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1、精液冷冻技术概述四川高校华西其次医院人类精子库四川高校华西其次医院人类精子库1四川大学华西第二医院人类精子库精液冷冻历史回顾精液冷冻历史回顾 17761776年年年年SpallanzaniSpallanzani偶偶偶偶然然然然发发发发觉觉觉觉将将将将人人人人精精精精液液液液埋埋埋埋藏藏藏藏于于于于冰冰冰冰雪雪雪雪仍仍仍仍可可可可存活存活存活存活18861886年年年年MantegazzaMantegazza发发发发觉觉觉觉在在在在1515下下下下的的的的精精精精子子子子可可可可以以以以存存存存活活活活较较较较长时间；长时间；长时间；长时间；19371937年年年年JannelJannel报告人
2、类精子可在报告人类精子可在报告人类精子可在报告人类精子可在-196-196中存活；中存活；中存活；中存活；19491949年年年年PolgePolge首首首首先先先先发发发发觉觉觉觉甘甘甘甘油油油油对对对对冷冷冷冷冻冻冻冻精精精精子子子子具具具具有有有有特特特特殊殊殊殊爱爱爱爱护护护护作作作作用。用。用。用。2四川大学华西第二医院人类精子库冷冻精液的临床意义冷冻精液的临床意义供供供供者者者者人人人人工工工工授授授授精精精精（AIDAID）运运运运用用用用便便便便利利利利，并并并并且且且且可可可可以以以以协协协协作作作作女女女女性性性性生生生生殖殖殖殖周周周周期期期期进进进进行；行；行；行；对有
3、先天遗传疾病和严峻传染性疾病的患者可以运用；对有先天遗传疾病和严峻传染性疾病的患者可以运用；对有先天遗传疾病和严峻传染性疾病的患者可以运用；对有先天遗传疾病和严峻传染性疾病的患者可以运用；进进进进行行行行生生生生殖殖殖殖保保保保险险险险；如如如如男男男男性性性性绝绝绝绝育育育育手手手手术术术术者者者者，肿肿肿肿瘤瘤瘤瘤患患患患者者者者化化化化疗疗疗疗前前前前，从从从从事事事事危危危危急急急急行业者等；行业者等；行业者等；行业者等；对于少、弱精症者，可多次采集冷冻后加以浓缩；对于少、弱精症者，可多次采集冷冻后加以浓缩；对于少、弱精症者，可多次采集冷冻后加以浓缩；对于少、弱精症者，可多次采集冷冻后
4、加以浓缩；对对对对于于于于取取取取精精精精困困困困难难难难和和和和梗梗梗梗阻阻阻阻性性性性无无无无精精精精症症症症的的的的患患患患者者者者在在在在ICSIICSI治治治治疗疗疗疗时时时时，用用用用冻冻冻冻融融融融精精精精子子子子代代代代替替替替簇簇簇簇新新新新精精精精子子子子可可可可避避避避开开开开反反反反复复复复抽抽抽抽吸吸吸吸睾睾睾睾丸丸丸丸或或或或附附附附睾睾睾睾，利利利利于于于于医医医医患患患患双双双双方方方方驾驾驾驾驭驭驭驭治治治治疗进度。疗进度。疗进度。疗进度。3四川大学华西第二医院人类精子库冷冻损伤原理冷冻损伤原理 冰晶损伤学说冰晶损伤学说icecrystaldamage溶液效应
5、学说溶液效应学说solutedamage4四川大学华西第二医院人类精子库冷冻原理冷冻原理降温过程分期：降温过程分期：降温过程分期：降温过程分期：温度休克期温度休克期温度休克期温度休克期RT5RT5潜热扩散期潜热扩散期潜热扩散期潜热扩散期5 5 5 50 0 0 0 冰晶形成期冰晶形成期冰晶形成期冰晶形成期0 0 0 015151515再结晶期再结晶期再结晶期再结晶期15157979保存期保存期保存期保存期80801961965四川大学华西第二医院人类精子库冷冻损伤原理冷冻损伤原理 精子精子示意图：示意图：示意图：示意图：精子细胞外精子细胞外冰晶形成冰晶形成胞内冰晶形成胞内冰晶形成细胞脱水细胞脱
