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1、荧光定量荧光定量荧光定量荧光定量PCRPCR技术技术技术技术及临床应用及临床应用及临床应用及临床应用 1荧光基因探针杂交定量荧光基因探针杂交定量PCRPCR技术介绍技术介绍 1985年美国年美国PE-cetus公司的人类遗传探讨室公司的人类遗传探讨室mullis等等人独创了具有划时代意义的人独创了具有划时代意义的PCR技术，从而使人们梦技术，从而使人们梦寐以求的体外扩增核酸片段的愿望成为现实。寐以求的体外扩增核酸片段的愿望成为现实。1987年该项技术获美国专利。年该项技术获美国专利。1988年年PE-cetus公司推出了第一台公司推出了第一台PCR热循环仪，从热循环仪，从而使而使PCR技术的自
2、动化成为现实。技术的自动化成为现实。Mullis出因其卓越的贡献与寡核苷酸基因定点诱变的独出因其卓越的贡献与寡核苷酸基因定点诱变的独创者创者Michael共享了共享了1993年诺贝尔化学奖。年诺贝尔化学奖。随着随着PCR技术的日臻成熟技术的日臻成熟1995年出现荧光基因探针杂年出现荧光基因探针杂交定量交定量PCR方法方法 2传统的临床微生物检测方法传统的临床微生物检测方法传统的临床微生物检测方法传统的临床微生物检测方法 细菌涂片细菌涂片 细菌培育细菌培育 免疫学技术免疫学技术 分别存在分别存在检出率低、周期长、特异性差检出率低、周期长、特异性差的缺点。的缺点。3一般一般一般一般 PCRPCRP
3、CRPCR 临床检测技术的缺点临床检测技术的缺点临床检测技术的缺点临床检测技术的缺点一般一般PCRPCR临床检测技术虽然解决了检出率低、临床检测技术虽然解决了检出率低、周期长的问题，但由于假阳性率高，不能正确周期长的问题，但由于假阳性率高，不能正确指导临床实践。指导临床实践。因此国家卫生部曾在因此国家卫生部曾在19971997年行文禁止将一般年行文禁止将一般PCRPCR技术用于临床诊断。技术用于临床诊断。4FQ-PCR与一般PCR的区分 接受闭管检测，不需PCR后处理，并接受dUTP-UNG酶的防污染系统，扩增和检测一次同时完成。不需开盖，不产生污染。避开了假阳性。探针与被检DNA序列特异杂交
4、，增加了特异性。5FQ-PCR与一般PCR的区分可可定定量量结结果果，精精确确灵灵敏敏地地反反应应了了病病原原体体的的感感染和治疗复原状况。染和治疗复原状况。光光谱谱分分析析仪仪直直读读结结果果，自自动动分分析析，增增加加了了灵灵敏性和客观性。敏性和客观性。6荧光基因探针杂交定量荧光基因探针杂交定量PCRPCR技术技术 随着随着PCR技术的日臻成熟，已出现的荧光基技术的日臻成熟，已出现的荧光基因探针杂交定量因探针杂交定量PCR方法把目的基因扩增、方法把目的基因扩增、特异分子杂交和荧光化学融为一体，使特异分子杂交和荧光化学融为一体，使PCR扩增和产物分析的全过程均在单管封闭条件扩增和产物分析的全
5、过程均在单管封闭条件下进行，并通过微机限制，实现了对扩增下进行，并通过微机限制，实现了对扩增产物进行实时动态检测和结果的自动分析。产物进行实时动态检测和结果的自动分析。7荧光基因探针杂交定量荧光基因探针杂交定量PCRPCR技术技术 不仅进一步提高了特异性，并从根本上解决了不仅进一步提高了特异性，并从根本上解决了PCR扩扩增产物污染的难题，保持了增产物污染的难题，保持了PCR技术的快速和高灵敏技术的快速和高灵敏性，使假阳性率和假阴性率降低到最低限度，而且能性，使假阳性率和假阴性率降低到最低限度，而且能定量被检微生物的核酸拷贝数，为临床实践供应精确定量被检微生物的核酸拷贝数，为临床实践供应精确的病
