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1、个人收集整理 仅供参考学习生物技术综合试验报告 第一局部试验一工作液的配制、培育基配制、器皿洗涤及灭菌一、试验目的把握各种工作液配制方法；了解植物培育基的构成及配制方法；把握高温高压灭菌的方法。二、原理培育基是植物组织培育的根本条件，同时也是关键因素。湿热条件(121的蒸汽，10 分钟)能够有效地杀灭附着在玻璃器皿、器具以及溶液和培育基中的微生物到达灭菌的目的。三、器具和试剂灭菌锅，天平，电炉，微波炉，三角瓶，封口膜，移液管，移液器，量筒，烧杯，pH 试纸，培育皿，滤纸，Parafilm 封口膜。琼脂，MS 培育基大量元素，无菌水，葡萄糖，2, 4-D，IBA，KT 感动素，1M NaOH 及
2、 HCl，卡那霉素，头孢霉素，乙酰丁香酮 。四、 试验内容PH 调整剂的配制、培育基母液的配制、培育基的配制、各种相关物品的预备一培育基的配制步骤1、取个干净烧杯，参加 1/3-2/3 左右的蒸馏水，用移液管取所需的母液参加烧杯。2、称取定量的蔗糖参加烧杯中并不断搅拌，直到完全溶解，定容。3、用 NaOH 或者 稀 HCL 调剂酸碱值。4、称取定量琼脂糖参加烧杯中，加热煮沸搅拌，待琼脂完全溶解，分装。5、高压灭菌121,15min-20min)。个人收集整理 仅供参考学习6、冷却，取出，备用。二棉花无菌苗培育基的制备1、取 25 ml MS 大量元素母液，称取葡萄糖 15g、于 1 升的烧杯中
3、，定容后调 pH值为 6.0，参加 7.5g/l 琼脂煮沸。2、然后将其分装到 100 毫升的三角瓶中，每瓶 40 毫升。3、用封口膜封口后在灭菌锅中灭菌 15 分钟。4、灭菌后置于水平的工作台上冷却即可。要求：配制 1L三拟南芥无菌苗培育基的制备1、拟南芥无菌苗培育基：1/2 MS 大量元素+蔗糖 10g/L，PH 值 6.0；参加 7.5g 琼脂高温高压灭菌。2、0.1%琼脂糖：0.1g 琼脂糖/100ml 蒸馏水；无菌苗培育基和 0.1%琼脂糖均 121 高压灭菌 15 分钟。3、另预备 20 套 9cm 培育皿，灭菌。要求：配制 0.5L，装 1 瓶灭菌，灭菌后培育基倒皿。五、留意事项
4、1、为了尽量削减人为的误差，必需严格按试验步骤进展操作，严格依据要求的量来配制工作液、母液及培育基。2、应当把培育基中的各种成分都写在纸上，加进去一个以后即划掉一个。3、全部装着培育基的试管、玻璃罐、玻璃瓶和培育皿等都应当清楚地做上标记。4、每小组的操作的具体事项请参照黑板上贴的任务分组。5、疼惜试验仪器及耗材，留神使用玻璃器皿，合理灭菌，由于灭菌耗时较长。个人收集整理 仅供参考学习一、原理试验二无菌苗的制备化学灭菌：0.1%升汞(Hgcl2)溶液浸泡 10 分钟可以对棉花种子等外植体进展灭菌，84 消毒液2%的次氯酸钠浸泡 3 分钟可以对拟南芥等小种子外植体进展消毒。物理消毒：紫外灯消毒、酒
