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1、呼吸道标本呼吸道标本(biobn)(biobn)的处理程序的处理程序王勇第一页，共九十一页。内容简介内容简介n n上呼吸道标本(biobn)(biobn)标准操作程序（SOP）n n下呼吸道标本标准操作程序（SOP）n n痰标本的规范化操作（草案）第二页，共九十一页。上呼吸道上呼吸道(shnghxdo)(shnghxdo)标本处理程序标本处理程序n n大部分步骤需要在生物安全柜内接种大部分步骤需要在生物安全柜内接种n n细菌性咽炎的实验室诊断n n原理n n大多数上呼吸道感染是由病毒引起的。细菌性咽炎经常是由大多数上呼吸道感染是由病毒引起的。细菌性咽炎经常是由化脓性链球菌引起。但重度的会厌炎和
2、喉气管炎则是例外，化脓性链球菌引起。但重度的会厌炎和喉气管炎则是例外，其一般是由于其一般是由于b b型流感嗜血杆菌引起。型流感嗜血杆菌引起。n n标本标本n n从扁桃体和后咽部采集标本的咽拭子从扁桃体和后咽部采集标本的咽拭子n n选择性培养基（如表选择性培养基（如表1 1）n n5%5%羊血琼脂羊血琼脂n n含抗生素的含抗生素的Thayer Martin Thayer Martin 琼脂（琼脂（GC+GC+）和无抗生素的）和无抗生素的(仅仅用于淋病奈瑟菌病例用于淋病奈瑟菌病例)n n巧克力琼脂（仅用于会厌炎和喉气管炎病例）巧克力琼脂（仅用于会厌炎和喉气管炎病例）n n质量控制质量控制(kngz
3、h)(kngzh)n n培养基使用之前，培养基使用之前，QCQC由培养基组负责。由培养基组负责。n n第三页，共九十一页。上呼吸道上呼吸道(shnghxdo)(shnghxdo)标本处理程序标本处理程序n n培养程序n n在在1/61/6琼脂表面用力滚动拭子，并划线分离。琼脂表面用力滚动拭子，并划线分离。n n在一区用接种在一区用接种(jizhng)(jizhng)针穿刺血平板几次。（图针穿刺血平板几次。（图1 1）n n把平板放置在把平板放置在5%CO25%CO2培养。培养。第四页，共九十一页。下呼吸道标本(biobn)(biobn)的处理 n n大多数标本需要在安全柜内操作n n常规(ch
4、nggu)(chnggu)细菌培养n n原理原理n n下呼吸道感染包括支气管炎，细支气管炎和肺炎。以上炎症，特别是肺炎，可以引起严重甚至是致命的疾病。虽然病毒，支原体，立克次(氏)体和真菌都可以引起下呼吸道感染，但细菌是主要的病原体，其所占的比例要比上呼吸道感染要高很多。第五页，共九十一页。下呼吸道标本(biobn)(biobn)的处理 n n下呼吸道标本培养的常见病原菌下呼吸道标本培养的常见病原菌n n 革兰阳性菌 革兰阴性菌 金黄色葡萄球菌 脑膜炎奈瑟氏菌 化脓性链球菌 流感嗜血杆菌 肺炎链球菌 肠杆菌科细菌 结核分支杆菌 非发酵(f jio)(f jio)菌 白喉棒状杆菌 嗜肺军团菌 假
5、丝酵母菌第六页，共九十一页。下呼吸道标本(biobn)(biobn)的处理 n n标本标本n n痰n n气管或经气管壁抽吸(chu x)(chu x)物n n支气管标本n n支气管灌洗液，毛刷，活检标本第七页，共九十一页。下呼吸道标本(biobn)(biobn)的处理 n n材料材料n n培养基n n5%羊血平板n n巧克力平板n n中国(zhn(zhn u)u)兰n n念珠菌显色培养基n n试剂试剂n nSputasolSputasol（OXOIDOXOID）第八页，共九十一页。下呼吸道标本(biobn)(biobn)的处理n n质量控制质量控制培养基使用之前，培养基使用之前，QCQC由培养
6、基组负责。由培养基组负责。n n操作程序操作程序n n肉眼观察肉眼观察n n记录痰标本的外观并记录在申请单背面。记录痰标本的外观并记录在申请单背面。n n外观描述外观描述(mio sh)(mio sh)及简写如下：及简写如下：n n唾液（唾液（S S）带血带血 （BSBS）粘液状（粘液状（MM）水样水样（WW）n n粘液脓性的（粘液脓性的（MPMP）脓痰（脓痰（P P）脓性粘液痰）脓性粘液痰（PMPM）n n拒收拒收“唾液唾液”标本并报告标本并报告“标本不适合用于进一步处理标本不适合用于进一步处理”“”“请重留请重留”第九页，共九十一页。下呼吸道标本(biobn)(biobn)的处理n n显微
