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1、实时荧光定量实时荧光定量PCR技术的原理及应用技术的原理及应用(Real time Quantitative PCR)讲讲 座座 提提 纲纲q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的几种方法介绍的几种方法介绍q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR医学和科研中的应用医学和科研中的应用q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的几种方法介绍的几种方法介绍q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR医学和科研中的应用医学和科研中的应用实时荧光定量实时荧光定量PCR定义定义 在在PCRPCR反应体系中加入荧光基
2、团，利用荧光反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个信号累积实时监测整个PCRPCR进程，最终通过标进程，最终通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法准曲线对未知模板进行定量分析的方法 实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 实时原理实时原理 常常 规规 PCR PCR技术：技术：对对PCRPCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析扩增反应的终点产物进行定量和定性分析 无法对起始模板精确定量，无法对扩增反应实时检测无法对起始模板精确定量，无法对扩增反应实时检测实时定量实时定量PCRPCR技术：技术：利用荧光信号的变更实时检测利用荧光信号的变更实时检测PCRPCR扩增反应中
3、每扩增反应中每一个循环扩增产物量的变更，通过一个循环扩增产物量的变更，通过CtCt值和标准曲线值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析的分析对起始模板进行定量分析实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理 定量原理定量原理介绍三个概念：介绍三个概念：扩增曲线、荧光阈值、扩增曲线、荧光阈值、CtCt值值如何对起始模板定量？如何对起始模板定量？通过通过Ct值和标准曲线对值和标准曲线对起始模板起始模板进行定量分析进行定量分析实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理-扩增曲线扩增曲线扩增曲线图：扩增曲线图：横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度 每个循环进行一次荧光信号的收集荧光
4、基团荧光基团荧光检测元件荧光检测元件实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 -荧光荧光阈阈值值荧光信号阈值荧光信号阈值 （threshold threshold）：）：前前1515个循环信号作为荧光本底信个循环信号作为荧光本底信号（号（baselinebaseline），即样本的荧光背），即样本的荧光背景值和阴性比照的荧光值景值和阴性比照的荧光值 荧光域值的缺省设置是荧光域值的缺省设置是3 31515个循个循环的荧光信号的标准偏差的环的荧光信号的标准偏差的1010倍倍 手动手动 设置：原则要大于样本的荧设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性比照的荧光最高值，光背景值和阴性比照的荧光最
5、高值，同时要尽量选择进入指数期的最初同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保证回来系数大于阶段，并且保证回来系数大于0.990.99 真正的信号真正的信号:荧光信号超过域值荧光信号超过域值实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 -Ct值CtCt值的定义值的定义：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数C(t)value 实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 -Ct值的重现性横轴：横轴：PCR反映循环数反映循环数纵纵轴轴：荧荧光光信信号号量量CtCt值的特点值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；Ct值则极具重现性实时荧光定量
6、实时荧光定量PCR PCR 原理原理 -定量原理定量原理志向的PCR反应：X=X0*2n非志向的PCR反应：X=X0(1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 -定量原理定量原理在扩增产物达到阈值线时:XCt=X0(1+Ex)Ct=M (1)XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量.在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M方程式(1)两边同时取对数得:log M=log X0(1+Ex)Ct (2)整理方程式(2)得:log X0=-log(1+Ex)*Ct+log M (3)Log
7、浓度与循环数呈线性关系，依据样品扩增达到域值的循环数即Ct值就可计算出样品中所含的模板量实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 -标准曲线标准曲线q 模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小q Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，依据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量qq确定未知样品的确定未知样品的 C(t)C(t)值值 qq通过标准曲线由未知样品的通过标准曲线由未知样品的C(t)C(t)值推算出其初始量值推算出其初始量Sample实时荧光定量PCR原理 确定定量25讲讲 座座 提提 纲纲q 实时荧光定量实时荧光定量PCRP
