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1、课题课题(kt)3:(kt)3:血红蛋白的提取和血红蛋白的提取和别离别离第一页，共十六页。PCR PCR反响需提供反响需提供(tgng)(tgng)的条件的条件1:1:缓冲液中进行缓冲液中进行2:DNA2:DNA模板模板3:3:分别与两条模板链相结合的两种引物分别与两条模板链相结合的两种引物4:4:四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸5 5：耐热的：耐热的DNADNA聚合酶聚合酶6 6：同时通过控制温度使：同时通过控制温度使DNADNA复制复制(fzh)(fzh)(fzh)(fzh)在体外反在体外反复进行复进行 第二页，共十六页。5 引物引物15 引物引物2第二次复制第二次复制第一次复制第一次复制5
2、5 5 5 5 5 模板模板(mbn)DNA5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循环复制次循环复制(fzh)后，模板后，模板DNA的的含量可以扩大含量可以扩大100万万220倍以上。倍以上。第三页，共十六页。体内体内DNA复制复制(fzh)与与PCR的技术区别：的技术区别：体内复制体内复制PCRPCR技术技术解旋解旋引物引物一般用一般用DNADNA片段片段DNADNA聚合酶聚合酶细胞自身的细胞自身的DNADNA聚合酶聚合酶（不耐高温）（不耐高温）TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶复制特点复制特点半保留复制，边解旋边半保留复制，边解旋边复制，多起点复制。复制，多起点复制。半保留复制，完
3、全解半保留复制，完全解旋后复制，从模板链旋后复制，从模板链的一端开始复制。的一端开始复制。复制的方向复制的方向子链的子链的55端向端向 3 3端延端延伸伸子链的子链的55端向端向 3 3端端延伸延伸在解旋酶作用下，细胞提在解旋酶作用下，细胞提供供(tgng)ATP(tgng)ATP，局部解开，局部解开加热到加热到94oC,双链全部双链全部(qunb)解开，不需解旋酶解开，不需解旋酶一小段一小段RNA第四页，共十六页。血红蛋白血红蛋白(xuhng dnbi)(xuhng dnbi)(xuhng dnbi)(xuhng dnbi)介绍：介绍：血红蛋白是高等生物体内负责运载氧的一种蛋血红蛋白是高等生
4、物体内负责运载氧的一种蛋白质，是使血液呈红色的蛋白。血红蛋白是由白质，是使血液呈红色的蛋白。血红蛋白是由574个个氨基酸脱水缩合而成的含有四条肽链的蛋白质两条氨基酸脱水缩合而成的含有四条肽链的蛋白质两条链和两条链和两条链，每一条链，每一条(y tio)链有一个包含一个铁链有一个包含一个铁原子的环状血红素。氧气结合在铁原子上，被血液原子的环状血红素。氧气结合在铁原子上，被血液运输。因含血红素血红蛋白呈红色。血红蛋白占红细运输。因含血红素血红蛋白呈红色。血红蛋白占红细胞干重胞干重97%、总重的、总重的35%。平均每克血红蛋白可结合。平均每克血红蛋白可结合1.34ml的氧气，是血浆溶氧量的的氧气，是
5、血浆溶氧量的70倍。一个哺乳动倍。一个哺乳动物血红蛋白分子可以结合最多四个氧分子。物血红蛋白分子可以结合最多四个氧分子。血红蛋血红蛋白也参与其他气体的转运：它能携带机体的局部二氧白也参与其他气体的转运：它能携带机体的局部二氧化碳大约化碳大约10%。第五页，共十六页。回忆：蛋白质根本单位回忆：蛋白质根本单位(dnwi)(dnwi)？合成场所？合成场所？蛋白质的分子结构具有多样性的直接原因？根蛋白质的分子结构具有多样性的直接原因？根本原因？蛋白质的功能？本原因？蛋白质的功能？思考：思考：蛋白质的别离和提取的原理蛋白质的别离和提取的原理(yunl)(yunl)是是什么？什么？根据蛋白质各种特性的差异
6、，如分子的形状和根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以的性质和对其他分子的亲和力等等，可以(ky)用来别离不同蛋白质。用来别离不同蛋白质。主要功能主要功能实实例例组组成成细细胞的胞的结结构成分构成分细细胞膜中的蛋白胞膜中的蛋白质质，染色体中的蛋白，染色体中的蛋白质质等等运运输输功能功能细细胞膜上的胞膜上的载载体蛋白、运体蛋白、运输输氧气的血氧气的血红红蛋白等蛋白等催化催化功能功能胃蛋白胃蛋白酶酶、纤维纤维素素酶酶等等调节调节功能功能生生长长激素、胰激素、胰岛岛素等激素素等激素免