7、镜检显微镜检n n用拭子取所有类型标本的脓液部分涂片，用拭子取所有类型标本的脓液部分涂片，（最好在（最好在6060度热固定涂片度热固定涂片2 2小时），并准备小时），并准备革兰染色革兰染色n n低倍镜下检查涂片（低倍镜下检查涂片（1010倍目镜）；定量计倍目镜）；定量计数数(j sh)(j sh)1010个视野下鳞状上皮细胞和白细胞个视野下鳞状上皮细胞和白细胞平均数。按照表平均数。按照表1 1分级标准记录在工作表上。分级标准记录在工作表上。第十页，共九十一页。低倍镜下细胞(xbo)(xbo)计数（10个视野平均数）倍数倍数倍数倍数0 0偶见偶见偶见偶见1+1+2+2+3+3+上皮细胞上皮细胞上
8、皮细胞上皮细胞100100无无无无102 52 5WBC 100WBC 100无无无无2580(80(或四分之一视野或四分之一视野或四分之一视野或四分之一视野 20)20)第十一页，共九十一页。n n如果标本要求革兰染色，在如果标本要求革兰染色，在100倍目镜下倍目镜下检查病原体并记录在工作表上检查病原体并记录在工作表上n n对涂片显示上皮细胞占优势，（对涂片显示上皮细胞占优势，（3+）丢）丢掉标本并报告掉标本并报告“涂片显示口腔正常涂片显示口腔正常(zhngchng)(zhngchng)菌群污染菌群污染”“标本不适合用于进一步处标本不适合用于进一步处理理”“请重留请重留”第十二页，共九十一页
9、。培养(piy(piy ng)ng)程序1.1.水样痰标本水样痰标本水样痰标本水样痰标本直接直接(zhji)(zhji)接种到培养基，并划线分离接种到培养基，并划线分离2.2.脓性标本（特别是痰）脓性标本（特别是痰）脓性标本（特别是痰）脓性标本（特别是痰）-匀浆化匀浆化3.3.SputasolSputasol（OXIDEOXIDE）的配制）的配制4.4.无菌操作下，取瓶中的液体无菌操作下，取瓶中的液体1.5ml1.5ml，加入到，加入到18.5 ml18.5 ml无菌水中。无无菌水中。无菌条件下菌条件下2-82-8至少稳定至少稳定4848小时小时痰液化的常规操作程序。痰液化的常规操作程序。痰液
10、化的常规操作程序。痰液化的常规操作程序。痰液中加入等体积的稀释后痰液中加入等体积的稀释后SPUTASOLSPUTASOL 旋涡振荡标本旋涡振荡标本20-30 s20-30 s，并置室温并置室温1515分钟分钟 再次旋涡振荡是标本达到进一步液化。准备立即接种标本。再次旋涡振荡是标本达到进一步液化。准备立即接种标本。用拭子取混悬液到培养基，并划线。用拭子取混悬液到培养基，并划线。5.5.支气管灌洗液（支气管灌洗液（支气管灌洗液（支气管灌洗液（BALBAL）的定量培养）的定量培养）的定量培养）的定量培养6.6.旋涡振荡旋涡振荡BALBAL并用并用0.01 ml0.01 ml定量接种环接种到平板上定量
11、接种环接种到平板上。n n放置在放置在放置在放置在5%CO25%CO2培养箱内培养箱内培养箱内培养箱内第十三页，共九十一页。第十四页，共九十一页。您可能每天面临以下您可能每天面临以下(y(y xi)xi)问题的挑问题的挑战战n痰标本分离(fnl)(fnl)出4种细菌做哪一种细菌的药敏试验？n数量很多的凝固酶阴性葡萄球菌在痰里分离出来是否要做药敏?第十五页，共九十一页。临床微生物实验室规范(gufn)(gufn)操作草案第十六页，共九十一页。草案草案(c(c o n)o n)分七部分分七部分n n标本采集和运送的规范条例n n培养前标本质量检测规范n n标本接种规范条例n n细菌鉴定基本(jbn
12、)(jbn)流程规范条例n n细菌药物敏感试验规范条例n n实验室质量控制n n细菌报告规范条例等第十七页，共九十一页。第一部分(b fen)(b fen)标本采集和运送n n标标本本本本(biobn(biobn(biobn(biobn)采集和运送是细菌培养成功的最重采集和运送是细菌培养成功的最重要的关键要的关键!n n但由于标本的采集和运送常有护士或医生或病人自己完成，但由于标本的采集和运送常有护士或医生或病人自己完成，所以也是最不容易做好的事情，而且不知道问题所在之处，所以也是最不容易做好的事情，而且不知道问题所在之处，由此引发的最主要后果是阳性率下降，这也是临床医生最由此引发的最主要后果