5、精灯火焰或高温烧灼 5min 左右可有效杀死镊子、剪刀等不锈钢操作器具的菌类到达消毒的目的。二、试验材料、器具和试剂棉花品种 YZ1;拟南芥 col-0 野生型 灭菌锅，天平，电炉，三角瓶，封口膜，镊子， 酒精灯，剪刀，移液管，超净工作台。0.1%升汞溶液，84 消毒液，75%酒精三、试验内容一拟南芥无菌苗培育基倒皿1. 取上次灭菌好的拟南芥培育基500ml 装，略微拧松瓶盖，微波炉煮沸，边煮边摇动，至全部溶化。2. 将上次灭菌好的 9cm 培育皿分开放置超净工作台超净工作台需先翻开上。3. 将溶化好的培育基分装于培育皿中500ml/18-20 皿，将皿至于超净台上吹干.。二共培育培育基的配制
6、成分数量成分数量MS 大量元素 (20 倍50 ml2,4-D(0.1mg/ ml)1 mlNH4NO3(20 倍)50 ml甘氨酸(1000 倍)1 ml微量元素(100 倍)10 mlKT(0.1mg/ml)1 ml个人收集整理 仅供参考学习铁盐(100 倍)10 ml葡萄糖30g/L微生素(1000 倍)1 mlPH 值5.85-5.90肌醇(100 倍)1 ml依次参加上述物质，调PH 值 5.85-5.90，然后分装至2 个 500ml 蓝盖瓶，每瓶参加4g 琼脂，灭菌，灭菌后倒皿。三选择培育基的配制共培育培育基 +卡那霉素 50mg/L + 头孢霉素 400 mg/L灭菌后，待培育
7、基凉至 60 度左右参加，混匀，倒皿。四棉花无菌苗的制备1、将棉籽用手术剪刀去壳每人 3 颗，饱满无病虫害种子。2、用 0.1%的升汞灭菌 13 分钟。3、无菌水冲洗三遍，接种于无菌苗培育基中。4、28条件下暗培育 7 天 304 培育箱。五拟南芥无菌苗的制备大量法灭菌：将拟南芥种子放入 1.5ml 离心管中，参加 84 消毒液：无菌水=1:1 的混合液 1ml，上下摇摆灭菌 2min，弃消毒液；参加 1ml 75%的酒精混匀 1min，然后无菌水清洗 4 次；参加0.1%琼脂糖溶液悬浮种子，用移液枪涂布于拟南芥无菌苗培育基， 吹干，封口。弱光培育两天至种子萌发，转至光照培育室培育两周304
8、培育箱。五、留意事项全部操作除数种子均在超净工作台上进展。六、试验结果一周后观看无菌苗的生长状况个人收集整理 仅供参考学习1、六瓶接种的棉花无菌苗中有一瓶被轻度污染，其余五瓶生长状况良好。2、拟南芥的无菌苗因涂布不均匀长势一般，幼苗较其他小组要弱小，叶片颜色较深。试验三愈伤组织的诱导及农杆菌介导的棉花遗传转化一、试验目的个人收集整理 仅供参考学习把握植物体细胞胚胎发生的根本理论；了解植物愈伤组织在诱导和分化过程中的形态学、细胞学特征；进一步稳固植物离体培育和无菌操作的步骤；把握植物遗传转化的方法、理论；把握根癌农杆菌介导的植物遗传转化技术。二、试验原理植物细胞全能性：植物的每个细胞都包含着该物
9、种的全部遗传信息，从而具备发育成完整植株的遗传力量。愈伤组织：胚性愈伤：呈淡黄色或者黄绿色，质地较均匀；细胞球状或近球状，细胞核大，细胞质浓非胚性愈伤：呈褐色、白色粉末状或白色、绿色坚硬块状 ；细胞一般为长柱状等非规章外形，细胞核小，细胞质较稀 。农杆菌介导转基因的原理：植物细胞在受伤后，创伤分子诱导农杆菌Vir 区各种基因的激活和表达，导致T-DNA 被剪切，加工，形成T-链蛋白复合体T-复合体，通过农杆菌和植物细胞的细胞膜，细胞壁进入植胞内，T-复合体上的核靶向序列可引导T-DNA 整合到植物基因组。三、材料与用品1、试验材料：棉花材料 YZ1上周做的无菌苗、农杆菌菌株 LBA4404。2
