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1、SDS 测定蛋白质相对分子质量一、 序言聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳, 简称 , 是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质一个常见电泳技术。聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成, 聚合过程由自由基催化完成。催化聚合常见方法有两种:化学聚正值和光聚正值。化学聚合以过硫酸铵(APS)为催化剂, 以四甲基乙二胺(TEMED)为加速剂。在聚合过程中, TEMED 催化过硫酸铵产生自由基, 后者引发丙烯酰胺单体聚合, 同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联, 从而形成三维网状构造。 依据其有没有浓缩效应, 分为连续系统和不连续系统两大类, 连续系统电泳体系中缓冲液 pH 值及凝胶浓
2、度一样, 带电颗粒在电场作用下, 关键靠电荷和分子筛效应。不连续系统中由于缓冲液离子成份, pH, 凝胶浓度及电位梯度不连续性, 带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应, 分子筛效应, 还含有浓缩效应, 所以其分别条带清楚度及区分率均较前者佳。不连续体系由电极缓冲液、 浓缩胶及分别胶所组成。浓缩胶是由 AP 催化聚合而成大孔胶, 凝胶缓冲液为pH6.7Tris-HCl。分别胶是由 AP 催化聚合而成小孔胶, 凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HCl。电极缓冲液是 pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2 种孔径凝胶、2 种缓冲体系、3 种pH 值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH 值、 缓冲液离子成份
3、不连续性, 这是样品浓缩关键缘由。SDS 是阴离子去污剂, 作为变性剂和助溶试剂, 它能断裂分子内和分子间氢键, 使分子去折叠, 破坏蛋白分子二、 三级构造。而强复原剂如巯基乙醇, 二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间二硫键断裂。在样品和凝胶中参与复原剂和SDS 后, 分子被解聚成多肽链, 解聚后氨基酸侧链和SDS 结合成蛋白- SDS胶束, 所带负电荷大大超出了蛋白原有电荷量, 这么就消退了不一样分子间电荷差异和构造差异。SDS- 通常实行是不连续缓冲系统, 与连续缓冲系统相比, 能够有较高区分率。浓缩胶作用是有积存作用, 凝胶浓度较小, 孔径较大, 把较稀样品加在浓缩胶上, 经过大孔径凝胶迁移作用
4、而被浓缩至一个狭窄区带。当样品液和浓缩胶选 TRIS/HCl 缓冲液, 电极液选 TRIS/甘氨酸。电泳开头后, HCl 解离成氯离子, 甘氨酸解离出少许甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷, 所以一起向正极移动, 其中氯离子最快, 甘氨酸根离子最慢, 蛋白居中。电泳开头时氯离子泳动率最大, 超出蛋白, 所以在后面形成低电导区, 而电场强度与低电导区成反比, 所以产生较高电场强度, 使蛋白和甘氨酸根离子快速移动, 形成一稳定界面, 使蛋白聚拢在移动界面四周, 浓缩成一中间层。此判定方法中, 蛋白质迁移率关键取决于它相对分子质量, 而与所带电荷和分子外形无关。聚丙烯酰胺凝胶电泳作用原理聚丙烯酰胺凝胶为网
5、状构造 , 含有分子筛效应。它有两种形式 : 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-)及 SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-);非变性聚丙烯酰胺凝胶, 在电泳过程中, 蛋白质能够保持完整状态, 并依据蛋白质分子量大小、 蛋白质外形及其所附带电荷量而逐步呈梯度分开。而 SDS- 仅依据蛋白质亚基分子量不一样就能够分开蛋白质。该技术最初由 shapiro 于 1967 年建立, 她们觉察在样品介质和丙烯酰胺凝胶中参与离子去污剂和强复原剂(SDS 即十二烷基硫酸钠) 后, 蛋白质亚基电泳迁移率关键取决于亚基分子量大小 (能够无视电荷缘由)。二、 试验目1. 学习 SDS- 测定蛋白质分子量原理。2.
