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1、1 .目的掌握凯氏定氮法测蛋白质的原理、操作、条件、注意事项。2 .原理蛋白质是含氮有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化,使蛋白质 分解。分解的氨与硫酸结合生成硫酸核。然后碱化蒸馄使氨游离,用硼酸吸取后 在以硫酸或盐酸标准溶液滴定,根据酸的消耗量计算含氮量再乘以换算系数,即 为蛋白质含量。3 .试齐IJ3.1 浓硫酸、硫酸铜、硫酸钾,所有试剂均用不含氮的蒸储水配制3.2 混合指示液1份(lg/L)甲基红乙醇溶液与5份lg/L澳甲酚氯乙醇溶液临用时混合。 也可用2份甲基红乙醇溶液与1份lg/L次甲基蓝乙醇溶液临用时混合。3.3 氢氧化钠溶液(400g/L)3.4 标准滴定溶液硫酸标准溶液c
2、(l/2H2so4)=0. 0 50 0 mo 1 /L或盐酸标准溶液c (HC1 ) 0. 0 5 0 Omol/L3.5 硼酸溶液(2 0g/L).仪器定氮蒸馀装置.样品全蛋(2. 47g).操作3.6 样品解决准确称取2-5g半固体样品,小心移入干燥洁净的5(X)mL凯氏烧瓶 也然后加入研细的硫酸铜0.5g,硫酸钾10g和浓硫酸2 0 mL,轻轻摇匀后于 瓶口放一小漏斗,将瓶以4 5。角斜放于加有石棉网的电炉上,小火加热,待内 容物所有炭化后,泡沫完全消失后,加强火力,并保持瓶内液体微沸,至液体呈 蓝绿色呈请透明后,再继续加热0.5h,取下放冷,慢慢加入20mL水。放冷后, 移入1 00
3、mL容量瓶中,并用少量水洗定氮瓶,洗液并入容量瓶中,再加水至刻 度,混匀备用。取与解决样品相同的硫酸铜、硫酸钾、硫酸按同一方法做试 剂空白实验。3.7 连接装置装好定氮装置,于水蒸气发生器内装水至2/3处,加甲基红指示剂数滴及 少量硫酸,以保持水呈酸性,加入数滴玻璃珠以防暴沸,用调压器控制,加 热至水沸腾。3.8 蒸储、吸取及滴定向接受瓶(锥形瓶)内加入1 OmL20g/ L硼酸溶液及混合指示剂12 滴,并使冷凝管的下端插入液面下。用移液管移取10.00mL样品消化稀释 液有小漏斗室流入反映室,在将10mL 4 0 0 g /L氢氧化钠溶液倒入碱液管中, 提起玻璃塞使其缓缓流入反映室,并加水于
4、小漏斗中以防止漏气。开始蒸储。 蒸气通入反映室使氨通过冷凝管而进入接受瓶内,蒸储5min,移动接受瓶, 是冷凝管下端离开液面,再蒸储Im in,然后用少量的水冲洗冷凝管下端外 部。取下接受瓶,以0. ()5 mol/L盐酸标准溶液滴定至由蓝色变为微红为 终点,记录盐酸溶液用量。同时吸取1 0 .00mL空白消化液按以上操作为空白实验,记录空白实验 消耗盐酸标准溶液的体积。4 .数据记录4.1 原始数据4.2 可疑值弃留实验获得的数据均合理,无可疑值。4.3 整理数据精滴/mL粗滴/mL 平行实验1 平行实验2 平行实验3 空白实验5.305.505.6 05.9 00.4 58 .计算(V 标
5、一V。)xCaxO. 0 14X =x l()()xKm样/ V定xV测式中:X样品中蛋白质含量,;V标一主实验(测定用液)消耗硫酸或盐酸标准溶液的体积,mL;Vl空白实验消耗硫酸或盐酸标准溶液的体积,mL;C a硫酸或盐酸标准溶液的物质的量浓度,mol/L;0 . 014氮的物质的量质量xl()g/mol;m样一样品的质量(体积),g (mL );V定一消化液定容体积,mL;V测一消化液参与测定(测定用液)的体积,mL;K氮换算为蛋白质的系数,蛋白质中的氮含量一般为1577.6%,按I6 %计算乘以6. 2 5即为蛋白质,乳制品为6038,面粉为5.70,玉 米、高粱为6.24,花生为5.4