10、、用具： 超净工作台， 显微镜，载玻片，天平，三角瓶，封口膜，橡皮筋，镊子，酒精灯，培育皿，滤纸，剪刀，医用手术刀，摇床。3、药品：诱导、共培育培育基，卡宝品红染色液，MGL 活化培育基，LB 培育基， 乙酰丁香酮AS。四、试验步骤个人收集整理 仅供参考学习一棉花愈伤组织的诱导及观看1、愈伤诱导培育基的配制第 1 周已做2、无菌苗的制备3、无菌苗的切取：选取培育 7 天左右强健的无菌苗置于垫有滤纸的培育皿上，用解剖刀切掉子叶及生长点，切掉胚根及相连的约 1/4 的下胚轴，余下的下胚轴用作愈伤组织诱导的外植体，用解剖刀将下胚轴切成0.7cm 小段。4、外植体接种及离体培育：将切离好的外植体接种于
11、愈伤诱导培育基上每瓶约7 段，平行放置，28光照培育，每天 14 小时间照，进展愈伤组织诱导及增殖培育。5、愈伤组织继代一个月后：待培育一个月左右，将增殖后的愈伤组织连同下胚轴切断继代到分化培育基上，进展胚性愈伤组织的分化。6、愈伤组织形态观看：分别挑取少量非胚性愈伤和胚性愈伤组织，置于载玻片上， 滴几滴清水用镊子捣碎愈伤组织，然后滴加一滴卡宝品红染色数秒钟后，在显微镜下观看比较两者细胞学特征。二农杆菌介导的棉花下胚轴的遗传转化1、共培育及选择培培育基的配制第 2 周已做，没倒皿的组倒皿2、无菌苗的制备第 2 周已做3、农杆菌的活化争论生帮助做：从超低温冰箱内取出保存菌株的甘油管在冰上溶化；按
12、 1:100 的体积参加 20ml LB 液体培育基里摇菌，28暗培育 36-48hr；将浑浊的农杆菌液涂布于 LB 平皿上，28暗培育 36-48hr；把培育基外表菌落刮入装有 20ml MGL 培育基的三角瓶中按 1/1000 比例参加 AS，28、200rpm 摇 30min；OD 值在 0.5-1.5 之间估量即可用于侵染。4、下胚轴与农杆菌共培育：把无菌苗切成7mm 茎段同诱导程序，用镊子夹到个人收集整理 仅供参考学习经活化的菌液中进展侵染，摇匀，侵染 10 分钟；倒掉菌液，将下胚轴转入装有滤纸的灭菌培育皿中，吹 5 分钟使外表稍为枯燥；再将下胚轴分散布于垫有滤纸的共培育培育基中，1
13、9-21, 暗培育 48-60 小时完毕共培育。5、选择培育48-60 小时后：把经过共培育的下胚轴用镊子转入选择培育基中，培育 30 天左右继代一次转入一样的选择培育基中。五、留意事项1、在切无菌苗时，肯定要使用锐利的刀片,尽量做到一刀能切断，避开挤压茎段。2、无菌苗培育时间不宜过长培育七天最好。3、从超低温冰箱内取出的甘油管，应尽量削减其在冰箱外的时间，用完后尽快放回冰箱。4、侵染时下胚轴稍为枯燥可以增加农杆菌的吸附。5、共培育后第一次进展选择培育时应尽量使培育的环境保持枯燥，可以削减农杆菌的污染。6、整个过程均为无菌操作环境。六、试验结果：1. 锥形瓶与平皿中的下胚轴生长状况均良好，观看
14、到平皿中农杆菌介导转化的下胚轴有发黑的现象，而锥形瓶中诱导的愈伤组织则无发黑现象。2. 两个平皿中的拟南芥均生长缓慢且幼叶发黄，推想缘由可能与杂菌感染有关。个人收集整理 仅供参考学习个人收集整理 仅供参考学习试验四植物原生质体的分别、纯化一、试验目的了解植物原生质体分别和纯化的原理；把握植物原生质体分别和纯化的方法；把握原生质体活力测定和原生质体计数的方法。二、试验原理个人收集整理 仅供参考学习植物原生质体是指细胞中去掉了细胞壁后的局部。植物细胞在纤维素酶，半纤维素酶和果胶酶的作用下，细胞壁被消化。纤维素酶的作用是降解构成细胞壁的纤维素，果胶酶是用来降解连接细胞的中胶层，使细胞丛组织中解离出来