6、 把握垂直板电泳操作方法。3. 利用 SDS- 测定蛋白质分子量及染色判定。三、 试验原理1.电泳带电颗粒在电场作用下, 向着与其电荷相反电极移动现象。在确定电场强度下, 分子在凝胶介质中迁移速率取决于分子大小、 构型和带电量大小。2.聚丙烯酰胺凝胶 PAG是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)在加速剂四甲基乙二胺 (TEMED)和引发剂过硫酸铵(AP) 作用下聚合交联而成三维网状构造凝胶。以此凝胶作为支持介质电泳称为 。 含有电泳和分子筛双重作用。PAG 机械强度好, 有弹性, 透亮, 化学性质稳定, 转变 Acr 浓度或 Acr 与 Bis 百分比能够得到不一样孔径凝胶
7、。 分为连续系统和不连续系统两大类。连续系统电泳体系中缓冲液pH 值与凝胶中一样.带电颗粒在电场作用下, 关键靠电荷和分子筛效应。不连续系统中带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应, 还含有浓缩效应, 所以其分别条带清楚度及区分率均较前者佳。3. SDS- 根底原理SDS- 是在蛋白质样品中参与 SDS 和含有巯基乙醇样品处理液, SDS 是一个很强阴离子外表活性剂, 它能够断开分子内和分子间氢键, 破坏蛋白质分子二级和三级构造。强复原剂巯基乙醇能够断开二硫键破坏蛋白质四级构造。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解聚后侧链与 SDS 充分结合形成带负电荷蛋白质-SDS 复合物。蛋白
8、质分子结合 SDS 阴离子后, 所带负电荷量远远超出了它原有净电荷, 从而消退了不一样种蛋白质之间所带净电荷差异。蛋白质电泳迁移率关键打算于亚基相对分子质量。而与其所带电荷性质无关。当蛋白质分子量在 17,000165,000 之间时,蛋白质-SDS 复合物电泳迁移率与蛋白质分子量对数呈线性关系:lgMW = K - bm将分子量标准蛋白质在 SDS- 中电泳迁移率对分子量对数作图, 即可得到一条标准曲线。只要测得未知分子量蛋白质在相同条件下电泳迁移率, 就能依据标准曲线求得其分子量。四、 试验器材和材料试剂仪器:垂直板型电泳槽;直流稳压电源;50 或 100l 微量注射器、玻璃板、 水浴锅,
9、 染色槽;烧杯;吸量管;常头滴管等。原料:低分子量标准蛋白质依据每种蛋白 0.5-1mgml-1 样品溶解液配制。可配制成单一蛋白质标准液, 也可配成混合蛋白质标准液。试剂:(1)分别胶缓冲液(Tris-HCl缓冲液 PH8.9):取 1mol/L 盐酸48mL, Tris 36.3g,用无离子水溶解后定容至 100mL;(2) 浓缩胶缓冲液(Tris-HCl 缓冲液 PH6.7):取 1mol/L 盐酸 48mL,Tris 5.98g,用无离子水溶解后定容至 100mL;(3) 30%分别胶贮液 :配制方法与连续体系一样 , 称丙烯酰胺(Acr) 30g 及 N, N-甲叉双丙烯酰胺(Bis
10、)0.8g, 溶于重蒸水中, 最终定容至 100ml, 过滤后置棕色 中, 4 保存;(4) 10%浓缩胶贮液:称 Acr 10g 及 Bis 0.5g, 溶于重蒸水中, 最终定容至 100mL, 过滤后置棕色中, 4 贮存;(5) 10%SDS 溶液:SDS 在低温易析出结晶, 用前微热, 使其完全溶解;(6)1%TEMED;(7) 10%过硫酸铵(AP):现用现配;(8) 电泳缓冲液(Tris-甘氨酸缓冲液 PH8.3):称取 Tris 6.0g, 甘氨酸 28.8g, SDS 1.0g, 用无离子水溶解后定容至 1L;(9) 样品溶解液:取 SDS 100mg, 巯基乙醇 0.1mL,
11、甘油1mL, 溴酚蓝 2mg, 0.2mol/L, pH7.2 磷酸缓冲液 0.5mL, 加重蒸水至 10mL(遇液体样品浓度增加一倍配制)。用来溶解标准蛋白质及待测固体;(10)染色液:0.25g 考马斯亮蓝 G-250, 参与 454mL 50% 甲醇溶液和 46mL 冰乙酸即可;(11)脱色液:75mL 冰乙酸, 875mL 重蒸水与 50mL 甲醇混匀。五、 试验操作1. 制胶玻板清洗用海绵和洗涤剂轻柔地清洗 , 严禁使用刷子和颗粒状去污粉与洗衣粉, 完全冲洗干净后烘干。2. 垂直板电泳槽3. 凝胶制备分别胶制备配制 12%分别胶。在烧杯中依次参与重蒸水 3.35ml,分别胶缓冲液1.