8、CR原理原理q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的几种方法介绍的几种方法介绍q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR试验设计及应用试验设计及应用q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的几种方法介绍的几种方法介绍q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR试验设计及应用试验设计及应用非特异性荧光标记：非特异性荧光标记：1、SYBR Green 特异性荧光标记：特异性荧光标记：2、TaqMan 3、Molecular Beacon 4、Amplisensor实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 -DNA -DNA 产物的荧光标记产物的荧
9、光标记QQR实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 方法方法 1-1-SYBR Green 法SYBR Green SYBR Green 法 工作机理q SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位q SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光q 变性时，DNA双链分开，无荧光q 复性和延长时，形成双链DNA，SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号。SYBR Green 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理 SYBR Green I SYBR Green I 工作原理工作原理5353SGNo EmissionSGSGSGExcitationExcitatio
10、nSGSGSGSGSGSGSG5353EmissionExcitationExcitation实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理 SYBR Green I SYBR Green I 熔解曲线分析熔解曲线分析温度温度荧光强度荧光强度TmTmTm值：值：DNADNA解链一半时的温度解链一半时的温度实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理 SYBR Green I SYBR Green I 熔解曲线分析熔解曲线分析将温度与荧光强度的变更求导。将温度与荧光强度的变更求导。(-dI/dT)(-dI/dT)-dIdTTmSYBR Green SYBR Green 法法 融解曲线分析融解曲线分
11、析融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光定量准确融解曲线分析，出现杂峰其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准确非特异性产物非特异性产物Cycle numberFlourescenc Ck 102Ck 104SampleCycle numberLog of DNA concentrationSYBR Green 法 定量原理q 模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少q Log浓度与循环数呈线性关系，依据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量SYBR Green 法 -PCR反应的建立反应体系的建立及优化:SYBR Green 运用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测Pri
12、mer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以削减非特异性产物反应Buffer 体系的优化反应温度和时间参数:由酶和引物确定其他与常规PCR相同天为时代公司利用SYBR Green 法定量检测样品DNASYBR Green SYBR Green 法法 应用范围应用范围q 起始模板的测定q 基因型的分析q 融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。SYBR Green SYBR Green 法法 优缺点优缺点 q 对DNA模板没有选择性 -适用于任何DNAq
13、 使用方便 -不必设计复杂探针q 非常灵敏q 便宜优 点q 容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性 但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件q 对引物特异性要求较高缺 点与目标序列互补实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 方法方法2-TaqMan2-TaqMan法法TaqMan-水解型杂交探针v 5端标记有报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等 v 3端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)v 探针完整，R所放射的荧光能量被Q基团吸取，无荧光，R与Q分开，发荧光v Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探针TaqManTaqMan法法 工作原理工作原理每扩增一条DNA分子，
14、释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光TaqMan TaqMan 法法 PCR PCR反应的建立反应的建立1、引物、探针的设计：探针Tm为68-70，30 bp,5不能有G，G可能会淬灭荧光素，引物尽量靠近探针，扩增片段400 bp，引物Tm为59-60 2、反应参数的确定：一般为：94，10-20S 60，30-60S（Taq酶53外切核酸酶活性在60 最高）也可通过温度梯度优化退火温度 72，45 S，3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值 引物浓度：50-900nM 探针浓度：50-250nM4、其他与常规PCR相同已肝病人血液中HBV的确定定量目的：利用核
15、酸检测，缩短检验时间，提高灵敏度，为诊断用药供应依据方法：从血液中提取病毒DNA，扩增病毒基因，以TaqMan探针进行检测设置比照：浓度为106、105、104 103 的标准样品各一个，设阴性和空白比照试验步骤：提取HBV DNA 设计特异引物 设计TaqMan探针并标记探针 扩增程序结果：获得血液样品中HBV DNA的精确copy数利用利用TaqManTaqMan法法 检测血液中的检测血液中的HBVHBV数据分析分析结果：HBV DNA的精确copy数为3.7X105利用利用TaqManTaqMan法法 检测血液中的检测血液中的HBVHBVTaqManTaqMan法法 应用范围应用范围q
