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1、Journal of Ocean University Of China ISSN 1672-5182，4卷，第3期，7.30，2005，pp.248-251高效液相色谱检测法对鲤鱼肌肉中甲基睾酮残留物的初步验证摘要：在中国，将合成代谢类固醇甲基睾酮（MT）为生长促进剂是被明文禁止的。食物中对甲基睾酮残留的分析结果表明残留物是不可缺少的。用高效液相色谱法（即三氯甲烷 - 甲醇与液 - 液萃取的方法）检测鲤鱼肌肉组织的初步验证结果参照以下参数：恢复性（准确度）在1,5和10mg/kg之间，组间和组内检测CV值（重复性，也被称为相对标准偏差（RSD）以及检测限制之间。恢复性在80以上，肌肉组织及组
2、间和组内CV值低于10，检测限值为0.05mg/kg。关键字：甲基睾酮、液-液萃取、高效液相色谱法、验证1.前言甲睾酮（MT）是一种合成的促蛋白合成类固醇，且已作为一种促生剂广泛适用于畜牧业和水产养殖。然而，甲基睾酮引起的人类食品安全问题仍然是一个悬而未决的问题。人类长期接触甲睾酮对健康会带来不利的影响，如肝中毒（韦斯特比等人，1977年; 卢西，1987年; 哈特勒布，1990年）和胎儿毒性（格伦巴赫，1960年; 沙尔丁，1980年）。因此，人类摄入有甲基睾酮残留物的鱼类时，会对自身健康带来很大的危害。欧洲共同体的国家使用甲基睾酮（如甾体激素）以达到使牛育肥的目的，而这自1988年以来已被
3、禁止。1999年，我国就已经禁止将甲基睾酮作为生长促进剂。然而，在水产品中并没有对甲基睾酮残留物的分析标准。因此，我们很有必要对这些已经禁令产品的使用做一次筛选分析和调查。为了保证肉类产品的安全，人们已在广泛研究甲基睾酮残留物的检测方法。肉类等合成代谢类固醇的检测比其他常用基体（比如尿液和血浆）更加复杂。ELISA（酶联免疫吸附试验）一般是用作筛查尿液的一个更加快捷的方法（格塔尔，2000）。GC - MS（气相色谱质谱）是一种广泛应用于检测肉类中合成代谢类固醇的多残留的方法（哈特曼和斯坦哈特，1997年; Daeseleire等，1998;马尔尚等，2000;施密特和斯坦哈特，2002年）。
4、但是，GC - MS检测方法需要准备的样品既复杂又耗时，一般只用于类固醇的衍生物。但是在中国，大多数实验室都难以接受该试验设备的高成本购置。这项研究的目的是验证分析技术在实际应用中的鲤鱼肌肉甲基睾酮残渣的检测。用一个简单的液 - 液萃取高效液相色谱法分析方法进行的验证。2. 实验2.1抽样来自青岛市场的鲤鱼肌肉样本被用来验证方法。他们储存在20，并用家用搅拌机（飞利浦，HR2860，Horland）匀浆并马上分析。2.2化学品和试剂分析纯试剂，包括三氯甲烷和氯化钠路堵化学试剂（中国上海），甲醇（HPLC级）Kemiou化学试剂（中国天津）。纯化水与Milli - Q系统（Millipore公司
5、，贝德福德，马萨诸塞，美国）。2.3标准（17 -甲基- 4 -雄酮，17-醇- 3 -）与97以上的纯度标准的类固醇甲基WAKO（日本），该公司股价在20gmL- 1在甲醇溶液，在准备和储存-20 C的工作方案0.1gML - 1，0.5gML - 1，1gML - 1，3gML - 1，5gml - 1和10gML - 1，使用前准备，可以保持在4 C为一个月。2.4提取在10克肌肉里加3mL饱和NaCl溶液和9 mL甲醇匀浆2分钟，后加入10毫升三氯甲烷匀浆2分钟. 混合搅拌15分钟，加10毫升三氯甲烷，持续搅拌15分钟，离心10分钟，5000转，将上清液转移到一个分区漏斗.残留物中加1
6、0mL饱和NaCl溶液和10 mL甲醇。重复提取。合并提取液漏斗（至少8小时）在夜间在同一个分区漏斗。在圆底烧瓶中收集下层溶液并在50 C真空蒸发器中蒸发至干。残留物溶解在2毫升流动相和20L每个样品注入到高效液相色谱系统。2.5 甲睾酮高效液相色谱检测方法色谱系统包括所有从安捷伦以下组件（安捷伦，HP1100型，美国）：C18 反相色谱柱(4.6mm250 mm,柱填料粒径5m），泵系列系统，G1314AVWD探测器覆盖范围为190 - 600 nm的调整，以254 nm和20L循环喷油。柱温为30 C.流动相为甲醇（70）/水（30）。流速为0.8 mL min - 1的。进样量为20L。