13、是阳性率下降，这也是临床医生最不能接受的问题，为此建议来一次革命，用输送培养基代不能接受的问题，为此建议来一次革命，用输送培养基代替传统的标本的容器替传统的标本的容器。第十八页，共九十一页。痰标本(biobn)(biobn)的采集和运送条例1.1.标本采集时间：用抗生素前；晨痰;2.2.采集方法：n n（1）自然咳痰：用清水漱口(sh ku)(sh ku)3次，应包括咽喉部，用力咳出痰，与灭菌容器中或输送培养基中。第十九页，共九十一页。痰标本的采集和运送(yn sn(yn sn)条例n n（2 2）帮助咳痰：不易获得痰的患者可雾化吸入加温）帮助咳痰：不易获得痰的患者可雾化吸入加温的氯化钠（的氯
14、化钠（45104510氯化钠水溶液）氯化钠水溶液）n n（3）支气管镜或支气管毛刷：由医生采集，建议直接种入输送培养基。n n（4 4）胃内采集痰标本：婴幼儿不会咳痰而且常把痰）胃内采集痰标本：婴幼儿不会咳痰而且常把痰误咽入胃中。可在清晨，用胃管插入胃内，用注射器误咽入胃中。可在清晨，用胃管插入胃内，用注射器抽出胃液。抽出胃液。n n（5 5）小儿采集痰标本：用压舌板刺激）小儿采集痰标本：用压舌板刺激(cj)(cj)咳嗽使肺部和咳嗽使肺部和器官的分泌物喷出，用拭子采取标本送检，如不能立即送器官的分泌物喷出，用拭子采取标本送检，如不能立即送检应种入输送培养基。检应种入输送培养基。第二十页，共九十
15、一页。厌氧培养(piy(piy ng)ng)标本采集规范条例1.1.痰标本的厌氧培养标本采集：必须用气管穿刺法获得痰液，从口腔吐出的痰标本不能用于厌氧培养。2.2.尿标本的厌氧培养标本采集：耻骨上膀胱穿刺获得尿标本可用于厌氧菌培养3.3.便标本厌氧培养标本采集;可用排出(pi ch)(pi ch)的便作厌氧培养但也应少与空气接触。第二十一页，共九十一页。第二(d r)(d r)部分标本培养前规范草案n n合格的标本是培养成功的最重要的因素，实验室有权利对不合格提出终止检查或要求重送标本的要求，因此实验室必须建立(jinl)(jinl)标本接种前的质量控制和标本合格的检测。要求对除血液外的标本均
16、作涂片革兰染色检查，用于评价标本的质量和区别分离细菌是定植菌或致病菌。第二十二页，共九十一页。痰培养(piy(piy ng)ng)标本培养(piy(piy ng)ng)前规范n n实验室在接种前必须作痰涂片革兰染色当在低倍镜下白细胞小于10个每视野、上皮细胞大于25个每视野时应作为不宜作培养的标本n n当白细胞小于10个每视野，上皮细胞小于25个每视野时再参照油镜观察标本中细菌(xjn)(xjn)分布作判断；第二十三页，共九十一页。痰培养(piy(piy ng)ng)标本培养(piy(piy ng)ng)前规范n n当标本中细菌种类超过3种以上，未见到纤毛柱状上皮细胞，作为不合格标本；n n如
17、见到数量不等的白细胞或纤毛柱状上皮细胞或两者同在，含1-2种不同细菌，可考虑继续培养，结果可根据病情(bngqng)(bngqng)再作分析；n n当涂片中见到1-3种细菌，少量的扁平上皮细胞，少量或较多纤毛柱状上皮细胞均可按合格标本继续培养。第二十四页，共九十一页。厌氧培养(piy(piy ng)ng)n n在正常(zhngchng)(zhngchng)上班时间。n n申请厌氧培养的可适应邀请实验室，由临床医生或护士采集，细菌室行床边接种。n n自然排出的便标本和尿标本、用棉拭子采集的分泌物、自然咳出的痰标本均为不合格的厌氧培养标本，应于退检。n n没有条件或不能及时送检的情况下均应用输送培