6、原微生物的诊断、供应评估药物临床治疗效果的的病原微生物的诊断、供应评估药物临床治疗效果的牢靠依据。牢靠依据。因此，荧光基因探针杂交定量因此，荧光基因探针杂交定量PCR技术诊断病原微生技术诊断病原微生物与迄今本院各临床科室所进行的临床检测技术不相物与迄今本院各临床科室所进行的临床检测技术不相重复，它是一种属不同层次、快速、精确、干脆并具重复，它是一种属不同层次、快速、精确、干脆并具有不同临床指导意义的检测方法。有不同临床指导意义的检测方法。8荧光定量聚合酶链反应荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCRFluorescence quantitative PCR）一一种种完完全全闭闭管管式式的的PCR和和
7、荧荧光光探探针针杂杂交交技术相结合的定量技术相结合的定量PCR方法方法 PCR的高效扩增特性的高效扩增特性 核酸探针的高特异性核酸探针的高特异性 光谱技术的高灵敏性和可计量性光谱技术的高灵敏性和可计量性9荧光基因探针杂交定量荧光基因探针杂交定量荧光基因探针杂交定量荧光基因探针杂交定量PCRPCR 技术与临床技术与临床技术与临床技术与临床 在确保特异性的前题下，高质的灵敏性使得在确保特异性的前题下，高质的灵敏性使得PCR技术技术能探测到疾病发展的初期阶段，甚至于临床症状出现能探测到疾病发展的初期阶段，甚至于临床症状出现前或亚临床状态或机体正在向病态发展的早期过程之前或亚临床状态或机体正在向病态发
8、展的早期过程之中，如对于感染性疾病，以往的方法要么间接的检查中，如对于感染性疾病，以往的方法要么间接的检查机体免疫系统对侵入微生物的反应产物降解产物（如机体免疫系统对侵入微生物的反应产物降解产物（如抗原）或干脆检查侵入微生物（如培育，镜检），但抗原）或干脆检查侵入微生物（如培育，镜检），但上述方法的灵敏度都受到方法学上的限制而达不到检上述方法的灵敏度都受到方法学上的限制而达不到检查极微量级（如查极微量级（如Pg水平），因而难以在早期对疾病的水平），因而难以在早期对疾病的发生做出精确，客观的诊断，但发生做出精确，客观的诊断，但PCR巨大的放大效率巨大的放大效率却解决了这一问题。却解决了这一问题。
9、10荧光基因探针杂交定量荧光基因探针杂交定量PCR技术与临床技术与临床另外如对像肿瘤等另外如对像肿瘤等“渐变性渐变性”疾病是因多基因积疾病是因多基因积累性突变才能造成正常细胞转变成癌细胞的，那累性突变才能造成正常细胞转变成癌细胞的，那么刚好检测到突变由量变转化为质变前期阶段则么刚好检测到突变由量变转化为质变前期阶段则显得极为重要，只有基因诊断才能完成这一目标。显得极为重要，只有基因诊断才能完成这一目标。11荧光定量荧光定量PCRPCR检测的对象是致病的病因，所以对于检测的对象是致病的病因，所以对于鉴别疾病的致病因子特别好用和精确，这对于区鉴别疾病的致病因子特别好用和精确，这对于区分相近临床症状
10、的不同致病子，以期对因治疗极分相近临床症状的不同致病子，以期对因治疗极为有用。为有用。荧光定量荧光定量PCRPCR可以对致病因子进行精确的定量，对可以对致病因子进行精确的定量，对治疗前后及治疗过程进行量化监控，则可以有效治疗前后及治疗过程进行量化监控，则可以有效的视察药物治疗效果。的视察药物治疗效果。假如用致病子的数量多少表示治疗效果，则可以假如用致病子的数量多少表示治疗效果，则可以进行临床治疗方案的评价及治愈标准的确立。进行临床治疗方案的评价及治愈标准的确立。12荧光定量荧光定量PCR检测的临床应用范围检测的临床应用范围用于疾病的早期诊断用于疾病的早期诊断用于疾病的鉴别诊断用于疾病的鉴别诊断
11、用于疾病的病因确定用于疾病的病因确定用于药物疗效的评价用于药物疗效的评价用于治疗效果的评价用于治疗效果的评价用于治愈标准的确定用于治愈标准的确定13荧光定量荧光定量荧光定量荧光定量PCRPCR技术应用于技术应用于技术应用于技术应用于感染性疾病的诊断感染性疾病的诊断感染性疾病的诊断感染性疾病的诊断14结核杆菌的临床诊断方法结核杆菌的临床诊断方法结核杆菌的临床诊断方法结核杆菌的临床诊断方法目前结核病确诊主要依靠痰片染色，抗酸杆菌和结核杆目前结核病确诊主要依靠痰片染色，抗酸杆菌和结核杆菌的培育法鉴定。但涂片阳性率不高，且不能确诊；培菌的培育法鉴定。但涂片阳性率不高，且不能确诊；培育法需较长时间。育法