16、起始模板的定量q 基因型分析q 目的基因定量q 产物鉴定q SNP分析TaqManTaqMan法法 优缺点优缺点q 对目标序列的高特异性 -阴性结果确定q 设计相对简单 -与目标序列某一区域互补q重复性比较好优 点q 只适合一个特定的目标q 委托公司标记，价格较高q 不易找到本底低的探针缺 点实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 方法方法 3-Molecular beacon 3-Molecular beacon 法法(分子信标分子信标)标记荧光的发夹探针 环与目标序列互补茎由互补配对序列组成环茎荧光素 淬灭剂发夹型杂交探针发夹型杂交探针Molecular beacon(Molecular
17、beacon(分子信标分子信标)工作原理工作原理q 荧光共振能量转移（FRET）q 探针与DNA杂交时产生荧光q -变性过程：产生非特异性荧光q -延长过程：不产生荧光q -退火过程：产生特异性荧光，检测荧光信号Molecular beacon(Molecular beacon(分子信标分子信标)应用范围应用范围 q 起始模板的定量q 基因型分析q 产物鉴定q SNP（单核苷酸多态性）分析Molecular beacon(Molecular beacon(分子信标分子信标)优缺点优缺点q高高特异性：特异性：对目标序列 检测SNP最灵敏的试剂之一q荧光背景低荧光背景低优 点q 只能用于一个特定目
18、标q 设计困难q 价格比较高缺 点讲讲 座座 提提 纲纲q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的几种方法介绍的几种方法介绍q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR试验设计及应用试验设计及应用q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的几种方法介绍的几种方法介绍q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR试验设计及应用试验设计及应用实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR法法 标准样品标准样品相对定量中的内标相对定量中的内标 内标通常是内标通常是-actin、GAPDH基因等看家基因基因等看家基因 在细胞中的
19、表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量确定定量的标准样品：确定定量的标准样品：已知拷贝数的质粒已知拷贝数的质粒DNADNA和体外转入的和体外转入的RNA RNA 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR法法 标准样品标准样品DNADNADNADNA拷贝数拷贝数拷贝数拷贝数 用于生成标准曲线的样品如何设定？用于生成标准曲线的样品如何设定？含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒含有和待测样品相同扩增片段的含有和待测
20、样品相同扩增片段的cDNAcDNA紫外分光光度计或荧光酶标测定浓度紫外分光光度计或荧光酶标测定浓度依据质粒或依据质粒或cDNAcDNA分子量换算成拷贝数，做系列稀分子量换算成拷贝数，做系列稀释释实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR法法 定量方法定量方法q 确定定量检测起始模板数的精确拷贝数，通常用到标准曲线确定定量检测起始模板数的精确拷贝数，通常用到标准曲线q 相相对对定定量量确确定定经经过过不不同同处处理理的的样样本本目目标标转转录录本本之之间间基基因因的的表表达达差异（不同时相）差异（不同时相）q 2-C 2-C（t t）q 双标准曲线法双标准曲线法实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR法法
21、 TaqMan TaqMan法举例法举例TaqMan法探讨法探讨ERBB2 在乳腺肿瘤在乳腺肿瘤 组织标本中的表达差异组织标本中的表达差异 TaqMan TaqMan法举例法举例 标记探针标记探针运用 TaqMan 探针进行双通道荧光定量q FamFam标记目标基因探针标记目标基因探针q VIC VIC标记看家基因探针标记看家基因探针TaqManTaqMan法举例法举例 材料准备材料准备q从正常乳腺组织中提取的总从正常乳腺组织中提取的总 RNA RNA q从乳腺癌组织中提取的从乳腺癌组织中提取的 总总RNARNAq含含 ERBB2 and GAPDH ERBB2 and GAPDH 的质粒用于
22、生成标准曲线的质粒用于生成标准曲线q单双通道同时进行，独立分析单双通道同时进行，独立分析q Controls Controlsqno RNAno RNA：阴性比照：阴性比照qRNA+no reverse transcriptaseRNA+no reverse transcriptase：基因组比照：基因组比照TaqManTaqMan法举例法举例 反应程序反应程序 RT-qPCR 反应程序：反应程序：50C,30min95C,15min94C,15sec60C,1minplate read10C,foreverEnd35 more timesTaqManTaqMan法举例法举例 癌症标记物表达癌
23、症标记物表达Color 2-VIC detection for GAPDHColor 1 FAM detection for ERBB2TaqManTaqMan法举例法举例 试验结果试验结果 单双通道相互验证单双通道相互验证A.Multiplex ReactionsHealthy RNACarcinoma28.4826.4228.6826.9828.7826.9828.65 0.1526.80 0.32B.Singleplex reactionsHealthy RNACarcinoma28.6727.0928.7126.6828.7326.7028.70 0.0326.82 0.24TaqMa
24、nTaqMan法举例法举例 试验结果试验结果 定量定量Copies ng/l Total RNAHealthyRNATumorRNATumor/HealthyERBB21095 1052213024922.16 XGAPDH95500857301360001308001.45 XTaqManTaqMan法举例法举例 试验结果试验结果 定量分析定量分析ERBB2 copies/GAPDH copies1095/95500=0.0111052/85730=0.0122130/136000=0.0172492/130800=0.019Healthy RNATumor RNA0.01150.0180.