18、养基放置标本。第二十五页，共九十一页。培养结果(ji gu(ji gu)结合涂片判断定置菌或致病菌n n1、尿培养分离出3种以上(yshng)(yshng)的细菌，或分离出凝固酶阴性葡萄球菌、革兰阳性棒状杆菌等非定义为致病菌的细菌，涂片未见到，应在报告中提示可能是污染细菌建议结合临床表现考虑结果的参考价值。n n2、眼结膜拭子分离出凝固酶阴性葡萄球菌，涂片未见到，可能是污染细菌，应建议重送标本。第二十六页，共九十一页。培养结果(ji gu(ji gu)结合涂片判断定置菌或致病菌n n3、前列腺液标本分离出凝固(nngg)(nngg)酶阴性葡萄球菌或革兰阳性小杆菌，涂片未见到，可能是污染细菌，应
19、建议重送标本。n n4、当涂片中见到的细菌，并由细菌吞嗜现象存在，在培养时分离出该细菌可推测为致病菌。（涂片应注明细菌是细胞内或细胞外）第二十七页，共九十一页。培养结果(ji gu(ji gu)结合涂片判断定置菌或致病菌n n5、涂片报告的日期和培养报告日期要对应便于医生判别(pnbi)(pnbi)结果的参考价值。n n6、并每一视野可见到20个/油镜或该菌占所见到细菌的50%，可推测是标本中的优势菌。第二十八页，共九十一页。第三部分分离培养规范(gufn)(gufn)草案n有了合格的标本是保证培养成功的重要条件，但如果没有适宜的分离培养基和培养环境同样不能获得好的结果，为此制定(zhdng)
20、(zhdng)如下基本条例以保证致病菌分离成功。第二十九页，共九十一页。一、痰培养(piy(piy ng)ng)1.1.培养基：5%羊血琼脂、5%兔血巧克力琼脂、中国兰琼脂或伊红美兰、加MRSA显色琼脂。2.2.培养环境：5%羊血琼脂、5%兔血巧克力琼脂置5-7%CO235环境培养、其他培养置35空气(kngq)(kngq)培养。3.3.结核培养：罗世鸡蛋斜面，每一标本种2支，37度空气培养第三十页，共九十一页。第四部分细菌鉴定(jindng)(jindng)规范草案n n当分离到细菌后进行鉴定分类是十分必要的，由于各级医院所具有的技术水平、设备条件差异，但对菌株的鉴定应包括(boku)(bo
21、ku)以下基本步骤：第三十一页，共九十一页。涂片(t pin)(t pin)染色n n一、涂片染色：应具备最基本的两种染色技术，即革兰氏染色和抗酸染色n n1、革兰染色：革兰染色报告必须包括染色反应或微生物种类和类别，描述物种的形态或结构。如革兰染色见到革兰阳性球菌，是葡萄状排列；又如革兰染色见到真菌小分生孢子及菌丝。n n2 2、抗酸染色：抗酸染色报告应显示找到或未找到或可、抗酸染色：抗酸染色报告应显示找到或未找到或可疑抗酸杆菌三种结果，报告中应加号体现疑抗酸杆菌三种结果，报告中应加号体现(txin)(txin)标本中标本中抗酸杆菌的存在量。如找到抗酸杆菌抗酸杆菌的存在量。如找到抗酸杆菌+；
22、见到染色不典；见到染色不典型抗酸杆菌型抗酸杆菌+，建议再送标本。，建议再送标本。第三十二页，共九十一页。趋向性鉴定(jindng)(jindng)试验n n革兰阳性球菌：触酶试验(shyn)(shyn)、凝固酶试验(shyn)(shyn)n n革兰阴性杆菌：氧化酶试验第三十三页，共九十一页。生化(shn(shn hu)hu)试验n n应包括临床常见(chn jin)(chn jin)分离致病菌的生物特征；有条件的实验室建议购买商品鉴定系统，根据标本量选择手工操作的API系统或半自动的ATB系统或全自动的VITEK-2COMPACT，或PHENIX-100等，无条件的实验室可自行配制生化试剂，但
23、应有质量控制记录保证试剂的实效性。第三十四页，共九十一页。血清学试验(shyn)(shyn)n n肠道致病菌生化特征(tzhng)(tzhng)符合的前提下必须有血清学的试验作最后确认，基层细菌室应具备1-3项血清试剂。第三十五页，共九十一页。血清学鉴定(jindng)(jindng)1.1.志贺氏菌多价和单价凝集(nngj)(nngj)血清2.2.沙门氏菌多价和单价凝集血清3.3.致病性大肠杆菌多价和单价凝集血清4.4.耶尔森氏菌凝集血清第三十六页，共九十一页。真菌(zhnjn)(zhnjn)检测1.1.每一基层实验室必须开展真菌涂片，报告临床是否找到真菌；是否见到真菌菌丝；从形态辨别曲菌或
