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1、课题课题1 1 微生物的实验室培养微生物的实验室培养1.1.提供营养和条件提供营养和条件 2.2.防止污染防止污染一一.培养基：培养基：微生物生存的环境和营养物质微生物生存的环境和营养物质1.1.基本成分：基本成分：思考：微生物“吃”什么？碳源、氮源、水、无机盐碳源、氮源、水、无机盐碳源碳源无机碳源：无机碳源：有机碳源：有机碳源：COCO2 2、COCO3 32 2-、HCOHCO3 3-牛肉膏、蛋白胨等牛肉膏、蛋白胨等自养微生物自养微生物异养微生物异养微生物氮源氮源无机氮源：无机氮源：有机氮源：有机氮源：NHNH4 4、NONO3 3-牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿
2、素等注：含注：含C C、H H、O O、N N的的有机物有机物是是异异养型微生物的：养型微生物的：碳源碳源、氮源氮源、能源。能源。一一.培养基：培养基：微生物生存的环境和营养物质微生物生存的环境和营养物质2.2.特殊营养特殊营养：维生素（如乳酸杆菌）、碱基等维生素（如乳酸杆菌）、碱基等（牛肉膏、酵母膏、蛋白胨中含有）（牛肉膏、酵母膏、蛋白胨中含有）3.pH3.pH、氧气的需求：氧气的需求：霉菌（霉菌（pHpH调至酸性）调至酸性）细菌（细菌（pHpH调至中性或微碱性）调至中性或微碱性）厌氧生物需提供无氧条件。厌氧生物需提供无氧条件。一一.培养基：培养基：微生物生存的环境和营养物质微生物生存的环境
3、和营养物质4.4.培养基种类培养基种类固体培养基固体培养基液体培养基液体培养基有有无无 凝固剂琼脂凝固剂琼脂分离分离 鉴定鉴定工业工业 生产生产化学成分：化学成分：物理性质：物理性质：天然培养基天然培养基 合成培养基合成培养基考点考点1、微生物的实验室培养、微生物的实验室培养一、培养基的分类一、培养基的分类 选择培养基的应用选择培养基的应用加入青霉素的培养基加入青霉素的培养基分离酵母菌、霉菌等真菌分离酵母菌、霉菌等真菌加入高浓度食盐的培养基加入高浓度食盐的培养基分离金黄色葡萄球菌分离金黄色葡萄球菌不加氮源的无氮培养基不加氮源的无氮培养基分离固氮菌分离固氮菌不加含碳有机物的无碳培养基不加含碳有机
4、物的无碳培养基分离自养型微生物分离自养型微生物伊红美蓝培养基伊红美蓝培养基鉴别大肠杆菌鉴别大肠杆菌问题讨论若硝化细菌、圆褐固氮菌、不固氮的蓝藻混若硝化细菌、圆褐固氮菌、不固氮的蓝藻混合在一起，我们配置什么样的培养即可以将合在一起，我们配置什么样的培养即可以将三种微生物分离？三种微生物分离？碳源碳源氮源氮源能源能源硝化细菌硝化细菌CO2氨氨氨氨圆褐固氮菌圆褐固氮菌糖类等含糖类等含碳有机物碳有机物N2有机物有机物不固氮的蓝藻不固氮的蓝藻CO2铵盐、硝酸盐铵盐、硝酸盐光光不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方调节调节pHpH2 2、成分、成分水、碳源、氮源、
5、水、碳源、氮源、无机盐、无机盐、生长因子生长因子(生长因子即细菌生长必需，而自身不能合成的生长因子即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物化合物,如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)真菌：真菌：5 56 6 细菌：细菌：6.5 6.5 7.5 7.5 有时会加一定量的氯化钠以维持一定的渗透压有时会加一定量的氯化钠以维持一定的渗透压5.5.配制原则配制原则目的明确：目的明确：营养全面、浓度适宜、比例恰当营养全面、浓度适宜、比例恰当适宜的适宜的pHpH值：值：有机碳源有机碳源异养型：异养型：根据微生物的根据微生物的种类、培养目的种类、培养目的选择原料选择原料自养型：自养
6、型：不不加碳源加碳源加入缓冲剂加入缓冲剂细菌偏碱，真菌偏酸细菌偏碱，真菌偏酸（COCO2 2碳源）碳源）生产生产科研科研2.2.无菌范围：无菌范围：实验操作空间消毒实验操作空间消毒操作者的手、衣着消毒操作者的手、衣着消毒实验用具灭菌实验用具灭菌实验操作过程实验操作过程二二.无菌技术：无菌技术：防止外来杂菌的污染防止外来杂菌的污染1.1.消毒与灭菌：消毒与灭菌：酒精灯旁操作酒精灯旁操作超净工作台超净工作台比较消毒与灭菌(原理相同）比比较项理化因理化因素的素的作用作用强度度消消灭微微生物生物的数的数量量芽芽孢和和孢子子能否能否被消被消灭消消毒毒灭菌菌较为温和较为温和部分生活状态部分生活状态的微生物