6、水冰晶损伤冰晶损伤溶液损伤溶液损伤降温降温快速快速慢速慢速6四川大学华西第二医院人类精子库冷冻对精子产生的损伤冷冻对精子产生的损伤 超微结构的损伤：超微结构的损伤：超微结构的损伤：超微结构的损伤：冷冻复温后的精子外膜变薄，波浪状变更或破损，胞冷冻复温后的精子外膜变薄，波浪状变更或破损，胞冷冻复温后的精子外膜变薄，波浪状变更或破损，胞冷冻复温后的精子外膜变薄，波浪状变更或破损，胞浆、顶体内和线粒体内透光度增加，顶体增宽，线粒浆、顶体内和线粒体内透光度增加，顶体增宽，线粒浆、顶体内和线粒体内透光度增加，顶体增宽，线粒浆、顶体内和线粒体内透光度增加，顶体增宽，线粒体外形变圆，轴丝增粗，提示细胞肿胀是
7、形态变更得体外形变圆，轴丝增粗，提示细胞肿胀是形态变更得体外形变圆，轴丝增粗，提示细胞肿胀是形态变更得体外形变圆，轴丝增粗，提示细胞肿胀是形态变更得主要征象。主要征象。主要征象。主要征象。精子功能：精子功能：精子功能：精子功能：日本学者探讨依据精子顶体功能和穿透率无显著日本学者探讨依据精子顶体功能和穿透率无显著日本学者探讨依据精子顶体功能和穿透率无显著日本学者探讨依据精子顶体功能和穿透率无显著变更，发觉冷冻精子授精实力无下降。变更，发觉冷冻精子授精实力无下降。变更，发觉冷冻精子授精实力无下降。变更，发觉冷冻精子授精实力无下降。染色体：染色体：染色体：染色体：目前对冷冻保存精子染色体自然畸变率报
8、道不多，仍目前对冷冻保存精子染色体自然畸变率报道不多，仍目前对冷冻保存精子染色体自然畸变率报道不多，仍目前对冷冻保存精子染色体自然畸变率报道不多，仍存在争论存在争论存在争论存在争论 7四川大学华西第二医院人类精子库冷冻爱护原理冷冻爱护液冷冻爱护液冷冻爱护液冷冻爱护液渗透性渗透性渗透性渗透性 增加细胞内外的渗透压，降低细胞内外液的增加细胞内外的渗透压，降低细胞内外液的增加细胞内外的渗透压，降低细胞内外液的增加细胞内外的渗透压，降低细胞内外液的冰点，削减冰晶的形成。冰点，削减冰晶的形成。冰点，削减冰晶的形成。冰点，削减冰晶的形成。非渗透性非渗透性非渗透性非渗透性 调整调整调整调整PHPH，细胞外渗
9、透压，增加养分，细胞外渗透压，增加养分，细胞外渗透压，增加养分，细胞外渗透压，增加养分不同温区最适的冷冻速率不同温区最适的冷冻速率不同温区最适的冷冻速率不同温区最适的冷冻速率探讨表明过快或过慢的降温都是不合适的，应依据探讨表明过快或过慢的降温都是不合适的，应依据探讨表明过快或过慢的降温都是不合适的，应依据探讨表明过快或过慢的降温都是不合适的，应依据不同的冷冻爱护剂选择各个温区最佳的降温速度。目不同的冷冻爱护剂选择各个温区最佳的降温速度。目不同的冷冻爱护剂选择各个温区最佳的降温速度。目不同的冷冻爱护剂选择各个温区最佳的降温速度。目前还未找到。前还未找到。前还未找到。前还未找到。8四川大学华西第二
10、医院人类精子库冷冻爱护剂冷冻爱护剂 （CPMCPM）依据依据依据依据CPMCPM的特性：的特性：的特性：的特性：非渗透性非渗透性非渗透性非渗透性CPMCPM：卵黄、葡萄糖、蔗糖：卵黄、葡萄糖、蔗糖：卵黄、葡萄糖、蔗糖：卵黄、葡萄糖、蔗糖 渗透性渗透性渗透性渗透性CPMCPM：甘油：甘油：甘油：甘油依据依据依据依据CPMCPM种类种类种类种类:单一甘油型单一甘油型单一甘油型单一甘油型 复合甘油型复合甘油型复合甘油型复合甘油型 无甘油型无甘油型无甘油型无甘油型9四川大学华西第二医院人类精子库冷冻爱护剂冷冻爱护剂 （CPMCPM）各成分的主要作用各成分的主要作用各成分的主要作用各成分的主要作用:甘油