24、毛霉菌2.2.开展真菌分离培养(piyng)(piyng)，应具备最基本的沙保弱培养(piyng)(piyng)基第三十七页，共九十一页。真菌(zhnjn)(zhnjn)检测3.3.真菌鉴定应区别是白色念珠菌或非白色念珠菌；是曲菌或毛霉菌，可用显色培养基或传统手工鉴定厚膜孢子的方法，对丝状真菌用小培养观察生长过程初步鉴定真菌种并区别曲菌或毛霉菌。有条件的实验室也可用自动化设备或分子生物学方法作鉴定。4.4.有条件的单位可开展真菌药敏试验（应用稀释(xsh)(xsh)法报告MIC结果），真菌耐药监测为临床用药提供参考。第三十八页，共九十一页。第五(d w(d w)部分药物敏感试验规范n基层细菌(
25、xjn)(xjn)室应开展K-B纸片扩散法药敏试验，应用WHONET软件开展本单位的耐药监测为临床用药提供参考第三十九页，共九十一页。药敏标准药敏标准(biozh(biozh n)n)1.1.用CLSI指南推荐的K-B药敏标准进行常规药敏试验判断2.2.根据CLSI更新及时替换应用的标准3.3.根据CLSI推荐的方法(fngf)(fngf)，开展重要耐药菌的检测，如MRSA、VRE、HLARE、ESBL。第四十页，共九十一页。药敏方法(fngf(fngf)1.K-B纸片扩散药敏方法作为常规药敏方法。2.2.CLSI没有设定标准的抗生素应用稀释法报告(bogo)(bogo)MIC结果。第四十一页
26、，共九十一页。药敏试验的质量(zhling)(zhling)控制1.1.1.1.初始初始(ch sh)(ch sh)(ch sh)(ch sh)质量控制应换质量控制应换CLSICLSI要求连续要求连续3030天天直到失控小于直到失控小于3 3次为止。次为止。2.2.2.2.常规药敏质量控制应保持每周一次。常规药敏质量控制应保持每周一次。3.3.3.3.发生失控后应按发生失控后应按CLSICLSI程序纠控，选择对失程序纠控，选择对失控抗生素的标准菌株，做纸片扩散药敏，控抗生素的标准菌株，做纸片扩散药敏，同一药物贴同一药物贴5 5张纸片，连续测试张纸片，连续测试5 5天，寻找天，寻找原因，纠正错误
27、。如第一天已找到合理的原因，纠正错误。如第一天已找到合理的原因，可提前恢复常规药敏质控。原因，可提前恢复常规药敏质控。第四十二页，共九十一页。第六部分(b fen)(b fen)临床微生物实验室的质量控制n n质量(zhling)(zhling)控制是保证实验室检测结果正确的重要措施，质量(zhling)(zhling)指控包括室内和室间质量(zhling)(zhling)控制。参加室间质量(zhling)(zhling)控制有利于发现实验室的系统误差，是对室内质量(zhling)(zhling)控制的评价，因此二级或以下医院细菌室应参加本省或本市的临床细菌室的定期的质量(zhling)(zh
28、ling)控制活动。第四十三页，共九十一页。第七部分临床(ln chun(ln chun)细菌室报告制度的规范n n细菌实验室应对不同的细菌检验报告时间和内容应有相应的规定，并告诉临床各科，依此可防止不明(b mn)(b mn)原因的报告延迟 n n应分两种报告形式：1.1.危重感染报告：2.2.常规报告：第四十四页，共九十一页。涂片(t pin)(t pin)报告1、革兰染色：危重报告30分钟报告。报告内容应包括染色反应、是细菌或真菌、细菌形态。有无细胞内吞嗜现象，有无菌丝。2、抗酸染色：报告抗酸染色阳性或阴性；菌量以加号(ji ho)(ji ho)表示。常规报告24小时，危重报告1小时。第四十五页，共九十一页。痰培养(piy(piy ng)ng)n n24小时初始报告，报告内容包括痰标本(biobn)(biobn)是否合格、优势细菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌等特征明显细菌的鉴定结果第四十六页，共九十一页。合格合格(hg)(hg)的痰标本的痰标本n n10 80(或四分之一视野 20)。（涂片应注明细菌是细胞内或细胞外）。真菌鉴定应区别(qbi)是白色念珠菌或非白色念珠菌。基层细菌室应开展K-B纸片扩散法药敏试验，应用WHONET软件开展本单位的耐药监测为临床用药提供参考。痰培养。嗜血杆菌属(流感嗜血除外)第九十一页，共九十一页。