15、，可以得到暴露的原生质体。原生质体在适宜的培育条件下，能再生细胞壁，进展分裂、生长、形成愈伤组织， 进一步分化成根和芽，长成的植株，表现了植物细胞的全能性。三、材料与用品1、材料：棉花胚性愈伤组织，拟南芥叶片。2、器材和用具：低速离心机，血球计数板，不锈钢筛140 和 400 目，一般显微镜，玻璃试管及吸头。3、试剂：CPW9 和CPW25 溶液高温高压灭菌，台盼蓝。四、试验步骤1、材料的预备拟南芥无菌苗的制备第 2 周已种。2、原生质体酶解分别（1） 愈伤组织原生质体的分别：1g 颗粒状、颖的愈伤组织于 6cm 培育皿中，参加 6 ml 酶混合液，轻轻摇匀，封口膜封口，置于摇床,40 转酶解
16、 14 小时。（2） 叶肉原生质体的分别：取约 2g 拟南芥幼嫩叶片于 6cm 培育皿中，用解剖刀将叶片切碎，参加 6 ml 酶混合液，轻轻摇匀，封口膜封口，28黑暗条件下酶解 4 小时。3、原生质体的纯化（1） 酶解后的原生质体-酶混合物经双层不锈钢网140 和 400 目去掉残渣参加个人收集整理 仅供参考学习CPW9M 洗涤，滤液在10ml 的玻璃离心管中离心 45 分钟800rpm，使原生质体沉于管底，细胞壁等碎片浮在液面。（2） 弃除上清夜，原生质体参加 2ml 的 CPW9M 轻轻混匀。（3） 在另一离心管中参加 6ml CPW25S 溶液，在其上轻轻参加混有原生质体的CPW9M 溶
17、液，离心 45 分钟800rpm，原生质体在两液面形成一条带，其它的杂质及少量的原生质体沉于管底。（4） 将原生质体轻轻地吸出，转入另一试管，参加 5ml CPW9M 溶液洗涤，离心 45min800rpm。（5） 去掉上清夜,再用 CPW9M 溶液洗涤，离心 45min800rpm，弃去上清液，参加 1ml CPW9M 溶液悬浮。4、原生质体活性检测依红 Y 检测法：吸取少许原生质体悬液涂于载玻片上，滴一滴依红 Y ，染色 5 分钟，轻轻加上盖玻片。在光学显微镜下观看，调整不同光源，取5 任意视野分别总原生质体数和有活力的原生质体数。活力用暗视野下未染上色的原生质体数占同一明视野原生质体数的
18、比例表示5、原生质体计数（1） 将血球计数板及盖片用水擦试干净；（2） 用滴管吸取少许原生质体悬液，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘摘入一小滴；（3） 低倍镜下找到计数室后，再转换高倍镜观看并计数；（4） 求出每一个小格中原生质体平均数N，按公式计算出每 mlg悬液所含原生质体数量。个人收集整理 仅供参考学习五、留意事项1、原生质体纯化时，两种洗液的使用挨次和用量的比例不要颠倒了。2、原生质体纯化时，吸取原生质体带动作要轻，尽量一次吸完。3、使用血球计数板时首先要清楚使用的是哪种计数板。4、吸取悬液的量尽量少，避开悬液的高度过高，加盖片时要轻，以免原生质体密度不均一六、试验结果。5 个视野内原生质体计数总数无活力原生质体有活力原生质体数量个1212398个人收集整理 仅供参考学习