11、：有渗透性，当进入精子细胞内时使精子内的含水蛋白质稳定，甘油：有渗透性，当进入精子细胞内时使精子内的含水蛋白质稳定，甘油：有渗透性，当进入精子细胞内时使精子内的含水蛋白质稳定，甘油：有渗透性，当进入精子细胞内时使精子内的含水蛋白质稳定，降低细胞内液冰点，削减冷冻时细胞内冰晶的形成。但甘油本身降低细胞内液冰点，削减冷冻时细胞内冰晶的形成。但甘油本身降低细胞内液冰点，削减冷冻时细胞内冰晶的形成。但甘油本身降低细胞内液冰点，削减冷冻时细胞内冰晶的形成。但甘油本身对细胞也有确定的毒性，一般终浓度限制在对细胞也有确定的毒性，一般终浓度限制在对细胞也有确定的毒性，一般终浓度限制在对细胞也有确定的毒性，一般
12、终浓度限制在7 7 7 710101010。卵黄：提高细胞外渗透压，含有卵磷脂，可以稳定精子的细胞膜，卵黄：提高细胞外渗透压，含有卵磷脂，可以稳定精子的细胞膜，卵黄：提高细胞外渗透压，含有卵磷脂，可以稳定精子的细胞膜，卵黄：提高细胞外渗透压，含有卵磷脂，可以稳定精子的细胞膜，防止顶体外膜裂开。它的缺点是冻融后有大量的颗粒和碎片，并防止顶体外膜裂开。它的缺点是冻融后有大量的颗粒和碎片，并防止顶体外膜裂开。它的缺点是冻融后有大量的颗粒和碎片，并防止顶体外膜裂开。它的缺点是冻融后有大量的颗粒和碎片，并且有病毒感染和过敏反应当可能。且有病毒感染和过敏反应当可能。且有病毒感染和过敏反应当可能。且有病毒感
13、染和过敏反应当可能。10四川大学华西第二医院人类精子库冷冻爱护剂冷冻爱护剂 （CPMCPM）各成分的主要作用各成分的主要作用各成分的主要作用各成分的主要作用:葡萄糖：与调整渗透压有关葡萄糖：与调整渗透压有关葡萄糖：与调整渗透压有关葡萄糖：与调整渗透压有关 缓冲系统：可以结合游离的缓冲系统：可以结合游离的缓冲系统：可以结合游离的缓冲系统：可以结合游离的H+H+H+H+和和和和OHOHOHOH，有助于溶液和精子脱水，有助于溶液和精子脱水，有助于溶液和精子脱水，有助于溶液和精子脱水现在常用现在常用现在常用现在常用CPM:CPM:CPM:CPM:单一甘油型单一甘油型单一甘油型单一甘油型 G G G G
14、Y Y Y YC C C C型（甘油卵黄柠檬酸钠型）型（甘油卵黄柠檬酸钠型）型（甘油卵黄柠檬酸钠型）型（甘油卵黄柠檬酸钠型）TEST TEST TEST TESTG G G GY Y Y YC C C C（TESTESTESTESTrisTrisTrisTris缓冲系统缓冲系统缓冲系统缓冲系统GYCGYCGYCGYC）型）型）型）型 G G G GY Y Y YC C C CG G G G型（型（型（型（GYCGYCGYCGYC谷氨酰胺）谷氨酰胺）谷氨酰胺）谷氨酰胺）改良改良改良改良T T T TG G G G型（改良型（改良型（改良型（改良TyrodeTyrodeTyrodeTyrode液甘
15、油型）液甘油型）液甘油型）液甘油型）11四川大学华西第二医院人类精子库冷冻爱护剂冷冻爱护剂 （CPMCPM）改良改良改良改良T T T TG G G G型，它的优点型，它的优点型，它的优点型，它的优点 有：有：有：有：相比有较好的冷冻复苏率（本精子库平均相比有较好的冷冻复苏率（本精子库平均相比有较好的冷冻复苏率（本精子库平均相比有较好的冷冻复苏率（本精子库平均62.662.662.662.6）可精确配制可精确配制可精确配制可精确配制不含卵黄，消退可能的病毒感染和过敏反应不含卵黄，消退可能的病毒感染和过敏反应不含卵黄，消退可能的病毒感染和过敏反应不含卵黄，消退可能的病毒感染和过敏反应背景清晰，无