6、6,米为5.95,大豆及其制品为5. 71,肉 或肉制品为6025,大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83,芝麻、向日葵为5.30 O9 .结果V标=(v 1 +V2+V 3)/3 =(5.3 0 +5.5 0 + 5 .60) / 3 = 5.47(V 标-Vo)xCaxO. 0 14(5.47mL-0.45 mL)x0.0500mol/Lx 0 .0 1 4X =x 10 OxK =m 样/V 定xV 测2.47g/1 OOmLx 10mLxl0 0 x 6.25= 8 . 8 9 %.结果可靠性分析9.1 精密度平均偏差二(0.1 7 + 0.0 3+0. 13)/3 =0.1 1相对平均偏差
7、二( 0.11/547)x1 0 0 %=(). ()2%9.2 误差分析9.2.1 根据实际操作情况分析误差的产生因素在做空白实验前也许由于定氮瓶未完全清洗干净,有之前的样液残留 或者之前样液产生的氨气未排空而导致空白实验消耗的标准溶液过多,使 实验结果偏低。9.2.2 误差的方向性本实验产生误差为负误差。10 .结论三次平行实验均吸取10mL消化液,产生的氨气经吸取后以0.0 5 mol/L 盐酸标准溶液滴定,消耗盐酸浓度依次为5.3 OmL、5.5 0mL、5.6 0mL(相对 平均偏差为0.0 2 %)0取三者平均值5.47mL计算得样品蛋白质含量为8.8 9 %。 由于空白实验前定氮
8、瓶未完全清洗干净,有之前的样液残留或之前样液产生的氨 气未排空导致空白实验消耗的标准溶液过多,结果偏低,产生误差为负误差。11 .思考题11.1 为什么叫粗蛋白?样品中常具有核酸、生物碱、含氮类脂、吓咻以及含氮色素等非蛋白 质的含氮化合物,非纯蛋白质,故称粗蛋白。11.2 试剂及用途?浓硫酸:消化、氧化剂硫酸铜:催化剂、指示消化终点硫酸钾:使消化温度升高到400混合指示剂:指示滴定终点氢氧化钠溶液:用于蒸储,使氨气溢出。硼酸溶液:吸取液,将氨气固定于吸取液中,形成硼酸筱。硫酸标准溶液或盐酸标准溶液:用于滴定,与硼酸镂反映11.3 各步终点?消化终点:溶液由黑色变为蓝绿色澄清透明。蒸馈终点:凯氏
9、瓶内溶液变为深蓝色或产生黑色沉淀,然后用表面皿接 儿滴饰出液,用奈氏试剂检查,如无红棕色物生成,表达蒸饰完毕。滴定终点:用盐酸标准溶液直接滴定至溶液由蓝色变为微红色即为终 点。11.4 注意事项?移液管不可交叉使用,防止酸碱试剂污染;蒸蟒装置不能漏气;消化时, 火力由弱到强,烧瓶倾斜呈4 5。;瓶口放一长颈漏斗;蒸镭与吸取,先进行吸 取操作,冷凝管末端必须插入吸取液中,然后再进行蒸储的操作;蒸馀结束时,将管离开液面,蒸僧Imin,再用少量蒸储水洗管外壁;滴定,先粗滴,后精滴。11.5 叙述整个实验中有关颜色的变化,为什么?消化终点:由黑色变为蓝绿色澄清透明。由于浓硫酸具有脱水性和氧化 性,使有机物炭化呈黑色,待有机物所有被消化完后,不再有硫酸亚铜生成, 溶液呈现清澈的蓝绿色。蒸谯终点:凯氏瓶内溶液变为深蓝色或产生黑色沉淀。加入氢氧化钠后, 与硫酸铜反映生成氢氧化铜沉淀,在高温下分解呈氧化铜,产生黑色沉淀。滴定终点:用盐酸标准溶液直接滴定至溶液由蓝色变为微红色即为终 点。硼酸钱是强碱弱酸盐,呈碱性,混合指示剂会显蓝色。用盐酸滴定后,溶 液呈酸性,因此指示剂显微红色。