于星期二（3 3）选择合适的培养基成分）选择合适的培养基成分 一般来说，增加培养基的一般来说，增加培养基的N N，P P、K K的浓度能促进细胞的浓度能促进细胞生长，而适当增加糖浓度有利于次生产物的合成。培养基的生长，而适当增加糖浓度有利于次生产物的合成。培养基的成分包括培养条件要通过一定的实验才能选择出既有利于细成分包括培养条件要通过一定的实验才能选择出既有利于细胞大量生长繁殖又有利于次生代谢产物大量产生的培养基。胞大量生长繁殖又有利于次生代谢产物大量产生的培养基。第81页，讲稿共103张，创作于星期二 （4 4）外因）外因 温度温度 pHpH 营养状况营养状况 通气状况通气状况 第82
43、页，讲稿共103张，创作于星期二（5 5）激发子的应用）激发子的应用 植物细胞次生代谢除了自身的遗传或发育基础外，通常还与诱导植物细胞次生代谢除了自身的遗传或发育基础外，通常还与诱导因子有关。在一些不良环境或有微生物侵入的情况下，细胞次生代谢因子有关。在一些不良环境或有微生物侵入的情况下，细胞次生代谢活动显著增强。因此，人为合理的应用这些诱导因子，就有可能提高活动显著增强。因此，人为合理的应用这些诱导因子，就有可能提高目的产物的产量。目的产物的产量。激发子也称诱导子，是指能够诱导植物细胞中一个反应，并形成激发子也称诱导子，是指能够诱导植物细胞中一个反应，并形成细胞特征性自身防御反应的分子。细胞
44、特征性自身防御反应的分子。A A、非生物激发子，如辐射、金属离子等、非生物激发子，如辐射、金属离子等B B、生物激发子，（外源激发子，多来源于微生物，内源激发子，、生物激发子，（外源激发子，多来源于微生物，内源激发子，来源于植物本身的物质，如降解细胞壁的酶类，细胞碎片、寡来源于植物本身的物质，如降解细胞壁的酶类，细胞碎片、寡聚糖等。聚糖等。第83页，讲稿共103张，创作于星期二（6 6）培养技术的选择）培养技术的选择 包括对反应器的选择和对培养方式的选择，就目前的技术基础来讲，包括对反应器的选择和对培养方式的选择，就目前的技术基础来讲，固定化培养是植物细胞规模化生产较为理想的系统。固定化培养是
45、植物细胞规模化生产较为理想的系统。为了同时满足细胞生长和产物合成的需要，通常需要在不同阶段使用不为了同时满足细胞生长和产物合成的需要，通常需要在不同阶段使用不同的培养基，即两阶段培养同的培养基，即两阶段培养 为了解决产物对合成的反馈抑制可以采用两相培养技术，为了解决产物对合成的反馈抑制可以采用两相培养技术，液液-液系统：分离相常用的有液体石蜡、烷类化合物、甘油等液系统：分离相常用的有液体石蜡、烷类化合物、甘油等液液-固系统：常用的有活性炭、硅酸镁载体、沸石、蚕丝、树脂等。固系统：常用的有活性炭、硅酸镁载体、沸石、蚕丝、树脂等。一般来说，提取相的选择目标是具有较大的分离能力，同时对于一般来说，提
46、取相的选择目标是具有较大的分离能力，同时对于没有毒副作用，不影响产物的化学稳定性。没有毒副作用，不影响产物的化学稳定性。第84页，讲稿共103张，创作于星期二第五节 植物转基因技术 第85页，讲稿共103张，创作于星期二The world according to Monsanto第86页，讲稿共103张，创作于星期二将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染将目的基因稳定的整合到植物的基因组中，并在子代中得到有效的表达，然后通过细胞和组织培养技术再生出转基因植株.转基因植物（Transgeneplant）利用植物遗传工程进行DNA重组，将优良的目的基因稳定的整合到植物的基因组中
47、，并在子代中得到有效的表达，获得具有新的遗传性状的植物体。一植物转基因技术植物转基因技术第87页，讲稿共103张，创作于星期二1生产抗体、重组疫苗和多肽类药物2作为生物反应器系统大规模地生产各种蛋白质和多肽等药物，促红细胞生成素、表皮生长因子、生长激素、单克隆抗体、干扰素和疫苗用抗原蛋白。转基因植物应用转基因植物应用第88页，讲稿共103张，创作于星期二基因的获得、载体系统、基因转化、基因的表达与分析、细胞和组织培养再生出植株。二植物转基因技术过程：植物转基因技术过程：农杆菌转化法第89页，讲稿共103张，创作于星期二基因转化-将外源基因导入细胞方法第一类：农杆菌转化技术，间接转化利用农杆菌的
48、Ti质粒将外源基因转入植物细胞。转基因植物中约80%是此转化而来第二类：直接转化技术。基因枪法、电激法、原生质体转化法、碳化硅纤维介导法和花粉管通道法等。三三 基因导入技术基因导入技术第90页，讲稿共103张，创作于星期二农 杆 菌 在 VirD2蛋 白 帮 助 下，选 择 性 将 T-DNA（转移DNA）（插入Ti质粒上两个25bp重复序列之间）转移到植物染色体上。四四 农杆菌转化系统农杆菌转化系统第91页，讲稿共103张，创作于星期二三个功能区。三个功能区。转转 移移 DNA区区（T-DNA区）。区）。毒性区（毒性区（Vir区）区）冠冠瘿瘿碱碱代代谢谢基基因因的的编码区。编码区。天然的野生
49、型天然的野生型Ti质粒质粒（Vir区），区），25bp的重复序列的重复序列第92页，讲稿共103张，创作于星期二构建根癌农杆根瘤菌-大肠杆菌穿梭质粒筛选标记基因启动子信号序列；人工多克隆位点；缩短载体长度。对野生型对野生型Ti质粒的改造：质粒的改造：第93页，讲稿共103张，创作于星期二1原生质体受体系统改变膜的通透性，烟草、番茄、水稻、小麦和玉米等250多种成功2愈伤组织受体系统外植体，愈伤组织，易接受外源DNA，遗传稳定性较差。3种质系统生殖细胞如花粉粒、卵细胞为受体细胞，是单倍体细胞，成功率高 五受体系统五受体系统第94页，讲稿共103张，创作于星期二4胚状体再生系统最理想体细胞胚是由具
50、有卵细胞特性的胚性细胞发育而来，接受外源DNA的能力强，繁殖效率高，可通过生物反应器进行大规模生产。5直接分化芽受体系统由未分化的细胞直接分化形成，稳定遗传。操作简单、周期短。转化频率最低受体系统受体系统第95页，讲稿共103张，创作于星期二1基因水平的检测，限制性内切酶分析、DNA序列分析、聚合酶链式反应(PCR)、Southernblot分析、Northernblot分析、原位杂交六转入基因表达分析转入基因表达分析第96页，讲稿共103张，创作于星期二酶联免疫吸附法(ELISA)Western杂交-D-葡糖醛酸糖苷酶的组织化学定位分析、-D-葡糖醛酸糖苷酶的荧光分析、-D-葡糖醛酸糖苷酶的