12、需较长时间。ELISA和和RIA法敏感性低，尚不能干脆检测临床标本。法敏感性低，尚不能干脆检测临床标本。近年来国外出现了培育早期进行放射性检测的近年来国外出现了培育早期进行放射性检测的BacTec技技术，能显著缩短报告时间，但价格极贵，国内很难推广。术，能显著缩短报告时间，但价格极贵，国内很难推广。基因诊断技术的应用是一大突破，其中包括基因探针技基因诊断技术的应用是一大突破，其中包括基因探针技术，染色体指纹技术和荧光定量术，染色体指纹技术和荧光定量PCR技术。技术。15 .北京胸科医院;北京市结核病胸部肿瘤探讨所;上海肺科医院三家医院的考核状况。三家医院标本分布医院 结核组351例 比照组16
13、0例 例数 涂阳 培阳北京胸科143364260北京结研所151403150上海肺科57572950结核分枝杆菌结核分枝杆菌(TB)TB)FQ-PCRFQ-PCR检测与常规检测比较检测与常规检测比较16 FQ-PCR法与涂片法、培育法的检出率比较组别组别 涂片法涂片法 培育法培育法 FQ-PCR FQ-PCR法法 例数例数 阳性阳性 检出率检出率 阳性阳性 检出率检出率 阳性阳性 检检出率出率结核病组结核病组 351 133 37.9%102 29.1%220 62.7%351 133 37.9%102 29.1%220 62.7%比照组比照组 160 0 0%0 0%0 0%160 0 0%
14、0 0%0 0%17荧光定量荧光定量PCR技术技术检测结核杆菌应用评价检测结核杆菌应用评价1.特异性特异性 人型结核杆菌，牛型结核杆菌及卡介菌均人型结核杆菌，牛型结核杆菌及卡介菌均可扩增检测出，其它分支杆菌均否。可扩增检测出，其它分支杆菌均否。2.敏感性敏感性 可检测可检测1pg DNA，其相当于，其相当于30个结核杆个结核杆菌的染色体菌的染色体DNA量。量。3.临床应用临床应用 快速快速 可检测无法培育的结核杆菌可检测无法培育的结核杆菌18临床上，结核性脑膜炎是小儿多发病，病情凶临床上，结核性脑膜炎是小儿多发病，病情凶险，所以早期快速诊断具有重要意义，而荧光险，所以早期快速诊断具有重要意义，
15、而荧光定量定量PCR方法整个过程才方法整个过程才45小时，远较细胞小时，远较细胞培育法为快，而且精确。培育法为快，而且精确。检测标本无特殊限制：检测标本无特殊限制：痰、尿、腹水、胸水、关节液、血、肺泡灌痰、尿、腹水、胸水、关节液、血、肺泡灌洗液、脑脊液、分泌物等均可送检洗液、脑脊液、分泌物等均可送检19荧光定量荧光定量PCRPCR检测淋球菌检测淋球菌淋病的临床表现缺乏特异性，其确诊主要是进行淋病的临床表现缺乏特异性，其确诊主要是进行试验室检查。传统的方法有涂片染色法，分别培育试验室检查。传统的方法有涂片染色法，分别培育法和用来检测淋球菌抗原的法和用来检测淋球菌抗原的EIA-Gonozyme系统
16、系统法。近年来，荧光定量法。近年来，荧光定量PCR诊断技术的应用，使诊断技术的应用，使淋病的快速诊断有重大突破。淋病的快速诊断有重大突破。荧光定量荧光定量PCR方法适用于淋病的快速诊断和流方法适用于淋病的快速诊断和流行病学调查。行病学调查。20乙型、丙型肝炎病毒的乙型、丙型肝炎病毒的PCR检测检测 21HBV感染的诊断主要接受免疫测定法检测血清标本感染的诊断主要接受免疫测定法检测血清标本中的中的HBSAg，HbeAg，抗，抗-Hbs，抗，抗-HBc和抗和抗-Hbe（两对半），免疫学方法虽然比较简洁，但只（两对半），免疫学方法虽然比较简洁，但只能供应血清中的能供应血清中的HBV间接证据，无法证明