25、018/0.011GraphCopies ng/l Total RNATaqManTaqMan法举例法举例 试验结果试验结果 表达差异表达差异HealthyTissueCarc.TissueRelative ExpressionERBB2的表达差异TaqManTaqMan法举例法举例 试验结果试验结果 探讨探讨通过通过RT-qPCR成功检测了成功检测了ERBB2基因在基因在不同组织的不同组织的 表达差异；在乳腺癌组织中，表达差异；在乳腺癌组织中，ERBB2的表达量是正常水平的的表达量是正常水平的1.8倍倍实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR法法 SYBR Green I SYBR Green
26、I法举例法举例利用利用SYBR Green 1进行进行GMO定量定量(SGI)for GMO soy detection(SGI)for GMO soy detection SYBR Green I SYBR Green I法法 GMO GMO概念概念 转基因生物又称遗传修饰生物（Genetically Modified Organisms，GMO），是经基因工程技术变更基因组构成的生物，包括转基因植物、转基因微生物和转基因动物。SYBR Green I SYBR Green I法法 GMO GMO概念概念1983198319831983年：首例转基因植物转基年：首例转基因植物转基年：首例转基
27、因植物转基年：首例转基因植物转基因烟草因烟草因烟草因烟草1986198619861986年：转基因植物首次进入田年：转基因植物首次进入田年：转基因植物首次进入田年：转基因植物首次进入田间试验间试验间试验间试验1994199419941994年：首例转基因植物产品年：首例转基因植物产品年：首例转基因植物产品年：首例转基因植物产品Flavr Savr Flavr Savr Flavr Savr Flavr Savr 延熟保鲜转基因番延熟保鲜转基因番延熟保鲜转基因番延熟保鲜转基因番茄进入市场茄进入市场茄进入市场茄进入市场1996199619961996年至今：转基因作物迅猛年至今：转基因作物迅猛年至
28、今：转基因作物迅猛年至今：转基因作物迅猛发展期发展期发展期发展期 SYBR Green I SYBR Green I法法 检测方法检测方法q 转基因生物包括了特异的核酸序列，调控序列、目标基因、报告基因q 通过内源基因来对每个样品DNA进行定量（Normalization)q 利用插入基因的定量来进行GMO含量检测SYBR Green ISYBR Green I法法 材料准备材料准备q Roundup Ready 大豆（RTC公司，IRMM-41050-56）q 一般非转基因大豆q 从超级市场买来的下列食物用来作为测试样品：大豆饼,豆制甜点 和两个牌子的大豆粉SYBR Green ISYBR
29、Green I法法 样品制备样品制备标准品的制备:转基因成分含量分别为 0%,0.1%,0.5%,1%,2%和 5%转基因大豆试验样本 从含大豆成分的样本中提取DNADNA from Standard/SamplePCR mixGMO primersTUBE 1TUBE 2PCR mixLectin primersSYBR Green ISYBR Green I法法 引物设计引物设计Lectin 扩增片段长度为318bp 其引物为：正向：5-GAC-GCT-ATT-GTG-ACC-TCC-TC-3，反向：5-GAA-AGT-GTC-AAG-CTT-AAC-AGC-GAC-G-3EPSPSEPS
30、PS扩增片段长度为356bp其引物为：正向：5-TGG-CGC-CCA-AAG-CTT-GCA-TGG-C-3反向：5-CCC-CAA-GTT-CCT-AAA-TCT-TCA-AGT-3 SYBR Green ISYBR Green I法法 CC（t t）定量）定量 log A/B =logA-logB A:EPSPS GMO B:Lectin all bean A/B:%GMO%GMOC（t）SYBR Green ISYBR Green I法测法测GMO GMO 数据收集与分析数据收集与分析q 标准曲线标准曲线log%GMOlog%GMO对应对应C C（t t）获得获得q 熔解曲线分析，检测