12、5mol/L Tris-HCl,pH8.82.5ml,10%SDS 0.1ml,凝胶贮备液4.0ml, 10% 过硫酸铵 50ul 和 TEMED 10ul。由于 AP 和 TEMED 相遇后凝胶即开头聚合, 所以应马上混匀混合液, 用移液枪抽取凝胶液加至长、 短玻璃板间窄缝内, 留出梳齿齿高加 1cm 空间停顿灌胶, 留神掩盖一层蒸馏水, 37烘箱下聚合约 30 min。待分别胶聚合完全后, 除去掩盖蒸馏水。浓缩胶制备配制 5%浓缩胶。在烧杯中依次参与重蒸水 2.92ml,浓缩胶缓冲液(0.5mol/L Tris-HCl,pH6.8) 1.25ml,10% SDS 0.05ml,凝胶贮备液0
13、.8ml, 10% 过硫酸铵 25ul 和 TEMED 10ul。由于 AP 和 TEMED 相遇后凝胶即开头聚合, 所以应马上混匀混合液, 用移液枪抽取凝胶液加至长、 短玻璃板间窄缝内, 灌满后留神插入梳齿, 避开混入气泡, 37烘箱下聚合约 30 min。4. 蛋白质样品处理标准蛋白质样品处理低分子量标准蛋白试剂盒:兔磷酸化酶BMW=97,400牛血清白蛋白 MW=66,200 牛碳酸酐酶 MW=31,000 胰蛋白酶抑制剂 MW=20,100鸡蛋清溶菌酶MW=14,400开封后, 沸水浴中加热 3-5min 后上样。样液预备用移液枪留神吸取处理好血清 50ul 至 1.5ml 离心管中,
14、 再参与50ul 上样缓冲液, 混匀后沸水浴中加热 3min, 取出冷却后加样。5. 加样用移液器分别取 5l 样品液, 留神将样品加到凝胶凹形样品槽底部。6. 电泳将电泳仪正负极与电泳槽正负极相连接, 翻开电泳仪开关, 设置电压为 200V, 电泳 60mins,此时溴酚蓝染料达成凝胶底部, 停顿电泳, 关闭电源。7. 染色与脱色电泳完毕后, 取下玻板, 在自来水下用特制板撬开短玻璃板, 从凝胶板上切下一角作为加样标识, 在两侧溴酚蓝染料区带中心, 插入细铜丝作为前沿标识。参与染色液染色 60 mins, 再用脱色液脱色, 直至蛋白质区带清楚, 即可计算相对迁移率。8. 结果处理量出加样端距
15、细铜丝间距离 (cm)以及各蛋白质样品区带中心与加样端距离(cm), 按下式计算相对迁移率 mR:蛋白质样品迁移距离𝐜𝐦𝐦=𝐑溴酚蓝区带距加样端距离𝐜𝐦六、 试验结果及数据处理1. 试验现象:脱色完毕后, 经观看可知, 点有maker 孔跑出来有5 个清楚笔直条带, 迁移率由低到高排列这 5 个条带分别是分别是兔磷酸化酶 B、牛血清白蛋白、 牛碳酸酐酶、 胰蛋白酶抑制剂、 鸡蛋清溶菌酶。点有血清蛋白点样孔跑出结果在分别胶与浓缩胶交界处消灭一 大团成份未知着色团 , 经教师讲解而且上网查阅资料得悉这种
16、现象可能是所谓“鬼带”现象。“鬼带”就是在跑大分子构象简洁蛋白质分子时, 常会消灭在泳道顶端(有时在浓缩胶中)局部大分子未知条带或加样孔底部有沉淀。消灭这种现象关键由于复原剂在加热过程中被氧化而失去活性, 致使原来被解离蛋白质分子重折叠结合和亚基重缔合, 聚合成大分子, 其分子量要比目标条带大, 有时不能进入分别胶。但它却于目标条带有一样免疫学活性, 在 WB 反响中可见其能与目标条带对应抗体作用。处理措施为: 在加热煮沸后, 再添加适量 DTT 或 Beta 巯基乙醇, 以补充缺乏复原剂;或可加适量 EDTA来阻挡复原剂氧化。除此之外还观看到存在“拖尾现象”。这关键是样品融解效果不佳或分别胶
17、浓度过大引发。处理措施: 加样前离心;选择适宜样品缓冲液, 加适量样品促溶剂;电泳缓冲液时间过长, 重配制;降低凝胶浓度。2. 试验数据处理:溴酚蓝区带距加样端距离: 5.45cm待测样品迁移距离: 5.18cm迁移距离cm2.182.783.124.035.09迁移率m0.400.510.570.740.93MW974006620031000014400lgMW4.994.824.494.304.16由公式: 可得:即:lgMW=K-bmlgMW=5.5516-1.5867m当 m=5.18/5.45=0.95 时, lgMW=5.27, 则:MW10965所以待测样品相对分子质量约为 10