16、大量颗粒和碎片背景清晰，无大量颗粒和碎片背景清晰，无大量颗粒和碎片背景清晰，无大量颗粒和碎片储存时间长，可达储存时间长，可达储存时间长，可达储存时间长，可达3 3 3 3个月个月个月个月12四川大学华西第二医院人类精子库降温程序分类：分类：分类：分类：程序降温：利用程序降温仪进行精确降温。程序降温：利用程序降温仪进行精确降温。程序降温：利用程序降温仪进行精确降温。程序降温：利用程序降温仪进行精确降温。手工降温：利用现有降温设备和液氮蒸气分步骤降温。手工降温：利用现有降温设备和液氮蒸气分步骤降温。手工降温：利用现有降温设备和液氮蒸气分步骤降温。手工降温：利用现有降温设备和液氮蒸气分步骤降温。注：
17、由于现在还没有找到降温过程中各个温区最佳降温速率，文献注：由于现在还没有找到降温过程中各个温区最佳降温速率，文献注：由于现在还没有找到降温过程中各个温区最佳降温速率，文献注：由于现在还没有找到降温过程中各个温区最佳降温速率，文献报道的各种降温程序精液复苏率效果不一！报道的各种降温程序精液复苏率效果不一！报道的各种降温程序精液复苏率效果不一！报道的各种降温程序精液复苏率效果不一！降温前处理：降温前处理：降温前处理：降温前处理：在室温中将精液与在室温中将精液与在室温中将精液与在室温中将精液与CPM 1:1CPM 1:1CPM 1:1CPM 1:1混匀，通常是在混匀，通常是在混匀，通常是在混匀，通常
18、是在20202020minminminmin逐量加入，且逐量加入，且逐量加入，且逐量加入，且用振荡器持续振荡，转速约用振荡器持续振荡，转速约用振荡器持续振荡，转速约用振荡器持续振荡，转速约300/300/300/300/minminminmin。此过程在提高精液复苏率中此过程在提高精液复苏率中此过程在提高精液复苏率中此过程在提高精液复苏率中起重要作用之一。起重要作用之一。起重要作用之一。起重要作用之一。13四川大学华西第二医院人类精子库降温程序程序降温程序降温 得到多数学者的认同，有精确定降温速率限制，得到多数学者的认同，有精确定降温速率限制，复苏率较高。缺点是仪器昂贵，运用和维护费用也较复苏
19、率较高。缺点是仪器昂贵，运用和维护费用也较高，不适合普及。高，不适合普及。14四川大学华西第二医院人类精子库降温程序手工降温：手工降温：手工降温：手工降温：2525（RTRT下加下加CPMCPM）44-20minLV-20minLV（LNLN上上5 5cmcm处）处）-10-10minLNminLN2525（RTRT下加下加CPMCPM）44-60min-60min2020-20minLN-20minLN2525（RTRT下下 加加 CPMCPM）44-20min-20min2020-20minLV-20minLV（LNLN上上5 5cmcm处处）-5-5minminLNLN2525（RTRT