31、扩增产物熔解曲线分析，检测扩增产物数据处理：数据处理：数据处理：数据处理：C C C C（t t t t）EPSPSEPSPSEPSPSEPSPS-C C C C（t t t t）lectinlectinlectinlectin=C C C C（t t t t）处理条件：处理条件：处理条件：处理条件：假定两对引物有相同的扩增效率并且相互独立扩增。假定两对引物有相同的扩增效率并且相互独立扩增。假定两对引物有相同的扩增效率并且相互独立扩增。假定两对引物有相同的扩增效率并且相互独立扩增。SYBR Green ISYBR Green I法测法测GMO GMO 熔解曲线分析熔解曲线分析Tm=92oC熔解
32、曲线熔解曲线 Lectin 扩增扩增 Tm=88.5oC熔解曲线熔解曲线 epsps 扩增扩增SYBR Green ISYBR Green I法测法测GMO GMO 试验结果试验结果1:1:标准曲标准曲线线不同转基因成分含量与不同转基因成分含量与Ct epsps做做标准曲线标准曲线Cp4-epspsSYBR Green ISYBR Green I法测法测GMO GMO 试验结果试验结果2:2:样品的扩增曲样品的扩增曲线线LectinepspsFood Sample#2Food Sample#1SYBR Green ISYBR Green I法测法测GMO GMO 试验结果：试验结果：定量分析定
33、量分析Standards/SampleC(t)epspsC(t)Lectin0ND22.60.1ND22.60.528.222.51.027.222.52.026.222.85.024.622.7Soy Dessert24.622.4Soy FlourND22.2Soy Burger24.223.4SYBR Green ISYBR Green I法测法测GMO GMO 试验结果试验结果 定量分析定量分析1.Calculate C(t)=C(t)epsps C(t)lectinStandards/SampleC(t)epspsC(t)LectinC(t)0ND22.6ND0.1ND22.6ND0
34、.528.222.55.61.027.222.54.72.026.222.83.45.024.622.71.9Soy Dessert24.622.42.1Soy FlourND22.2NDSoy Burger24.223.40.7SYBR Green ISYBR Green I法测法测GMO GMO 试验结果试验结果 标准曲线生成标准曲线生成y=-0.264x+1.202R2=0.998-0.40-0.200.000.200.400.600.800123456 C(t)Log percent GMO2.2.依据依据 C(t)C(t)值与标准品百分含量做标准曲线值与标准品百分含量做标准曲线SYB
35、R Green ISYBR Green I法测法测GMOGMO试验结果试验结果 GMO GMO定量定量 Standards/SampleC(t)%GMO0ND0.1ND0.55.61.04.72.03.45.01.9Soy Dessert2.14.40Soy FlourND 53.3.依据依据 C(t)C(t)值标准曲线推算未知样本的转基因成分值标准曲线推算未知样本的转基因成分含量含量SYBR Green ISYBR Green I法测法测GMO GMO 试验结果试验结果 探讨探讨用于转基因成分定量生成标准曲线的样品如何设定？用于转基因成分定量生成标准曲线的样品如何设定？v阳性材料与阴性材料按
36、比例混合成为不同转基因百分含量的标准品阳性材料与阴性材料按比例混合成为不同转基因百分含量的标准品v分别提取分别提取DNADNAv紫外分光光度计或荧光酶标测定浓度，稀释至同一浓度紫外分光光度计或荧光酶标测定浓度，稀释至同一浓度SYBR Green ISYBR Green I法测法测GMO GMO 探讨探讨 PCR PCR扩增效率扩增效率 看两个反应是否具有相同的扩增效率的看两个反应是否具有相同的扩增效率的方法是：方法是：cDNA cDNA样品在样品在100100倍浓度梯度稀释后扩倍浓度梯度稀释后扩增产物增产物CTCT如何变更如何变更 斜率确定值接近于斜率确定值接近于0 0为保证上述假定成立，即ExA=ExB扩增子长度引物设计模板纯度、困难度等反应条件www.tw-谢 谢！