7、2.6验证确定恢复参数的检测方法的准确性。用甲基睾酮标准溶液回收率实验确保在10.00g鲤鱼肉里分别1 mg kg-1,5 mg kg-1 和10 mg kg-1。同时，制备空白样品。之间的运行和内部运行CV值的重复性参数精密的检测方法是确定的。三种鱼肉样品进行分析时确保每个设防水平之间的运行CV值在 1 mg kg-1, 5 mg kg-1 和 10 mg kg-1。三个平行的肌肉样品都注射5 mg kg-1来确定运行的CV值。设防水平与肌肉样本的检出限分别为0.05 mg KG - 1。3. 结果与讨论3.1甲基睾酮标准线性如图1所示，甲基睾酮的标准曲线的线性范围0.1-10g mL-1。
8、在此范围的甲基睾酮标准浓度与锋面积有密切的线性相关。图1 甲基睾酮浓度为0.1-10g mL-1的标准曲线3.2甲睾酮高效液相色谱检测方法的准确性确定恢复参数的检测方法的准确性。如表1所示，高效液相色谱法检测甲基睾酮肌肉确定的水平和回收率在1 mg kg-1,5 mg kg-1 和10 mg kg-1。三个层次的回收率达到80以上，这是符合回收标准的70-110为接受的分析方法进行验证时所允许考虑的兽药（改编自AOAC提出标准（官方农业化学家协会）/FAO（粮食及农业组织）/IAEA（国际原子能机构）/IUPAC（国际纯粹与应用化学联盟）1999年在匈牙利举行的专家磋商）。设防水平在1 mg
9、kg-1,5 mg kg-1、各级标准、空白及样品的高翔液相色谱图如图2所示。甲睾酮的保留时间约为18.2分钟，空白样品进行了评价的干扰。可以得出结论，正确的保留时间出现在没有杂质的任何情况。图2 A 高效液相色谱图甲基睾酮浓度为1 mg kg-1的标准曲线；B 高效液相色谱图加标甲基睾酮浓度为0；C高效液相色谱图 样品中甲基睾酮加标1 mg kg-1；D 高效液相色谱图 样品中甲基睾酮加标5 mg kg-1（纵坐标：吸光度，m AU；横坐标：保留时间，min）。表1确定的数量和检测MT在肌肉回收率设防水平1 mg kg-1,5 mg kg-1 和10 mg kg-1。3.3甲睾酮高效液相色谱
10、检测方法的精确性鲤鱼肌肉中的甲睾酮残留的高效液相色谱检测方法的精度，重复性，如之间的运行参数和运行内CV值确定.表2中显示之间运行的CV值和三个强化各级水平的确定。内运行的CV值和确定的设防水平在5 mg kg-1的水平列于表3。之间的运行和内部运行CV值均低于10，14给予验收的兽药残留分析方法的验证与可重复性标准（改编自1999年在匈牙利举行的AOAC /粮农组织/国际原子能机构/ IUPAC专家咨询建议的标准）。表2 确定的水平和间运行的简历肌肉中的甲睾酮检测值在1 mg kg-1,5 mg kg-1 和10 mg kg-1的设防水平表3确定的水平和检测MT在肌肉内运行的CV值在设防水平
11、5 mg kg-13.4甲基睾酮高效液相法的检测限检出限为样品中的物质含量最低值。一种物质的存在，仍然可能被定性检测，但不具有足够的可靠性程度的定量测定。检出限为视为一个信号程度的噪声以3比1的比例。因此，检测限为证实为0.05mg kg-1（S / N = 3或更高）。4. 结论高效液相色谱法检测鲤鱼肌肉中的甲醇提取的甲睾酮的初步验证参考以下参数：在1 mg kg-1,5 mg kg-1 和10 mg kg-1水平之间运行，内CV值（重复性）和限制detection.The回收率（准确度）恢复80以上和之间的运行和内部运行CV值低于10。检测限为0.05mg kg-1。有剩余的一些问题要解决
12、，特别是进一步净化排除大量的提取物中的不同酯，使检测限可能会下降到可接受的水平。致谢作者非常感谢来自财政支持的农业标准的制定，“在渔业产品中甲基睾酮残留的测定高效液相色谱法”，中国农业部项目。参考文献1Daeseleire ,E.,R.Vandeputte,and V.C.Peteghem,1998. Validation of multi-residue methods for the detection of anabolic steroids by GC-MS in muscle tissues and urine samples from cattle.Analyst,123:2 59
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