20、下加下加CPMCPM）LVLV（LNLN上上5 5cmcm处）处）-15-15minLNminLN15四川大学华西第二医院人类精子库复温程序 原则：是快冻快复、慢冻慢复原则：是快冻快复、慢冻慢复 方法：方法：3737水浴快速复温水浴快速复温复温损伤机制：复温损伤机制：MohammadMohammad等连续视察精子在冷冻过程中等连续视察精子在冷冻过程中的损伤状况发觉绝大多数的细胞损伤发生在复苏期。的损伤状况发觉绝大多数的细胞损伤发生在复苏期。当快速降温时使细胞内产生小冰晶，假如缓慢复温，当快速降温时使细胞内产生小冰晶，假如缓慢复温，小冰晶将会融合成大冰晶对细胞形成损伤；当慢速降小冰晶将会融合成大
21、冰晶对细胞形成损伤；当慢速降温时细胞外的水分首先结冰，胞外溶质浓度上升导致温时细胞外的水分首先结冰，胞外溶质浓度上升导致精子细胞脱水，快速复温使胞外的水分来不及回渗，精子细胞脱水，快速复温使胞外的水分来不及回渗，造成精子的皱缩，形成溶质性损伤。造成精子的皱缩，形成溶质性损伤。16四川大学华西第二医院人类精子库冷冻复温后的处理冷冻复温后的处理 运运运运用用用用精精精精子子子子养养养养分分分分液液液液可可可可使使使使复复复复温温温温后后后后的的的的精精精精子子子子在在在在较较较较长长长长时时时时间间间间内内内内保保保保持持持持良好的活动率。良好的活动率。良好的活动率。良好的活动率。运运运运用用用用
22、化化化化学学学学物物物物质质质质如如如如：己己己己酮酮酮酮可可可可可可可可碱碱碱碱（PFPF）、2-2-脱脱脱脱氧氧氧氧腺腺腺腺苷苷苷苷（2-DA2-DA）提高冷冻复苏后的精子的活率和活力。）提高冷冻复苏后的精子的活率和活力。）提高冷冻复苏后的精子的活率和活力。）提高冷冻复苏后的精子的活率和活力。17四川大学华西第二医院人类精子库精液探讨的新进展精液探讨的新进展 玻璃化低温保存玻璃化低温保存玻璃化低温保存玻璃化低温保存 最志向化的精液保存方法。指在溶液降温过程中，最志向化的精液保存方法。指在溶液降温过程中，最志向化的精液保存方法。指在溶液降温过程中，最志向化的精液保存方法。指在溶液降温过程中，
23、相变后干脆转变为非晶态（玻璃态）的固态。由于相变后干脆转变为非晶态（玻璃态）的固态。由于相变后干脆转变为非晶态（玻璃态）的固态。由于相变后干脆转变为非晶态（玻璃态）的固态。由于玻璃态分子间的关系和液态没有明显变更，可避开玻璃态分子间的关系和液态没有明显变更，可避开玻璃态分子间的关系和液态没有明显变更，可避开玻璃态分子间的关系和液态没有明显变更，可避开冰晶形成过程中对细胞的损伤。要形成玻璃态必需冰晶形成过程中对细胞的损伤。要形成玻璃态必需冰晶形成过程中对细胞的损伤。要形成玻璃态必需冰晶形成过程中对细胞的损伤。要形成玻璃态必需有两个条件：有极大的冷却速率；极大增加溶液的有两个条件：有极大的冷却速率
24、；极大增加溶液的有两个条件：有极大的冷却速率；极大增加溶液的有两个条件：有极大的冷却速率；极大增加溶液的浓度。浓度。浓度。浓度。18四川大学华西第二医院人类精子库精液探讨的新进展精液探讨的新进展冷冻损伤的新理论：冷冻损伤的新理论：冷冻损伤的新理论：冷冻损伤的新理论：活性氧（活性氧（活性氧（活性氧（ROSROS）的损伤：）的损伤：）的损伤：）的损伤：精精精精液液液液冷冷冷冷冻冻冻冻过过过过程程程程中中中中产产产产生生生生较较较较多多多多的的的的活活活活性性性性氧氧氧氧，特特特特殊殊殊殊是是是是标标标标本本本本中中中中白白白白细细细细胞胞胞胞含含含含量量量量较较较较高高高高时时时时。从从从从样样样