7、疫免疫功能功能B B 淋巴淋巴细细胞受到抗原刺激后胞受到抗原刺激后产产生的抗体生的抗体第六页，共十六页。一、根底知识：一、根底知识：凝胶色谱法分配凝胶色谱法分配(fnpi)(fnpi)色色谱法：谱法：1 1、凝胶：、凝胶：一些微小多孔的球体一些微小多孔的球体(qit)内含许多贯穿内含许多贯穿的通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖的通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖 2、概念：根据、概念：根据(gnj)相对分子质量的大小相对分子质量的大小别离蛋白质的方法别离蛋白质的方法第七页，共十六页。3 3、原理：当不同、原理：当不同(b tn)(b tn)的蛋白质通过凝胶时，的蛋白质通过凝胶时，相对相对 的蛋
8、的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程白质容易进入凝胶内部的通道，路程 ，移动速度，移动速度 ，而，而 的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在 移动，路程移动，路程 ，移动速度，移动速度 ，相对分子质量不同，相对分子质量不同(b tn)(b tn)的蛋白质因此的蛋白质因此得以别离。得以别离。相对相对(xingdu)分子质量较小分子质量较小较长较长较慢较慢相对分子相对分子(fnz)质量较大质量较大凝胶外部凝胶外部较短较短较快较快分子筛效应分子筛效应第八页，共十六页。n用凝胶色谱法别离用凝胶色谱法别离(fnl)(fnl)蛋白质时，分蛋白质时，分子量大的蛋白质子量
9、大的蛋白质 ()()nA A路程较长，移动速度较慢路程较长，移动速度较慢 B B路路程较长，移动速度较快程较长，移动速度较快nC C路程较短，移动速度较慢路程较短，移动速度较慢 D D路路程较短，移动速度较快程较短，移动速度较快4 4、具体、具体(jt)(jt)过程过程D第九页，共十六页。第十页，共十六页。n相对分子质量不同相对分子质量不同(b tn)(b tn)的蛋白质在凝胶中的蛋白质在凝胶中的进行过程可表示为图中哪一个的进行过程可表示为图中哪一个B第十一页，共十六页。缓冲溶液缓冲溶液(hun chn rn(hun chn rn y)y)：2 2、作用、作用(zuyng)(zuyng)：能够
10、抵抗能够抵抗 对溶对溶液的液的 的影响，维持的影响，维持PH PH 根本不变。根本不变。外界外界(wiji)的酸或的酸或碱碱PHPH值值1 1、组成：、组成：由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成如如:H2CO3/NaHCO3;CH3COONa/CH3COOH，NaH2PO4/Na2HPO4;KH2PO4/K2HPO4等等3 3、缓冲溶液的配制、缓冲溶液的配制:通常由通常由1-2种缓冲剂溶解于水中配制而成。种缓冲剂溶解于水中配制而成。第十二页，共十六页。电泳电泳(din yn)：1 1、概念、概念(ginin)(ginin)：2 2、原理、原理(yunl)(yunl)：指带电
11、粒子在电场作用下发生迁移的过程。指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，在电场中受到的不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。从而实现样品中各种不同蛋白质分子的别离。和运动速度不同。从而实现样品中各种不同蛋白质分子的别离。第十三页，共十六页。3.3.分类分类(fn li)(fn li)：琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳和和聚丙烯酰胺凝聚丙烯酰胺凝胶电泳。胶电泳。测定测定(cdng)(cdng)通常用通常用
12、 SDS SDS聚丙稀酰胺凝胶电泳聚丙稀酰胺凝胶电泳蛋白质相对分子蛋白质相对分子(fnz)质质量量第十四页，共十六页。使用使用SDS-SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于白质的电泳迁移率完全取决于A A 电荷电荷(dinh)(dinh)的多少的多少 B B 分子的大小分子的大小C C 肽链的多少肽链的多少 D D 分子形状的差异分子形状的差异第十五页，共十六页。内容(nirng)总结课题3:血红蛋白的提取和别离。2530 次循环复制后，模板DNA的含量可以扩大100万220倍以上。子链的5端向 3端延伸。血红蛋白是高等生物体内负责运载氧的一种蛋白质，是使血液(xuy)呈红色的蛋白。平均每克血红蛋白可结合1.34ml的氧气，是血浆溶氧量的70倍。血红蛋白也参与其他气体的转运：它能携带机体的局部二氧化碳大约10%。思考：蛋白质的别离和提取的原理是什么第十六页，共十六页。