18、965。七、 思考题1. 在上样缓冲液中 SDS、 巯基乙醇、 甘油及溴酚蓝作用分别是什么？答: SDS 使蛋白质变性,用于确定蛋白分子量聚丙烯酰胺凝胶电泳, 也能够用于核酸抽提操作中破坏细胞壁及裂解核酸-蛋白复合物, 在乳液聚合反响中, 可充当两相溶液乳化剂; 巯基乙醇用于翻开二硫键, 使蛋白质四级或三级构造被破坏; 甘油使样品处于下面, 不易飘起, 并有保护作用; 溴酚蓝用于显色。2. 在 SDS- 中,分别胶中 TEMED 和 AP 作用是什么?答: 过硫酸铵 AP为催化剂, 四甲基乙二胺 TEMED为加速剂。在聚合过程中, TEMED 催化过硫酸铵产生自由基, 后者引发丙烯酰胺单体聚合
19、, 同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联, 从而形成三维网状构造。3. 样品液为何在加样前需在沸水中加热几分钟?答: 样品液在沸水中加热以除掉混在其中局部小亚基, 以免影响跑胶效果。八、 试验留意事项1. 不是全部蛋白质都能用 SDS-凝胶电泳法测定其分子量, 已觉察有些蛋白质用这种方法测出分子量是不行靠。包含 :电荷特别或构象特别蛋白质, 带有较大辅基蛋白质(如 一些糖蛋白)以及局部构造蛋白如胶原蛋白等。比方组蛋白 F1, 它本身带有大量正电荷, 所以, 尽管结合了正常百分比 SDS, 仍不能完全掩盖其原有正电荷影响, 它分子量是 21,000, 但 SDS-凝胶电泳测定结果却是
20、35,000。所以, 最好最少用两种方法来测定未知样品分子量, 相互验证。2. 有很多蛋白质 , 是由亚基(如血红蛋白)或两条以上肽链(如-胰凝乳蛋白酶)组成, 它们在 SDS 和巯基乙醇作用下, 解离成亚基或单条肽链。所以, 对于这一类蛋 白质, SDS-凝胶电泳测定只是它们亚基或单条肽链分子量, 而不是完整分子分子量。为了得到更全方面资料, 还必需用其它方法测定其分子量及分子中肽链数目等, 与 SDS- 凝胶电泳结果相互参考。九、 试验结果误差分析及争论此次试验关键是让我们学习SDS-测定蛋白质分子量原理、把握垂直板电泳操作方法、 利用 SDS- 测定蛋白质分子量及染色判定。在教师悉心指导
21、下, 经过分组分工合作完成此次试验并观看分析完跑胶结果后, 我认为此次试验还是相对较为成功, 达成了试验根底目要求。但在观看跑胶结果是 , 觉察在此次试验中可能有局部操作性问题影响了试验结果, 经分析有以下几点:在凝胶聚合过程中, 我们实行了在 37烘箱下聚合约 30 min, 此种方法好处是聚合时间短, 聚合速度快, 但一样它存在缺点, 比方轻易消灭胶脆、 分散不均匀现象。由于温度凹凸打算了胶分散速度快慢, 温度越高分散速度越快, 但其脆性也相对增加。假设不考虑时间问题前提下, 能够考虑实行放置 4冰箱下过夜方法聚合, 此种方法虽耗时长, 但聚合出胶分散格外充分均匀, 能够排解胶本身分散不均匀不充分所带来影响。在跑胶过程中, 我们实行是200V, 60min电泳, 但假设样品在浓缩胶阶段将电压相对降低局部 , 在样品在分别胶阶段将电压相对上升局部, 这么跑出来条带清楚度会提升。点样过程中由于操作不娴熟或由于点样孔在拔梳子过程中遭到局部损坏, 而造成了局部样品局部未完全进入点样孔中, 跑出条带不甚清楚。总而言之, 可能由于阅历考虑缺乏等局部缘由, 并未完全觉察此次试验过程中消灭全部问题, 但我信任在接下来学习过程中, 我确定会愈加努力, 尽自己最大可能认真细心地完成每一次试验, 将误差和失误降到最低。