25、样本本本本中中中中除除除除去去去去白白白白细细细细胞胞胞胞或或或或冷冷冷冷冻冻冻冻前前前前用用用用抗氧化剂处理，可以提高精子的活力和功能。抗氧化剂处理，可以提高精子的活力和功能。抗氧化剂处理，可以提高精子的活力和功能。抗氧化剂处理，可以提高精子的活力和功能。膜穿透性：膜穿透性：膜穿透性：膜穿透性：不不不不同同同同爱爱爱爱护护护护剂剂剂剂成成成成分分分分对对对对细细细细胞胞胞胞膜膜膜膜的的的的穿穿穿穿透透透透性性性性，水水水水对对对对细细细细胞胞胞胞膜膜膜膜的的的的穿穿穿穿透透透透性性性性，它它它它们们们们的的的的大大大大小小小小确确确确定定定定了了了了冷冷冷冷冻冻冻冻爱爱爱爱护护护护剂剂剂剂与
26、与与与精精精精液液液液混混混混合合合合时时时时平平平平衡衡衡衡的的的的时时时时间间间间及及及及降降降降温温温温速速速速率率率率。穿穿穿穿透透透透性性性性越越越越大大大大的的的的冷冷冷冷冻冻冻冻爱爱爱爱护护护护剂剂剂剂可可可可以以以以得到较高的冷冻复苏率。得到较高的冷冻复苏率。得到较高的冷冻复苏率。得到较高的冷冻复苏率。19四川大学华西第二医院人类精子库精液探讨的新进展精液探讨的新进展冷冻爱护剂渗透压冷冻爱护剂渗透压冷冻爱护剂渗透压冷冻爱护剂渗透压冷冷冷冷冻冻冻冻爱爱爱爱护护护护剂剂剂剂渗渗渗渗透透透透压压压压的的的的大大大大小小小小也也也也是是是是导导导导致致致致精精精精液液液液冷冷冷冷冻冻冻
27、冻损损损损伤伤伤伤的的的的主主主主要要要要因因因因素素素素之之之之一一一一。冷冷冷冷冻冻冻冻爱爱爱爱护护护护剂剂剂剂渗渗渗渗透透透透压压压压2000mOsm2000mOsm时时时时大大大大部部部部分分分分细细细细胞胞胞胞膜膜膜膜会会会会受受受受到到到到破破破破坏坏坏坏。这这这这一一一一损损损损伤伤伤伤同同同同时时时时也也也也与与与与细细细细胞胞胞胞本本本本身身身身可可可可以以以以承承承承受受受受渗渗渗渗透透透透压压压压变变变变更更更更的的的的程程程程度度度度，在在在在冷冷冷冷冻冻冻冻和和和和复复复复温温温温过过过过程中，假如渗透压变更超过细胞本身承受实力，严峻的细胞将死亡。程中，假如渗透压变更
28、超过细胞本身承受实力，严峻的细胞将死亡。程中，假如渗透压变更超过细胞本身承受实力，严峻的细胞将死亡。程中，假如渗透压变更超过细胞本身承受实力，严峻的细胞将死亡。冷打击冷打击冷打击冷打击 精精精精子子子子从从从从室室室室温温温温降降降降到到到到0 0时时时时会会会会受受受受到到到到损损损损伤伤伤伤，我我我我们们们们称称称称之之之之为为为为冷冷冷冷打打打打击击击击。它它它它往往往往往往往往确确确确定于精子本身抗冷打击的实力。定于精子本身抗冷打击的实力。定于精子本身抗冷打击的实力。定于精子本身抗冷打击的实力。20四川大学华西第二医院人类精子库本精子库冷冻试验进展n n已建立合理的精液冷冻程序已建立合
29、理的精液冷冻程序n n共进行精液冷冻试验共进行精液冷冻试验169169例，平均复苏率达例，平均复苏率达62.662.6n n随着条件不断的摸索，冷冻复苏率也在不断地提高；随着条件不断的摸索，冷冻复苏率也在不断地提高；n n已建立比较稳定的精液冷冻方法，冷冻复苏率完全满已建立比较稳定的精液冷冻方法，冷冻复苏率完全满足卫生部的要求。足卫生部的要求。21四川大学华西第二医院人类精子库精液冷冻探讨的方向找寻更加适合精液冷冻的冷冻爱护剂；找寻更加适合精液冷冻的冷冻爱护剂；探讨渗透压对精液冷冻产生的影响；探讨渗透压对精液冷冻产生的影响；活性氧（活性氧（ROSROS）对精液冷冻产生的影响及应对方法；）对精液冷冻产生的影响及应对方法；依据冷冻爱护剂选择各个降温区最佳降温速度；依据冷冻爱护剂选择各个降温区最佳降温速度；22四川大学华西第二医院人类精子库23