7、的微生物不能不能能能全部微生物全部微生物强烈强烈高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌（湿热灭菌）（湿热灭菌）洒精灯灼烧灭菌洒精灯灼烧灭菌干热灭菌干热灭菌（1 1）灭菌方法：）灭菌方法：3 3、常用的灭菌和消毒的方法、常用的灭菌和消毒的方法培养基、无菌水、培养基、无菌水、各种耐高温的玻璃金属器具各种耐高温的玻璃金属器具100kPa100kPa、121 121 下维持下维持15-30min15-30min需要保持干燥需要保持干燥耐高温的玻璃金属器皿耐高温的玻璃金属器皿160-170 160-170 下加热下加热1-2h1-2h接种环等金属器具接种环等金属器具1 1、煮沸消毒法煮沸消毒法:100100煮沸煮沸5
8、-6min5-6min2 2、巴氏消毒法：、巴氏消毒法：70-75 70-75 下煮下煮30min30min或或 80 80 下煮下煮15min15min3 3、化学药剂消毒法、化学药剂消毒法:用用75%75%酒精、新洁尔酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒灭等进行皮肤消毒;氯气消毒水源氯气消毒水源4 4、紫外线消毒、紫外线消毒(2)消毒的方法：消毒的方法：3.3.常用的消毒与灭菌的方法常用的消毒与灭菌的方法请你判断以下材料或用具是否需要消毒或请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。灭菌。如果需要，请选择合适的方法。（1 1）培养细菌用的培养基与培养皿培养细菌用的培养基与
9、培养皿（2 2）玻棒、试管、烧瓶和吸管玻棒、试管、烧瓶和吸管（3 3）实验操作者的双手实验操作者的双手单个单个或少数菌体或少数菌体2.2.特征：特征：大小、形状、光泽度、大小、形状、光泽度、颜色、透明度等。颜色、透明度等。3.3.功能：功能：1.1.定义：定义：三三.菌落菌落鉴定菌种鉴定菌种的重要依据的重要依据固体固体培养基上培养基上大量繁殖大量繁殖子细胞群体子细胞群体1000ml1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的配方牛肉膏蛋白胨培养基的配方H2O 定容至定容至1000mlNaCl 5g蛋白胨蛋白胨 10g牛肉膏牛肉膏 5g琼脂琼脂20.0g四四.大肠杆菌的纯化培养：大肠杆菌的纯化培养：制备牛肉
10、膏蛋白胨固体培养基制备牛肉膏蛋白胨固体培养基1.1.计算：计算：培养基用量培养基用量2.2.称量：称量：3.3.溶化：溶化：牛肉膏黏稠，用称量纸称取牛肉膏黏稠，用称量纸称取牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加盖牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加盖牛肉膏、称量纸牛肉膏、称量纸 、少量水加热溶解、少量水加热溶解 取纸取纸蛋白胨、蛋白胨、NaClNaCl琼脂琼脂 补水定容补水定容4.4.调调pHpH、分装、封口：、分装、封口：5.5.灭菌：灭菌：6.6.倒平板：倒平板：培养基、培养皿培养基、培养皿分散成单个细胞分散成单个细胞,形成单个菌落形成单个菌落7无菌检查：无菌检查：将灭菌的培养基放入将灭菌的培养基放入3
11、7的温室中培养的温室中培养2448小小时，以检查灭菌是否彻底。时，以检查灭菌是否彻底。1.1.培养基灭菌后，需要冷却到培养基灭菌后，需要冷却到50 50 左右时，左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？度？答：答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。以进行倒平板了。2.2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培
12、养基。污染培养基。3.3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？平板冷凝后，为什么要将平板倒置？4.4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？还能用来培养微生物吗？为什么？答：答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基防止皿盖上的水珠落入培养基，造成
13、污染。，造成污染。答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。培养微生物。平板划线法：平板划线法：二二.大肠杆菌的纯化培养：大肠杆菌的纯化培养：制备牛肉膏蛋白胨固体培养基制备牛肉膏蛋白胨固体培养基纯化大肠杆菌：纯化大肠杆菌：1.1.接种：接种：稀释涂布平板法：稀释涂布平板法：2.2.培养：培养：将将接种后接种后的培养基和一个的培养基和一个未接种未接种的培养基的培养基放入放入3737恒温箱中培养恒温箱中培养12h12h24h24h后，后，观察并记录观察并记录形成单个菌落形成单个