17、是否具有间接证据，无法证明是否具有传染性，而且敏感性较低。传染性，而且敏感性较低。而内源性而内源性DNA聚合酶法和斑点杂交分析法则可干脆聚合酶法和斑点杂交分析法则可干脆确定临床标本中确定临床标本中HBV DNA的存在。尽管比较敏感，的存在。尽管比较敏感，但只能检测到但只能检测到0.1pg的的HBV DNA。而荧光定量而荧光定量PCR方法则可检测到方法则可检测到200copy/ml的的HBV DNA，因而是极为有用的方法。，因而是极为有用的方法。22肝炎病毒的肝炎病毒的PCR检测的意义检测的意义PCRPCR方法可检出杂交法测定阴性而具有不同方法可检出杂交法测定阴性而具有不同HBVHBV血清学标记
18、的血清标本中的血清学标记的血清标本中的HBV DNAHBV DNA。PCRPCR方法可检出方法可检出HBs AgHBs Ag阳性而阳性而Hbe AgHbe Ag阴性携阴性携带者的带者的HBV DNAHBV DNA。PCRPCR方法可检出慢性方法可检出慢性HBVHBV感染感染 干扰素治疗后转阴的患者干扰素治疗后转阴的患者 血清中残存的血清中残存的HBV DNAHBV DNA。23丙型肝炎病毒的丙型肝炎病毒的丙型肝炎病毒的丙型肝炎病毒的 PCRPCR 检测检测检测检测 丙型肝炎多由输血或血液制备引起丙型肝炎多由输血或血液制备引起,临床临床预后较差预后较差,死亡率高死亡率高,所以早期诊断具有所以早期
19、诊断具有特别重要的意义特别重要的意义.目前最为敏感和特异的方法目前最为敏感和特异的方法,属荧光基因属荧光基因杂交定量杂交定量PCR方法。方法。24应用评价应用评价PCR法是检测病毒血症(HCV RNA)的最敏感方法。PCR方法克服了抗体测定法之不足,通过扩增核酸达到检测病毒的目的.PCR法可用来区分活动性HCV和急性期的消退性感染,后者与病毒RNA的消逝有关。血清转化期,PCR法也可检出HCV RNA存在。对非甲非乙肝炎患者,PCR方法对肝活检组织HCV RNA有很高的检出率。25肝炎病毒的肝炎病毒的PCR检测的意义检测的意义HBV及及HCV的的PCR检测确诊对手术相关科室待手术检测确诊对手术
20、相关科室待手术病人特别重要。病人特别重要。明确术前病人是否具有传染性，对术中医明确术前病人是否具有传染性，对术中医务人员的自身爱护、术后病人敷料及分泌物的正确务人员的自身爱护、术后病人敷料及分泌物的正确处理以防止院内交叉感染，并避开因术前、术后诊处理以防止院内交叉感染，并避开因术前、术后诊断不明确引起的医疗纠纷都具有干脆的指导意义。断不明确引起的医疗纠纷都具有干脆的指导意义。因此，建议手术相关科室从以上诸方面考因此，建议手术相关科室从以上诸方面考虑，常规进行虑，常规进行HBV、HCV荧光基因杂交定量荧光基因杂交定量PCR检检测。也建议其他科室对相关病人进行检测。测。也建议其他科室对相关病人进行
21、检测。26人类巨细胞病毒人类巨细胞病毒人类巨细胞病毒人类巨细胞病毒(HCMV)HCMV)HCMV)HCMV)的的的的PCRPCR检测检测检测检测 巨细胞病毒巨细胞病毒(CMV)为疱疹病毒科成员，其基因组为疱疹病毒科成员，其基因组由一由一240kb的线性双股的线性双股DNA分子组成，人类巨细分子组成，人类巨细胞病毒对人的感染很普遍，有时感染是致死性的。胞病毒对人的感染很普遍，有时感染是致死性的。这种病毒也是引起人类先天性畸形的一个重要缘这种病毒也是引起人类先天性畸形的一个重要缘由，所以建立快速敏感的诊断方法甚为重要。由，所以建立快速敏感的诊断方法甚为重要。27一、人类巨细胞病毒一、人类巨细胞病毒