14、菌落分散成单个细胞分散成单个细胞,（三）平板划线分离法（三）平板划线分离法主要器具：主要器具：操作过程：操作过程：注意：注意：无菌操作方法：同前。无菌操作方法：同前。将培养皿将培养皿_（盖在下），放于（盖在下），放于_恒温培养恒温培养箱中培养箱中培养_小时。小时。在作第二次以及其后的划线操作时，要从在作第二次以及其后的划线操作时，要从上一次划线的开始上一次划线的开始_划线。划线。接种环、接种环、思考：若如上图所示进行划线分离，则接种环总思考：若如上图所示进行划线分离，则接种环总共进行几次灼烧灭菌？共进行几次灼烧灭菌？恒温培养箱。恒温培养箱。每次划线前接种环都要灼烧灭菌，再冷却。每次划线前接种环
15、都要灼烧灭菌，再冷却。末端末端倒置倒置 1.1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？接种环？操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划
16、线时菌种的数目逐渐减少，以便得到单个菌落。菌种的数目逐渐减少，以便得到单个菌落。2 2、在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？、在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？为什么？划线结束后灼烧接种环，及时杀死接种环上残留的划线结束后灼烧接种环，及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。3.3.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？以免接种环温度太高，杀死菌种。以免接种环温度太高，杀死菌种。4.4.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从在作第二次以及其后的划线操作时，为什么
17、总是从上一次划线的末端开始划线？上一次划线的末端开始划线？划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。殖而来的菌落。5 5、如何判断接种操作是否符合无菌要求？、如何判断接种操作是否符合无菌要求？如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是致，并符合大肠杆菌菌落
18、的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求。接种过程中，无菌操作还未达到要求。（四）（四）稀释涂布平板法稀释涂布平板法主要器具：主要器具：玻璃三角刮刀、移液管或吸管玻璃三角刮刀、移液管或吸管操作过程：操作过程：先将培养菌液先将培养菌液稀释稀释（1010-5-51010-7-7倍）倍）用移液管或吸管取用移液管或吸管取0.1ml0.1ml稀释度不同的菌液，加稀释度不同的菌液，加在平板上，用无菌玻璃三角刮刀均匀涂布在培养在平板上，用无菌玻璃三角刮刀均匀涂布在培养基平面上。基平面上。在适当稀释度下
19、在适当稀释度下，可培养得到相互分，可培养得到相互分开的的菌落。开的的菌落。将培养皿倒置（盖在下），放于将培养皿倒置（盖在下），放于 恒温培养恒温培养箱中培养小时。箱中培养小时。划线分离方法简单；涂布分离，易形成单菌落，划线分离方法简单；涂布分离，易形成单菌落，且可计数，但操作复杂些。且可计数，但操作复杂些。6 6支支试管，分别加入试管，分别加入9ml9ml无菌水无菌水1ml1011ml1021ml1031ml1041ml1051ml106稀释涂布平板法稀释涂布平板法：a.a.梯度稀释菌液梯度稀释菌液：菌液菌液微量微量 移液器移液器稀释涂布平板法稀释涂布平板法：a.a.梯度稀释菌液梯度稀释菌液：
20、b.b.涂布平板涂布平板：不超过不超过0.1ml0.1ml各各梯度分别涂布梯度分别涂布3个平板个平板1 1个个不涂布作空白对照不涂布作空白对照滴滴灼灼试试涂涂稀稀释释10103 3倍倍稀稀释释10104 4倍倍稀稀释释10105 5倍倍10g10g土样土样从土壤中分离微生物从土壤中分离微生物稀释涂布法稀释涂布法三三.菌种的保藏：菌种的保藏：1.1.临时保藏：临时保藏：试管固体斜面培养基上试管固体斜面培养基上442.2.长期保存：长期保存：菌种易被污染、变异菌种易被污染、变异甘油管藏甘油管藏1ml1ml甘油甘油1ml1ml菌液菌液2020思考：菌种保存为何采用斜面而不是平板？思考：菌种保存为何采用斜面而不是平板？试管斜面培养基密闭效果比平面的好很多试管斜面培养基密闭效果比平面的好很多,不容易进入杂不容易进入杂菌，同时能用来做纯细菌的长期保存。菌，同时能用来做纯细菌的长期保存。到目前为止，到目前为止，几十项诺贝尔生理或医学奖，化学奖几十项诺贝尔生理或医学奖，化学奖 都与微生物学有关都与微生物学有关微生物微生物的类群的类群原生生物：原生生物：原核生物原核生物:真菌真菌:病毒病毒如酵母菌如酵母菌单细胞的动植物单细胞的动植物如草履虫、单细如草履虫、单细胞藻类等胞藻类等无无细胞结构：细胞结构：真真核核细细胞胞细菌、蓝藻细菌、蓝藻原核细胞原核细胞有细胞有细胞结构结构