22、(HCMV)的诊的诊断方法断方法快速细胞培育技术快速细胞培育技术LISA法法分子杂交法分子杂交法PCR方法方法28快速细胞培育技术敏感性低。快速细胞培育技术敏感性低。ELISA法除敏感性不高外，还易受干扰因素的法除敏感性不高外，还易受干扰因素的影响。影响。探针杂交检测探针杂交检测DNA法，对标本的处理及制备较法，对标本的处理及制备较麻烦；而且只有当细胞中麻烦；而且只有当细胞中CMV的拷贝数很高时，的拷贝数很高时，该方法的敏感性才可提高。该方法的敏感性才可提高。随着对随着对CMV基因组序列的阐明，基因组序列的阐明，PCR技术在技术在CMV的检测方面已成为最精确的方法。的检测方面已成为最精确的方法
23、。29用用PCR检测衣原体检测衣原体DNA 衣原体属包括衣原体属包括3个种，分为：个种，分为：沙眼衣原体沙眼衣原体(引起眼部疾病和性传播疾病引起眼部疾病和性传播疾病)鹦鹉热衣原体鹦鹉热衣原体(引起呼吸道疾病引起呼吸道疾病)肺炎衣原体肺炎衣原体 (引起肺炎引起肺炎)30 沙眼衣原体沙眼衣原体 不仅可致眼部疾病，也是性传播疾病的主要病原体。不仅可致眼部疾病，也是性传播疾病的主要病原体。鹦鹉热衣原体鹦鹉热衣原体和和肺炎衣原体肺炎衣原体 在人类则主要引起呼吸道疾病。在人类则主要引起呼吸道疾病。然而衣原体感染然而衣原体感染常缺乏特异症状常缺乏特异症状，使临床诊断和监，使临床诊断和监控甚为困难。选择衣原体
24、保守的控甚为困难。选择衣原体保守的16SrRNA基因为基因为模板，模板，应用应用PCR技术则可以敏感，特异和简便地进行诊断。技术则可以敏感，特异和简便地进行诊断。31应用前景应用前景PCR技术适于：技术适于：沙眼衣原体生殖泌尿道感染的早期诊断，沙眼衣原体生殖泌尿道感染的早期诊断，尤其适于对无症状携带者或轻症患者尤其适于对无症状携带者或轻症患者的诊断。的诊断。依据采集标本的部位不同，检测其它衣原依据采集标本的部位不同，检测其它衣原体的感染。体的感染。作衣原体感染的分子流行病学调查作衣原体感染的分子流行病学调查.为性传为性传播疾病的监控供应依据。播疾病的监控供应依据。32第三军医高校基因诊断中心第
25、三军医高校基因诊断中心附属于西南医院综合试验探讨中心，位于西南医院科附属于西南医院综合试验探讨中心，位于西南医院科教楼教楼4 4楼楼是重庆市首家引进美国是重庆市首家引进美国BIO-RAD BIO-RAD 公司的公司的“iCycler”“iCycler”荧光定量荧光定量PCRPCR检测仪和检测仪和PEPE公司公司377377型全自动型全自动DNADNA测序仪测序仪的试验室。的试验室。能精确、刚好地为临床在能精确、刚好地为临床在 基因水平供应肝炎、性病基因水平供应肝炎、性病 、结核、结核、HIV HIV 等病原体感等病原体感 染染 的定量分析及疗效评估。的定量分析及疗效评估。33第三军医高校基因诊
26、断中心第三军医高校基因诊断中心现所开展的检测项目现所开展的检测项目乙肝病毒乙肝病毒（HBV）荧光定量荧光定量PCR检测检测 丙肝病毒丙肝病毒（HCV）荧光定量荧光定量PCR检测检测淋球菌淋球菌（NG）荧光定量荧光定量PCR检测检测沙眼衣原体（沙眼衣原体（CT）荧光定量荧光定量PCR检测检测解脲支原体（解脲支原体（UU）荧光定量荧光定量PCR检测检测结核分支杆菌（结核分支杆菌（TB）荧光定量荧光定量PCR检测检测34单纯疱疹病毒（单纯疱疹病毒（HSV）荧光定量荧光定量PCR检测检测人类巨细胞病毒人类巨细胞病毒（CMV）荧光定量荧光定量PCR检测检测人乳头瘤病毒人乳头瘤病毒6 型（型（HPV 6型型）荧光定量荧光定量PCR检测检测人乳头瘤病毒人乳头瘤病毒11型（型（HPV 11型）型）荧光定量荧光定量PCR检测检测人乳头瘤病毒人乳头瘤病毒16型（型（HPV 16型）型）荧光定量荧光定量PCR检测检测人乳头瘤病毒人乳头瘤病毒18型（型（HPV 18型）型）荧光定量荧光定量PCR检测检测梅毒螺旋体（梅毒螺旋体（TP）荧光定量荧光定量PCR检测检测肺炎支原体（肺炎支原体（MP）荧光定量荧光定量PCR检测检测EB病毒（病毒（EBV）荧光定量荧光定量PCR检测检测35谢谢谢谢 谢谢谢谢!01-3-3036