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1、华中科技大学硕士学位论文纳米TiO2和重金属铅对环境微生物E.coli联合毒性作用的评价研究姓名：范传刚申请学位级别：硕士专业：劳动卫生与环境卫生指导教师：周宜开2011-01 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 2纳米纳米TiO2和重金属铅对环境微生物和重金属铅对环境微生物E.coli联合毒性作用的评价研究联合毒性作用的评价研究 硕士研究生：范传刚硕士研究生：范传刚 导导 师：周宜开师：周宜开 教授教授 摘摘 要要 研究背景：研究背景：随着纳米科技的发展，纳米TiO2在越来越多的领域得到应用，如医药卫生、涂料、废水处理等。纳米TiO
2、2的大量生产和废弃也随之而来：除了自然过程产生的纳米TiO2释放到环境中外，用于涂料合成的纳米TiO2在使用后也可以释放到环境中，进而造成污染。因此纳米TiO2的安全和污染问题越来越引起人们的重视。同时我们知道铅是已知危害最大的环境重金属污染物之一，美国政府和工业卫生委员会（ACGIH）将铅列为动物致癌物。我国环保总局数据表明：我国近海三分之二的海域铅超过国家标准，大约五分之一的耕地受到铅化合物污染。在废水处理、废物堆砌等过程中，纳米TiO2将于与铅化合物充分接触，可能出现潜在相互作用，并对周围环境生物产生尚未得知的负面影响。研究目的：研究目的：、探讨纳米TiO2与PbAc（醋酸铅）之间理化性
3、质的相互影响；、探讨 OD600(600nm 处吸光度值)与大肠杆菌浓度之间的数学模型关系；、探讨纳米TiO2与PbAc对大肠杆菌生长状况的联合作用；、探讨纳米TiO2与PbAc对大肠杆菌抗氧化酶、蛋白质和遗传物质的潜在联合影响。研究方法：研究方法：采用扫描隧道电子显微镜技术（SEM）和动态光散射技术（DLS）观察PbAc对纳米TiO2的粒径及颗粒表面性状的影响；采用火焰原子吸收技术研究在水溶液中纳米TiO2对PbAc的物理吸附作用；采用平板计数法和分光光度计技术探讨OD600 与大肠杆菌浓度的数学关系并建立数学模型；采用 44 完全析因设计探讨纳米TiO2与PbAc对大肠 华 中 科 技 大
4、 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 3杆菌生长、抗氧化酶类、蛋白质、遗传物质DNA的潜在联合毒性作用；采用响应面分析方法统计分析纳米TiO2与PbAc之间的相互作用。研究结果：研究结果：SEM结果显示与单一纳米TiO2比较，添加PbAc能够诱导纳米TiO2发生聚集，改变颗粒的表面性质；DLS统计分析结果显示纳米TiO2浓度的减少或者添加PbAc会显著加剧纳米TiO2的聚集，增加其粒径大小，并且随着PbAc浓度的升高，纳米TiO2粒径随之增大（P0.05）；火焰原子吸收结果显示纳米TiO2对PbAc有物理吸附作用，并且随着纳米TiO2浓度的增加，吸附率显
5、著升高（P0.05）；OD600 与大肠杆菌浓度的关系不是直线关系，而是曲线关系并据此拟合出数学模型，并且检验结果显示模型准确性更高，与平板计数法相比误差小于 3%，可以用于下一步实验；24 小时生长曲线结果显示纳米TiO2和PbAc对大肠杆菌生长均有抑制作用，且二者混合物抑制作用最严重；析因分析结果显示纳米TiO2和PbAc对大肠杆菌的生长、抗氧化酶类、蛋白质羰基化水平、DNA氧化水平均有显著毒性作用，而在低浓度二者混合物中，其联合毒性作用与相应单一物质作用比较结果不显著。响应面分析结果显示纳米TiO2和PbAc二者之间存在显著拮抗作用。研究结论：研究结论：纳米TiO2与PbAc之间存在显著
6、相互作用：纳米TiO2吸附PbAc，减少其有效浓度；PbAc诱导纳米TiO2聚集，影响其粒径大小及表面性质。纳米TiO2与PbAc对大肠杆菌生长、抗氧化酶类、蛋白质、DNA均有毒性作用，而二者的联合作用低于二者毒性的相加作用，交互作用证实为拮抗作用。首次研究发现OD600 与大肠杆菌浓度之间数学关系为曲线关系并建立数学模型应用于大肠杆菌计数。关键词：关键词：纳米二氧化钛；铅；大肠杆菌；联合作用；毒性作用；氧化损伤 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 4Abstract Background:With the development o
7、f nanotechnology,nano-TiO2 is applied in more and more fields,such as cosmetics,painting,and wastewater treatment.At the same time,masses of production and abandonment of nano-TiO2 have followed up:not only the natural processes of nano TiO2 is released into environment,but the manufactured nano-TiO
8、2 used in painting for about 10 years can also be released into environment,causing pollution.Safety and pollution of Nano TiO2 have attracted more and more attentions.As we know,lead is one of the most important heavy metal pollutants and the American Conference of Governmental Industrial Hygienist
9、s(ACGIH)categorizes lead as one of animal carcinogenic materials.State Environmental Protection Administration of China(SEPA)has reported that:the dose of lead in two thirds of Chinas coastal waters is excessive and about one fifth of the land in our country is contaminated by lead.During the proces
10、s of wastewater treatments,waste abandonment and others,nano-TiO2 contacts with lead compounds and may influence each other.The interaction and combined effects of them to surrounding environment livings have not been known until now.Objective:Investigating the interaction between nano-TiO2 and PbAc
11、(lead acetate);Investigating the relationship between OD600(600nm absorbance value)and E.coli concentrations;Investigating the combined effects of nano-TiO2 and PbAc on growth of E.coli;Investigating the combined effects of nano-TiO2 and PbAc on E.coli antioxidant enzymes,proteins,and DNA.Methods:By
12、 scanning electron microscopy and dynamic light scattering technique TiO2 nano particle size and particle surface properties are characterized;by flame atomic absorption method,nano TiO2 adsorptions of PbAc are investigated;by plate count and spectrophotometer method,the mathematical relationship be
13、tween the concentration of E.coli 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 5and OD600 is studied.The combined toxic effects of nano-TiO2 and PbAc on E.coli growth,antioxidant enzymes,proteins,genetic material DNA are explored in 4 4 full factorial design,and their interactions are identified
14、using response surface analysis.Results:SEM results show that compared with single nano TiO2,adding PbAc induces the aggregation and surface property changes of TiO2 nanoparticles.DLS results show that nano-TiO2 particle size is significantly increased with decreased concentration of nano-TiO2 or co
15、mbined with an increasing dose of PbAc(P 0.05).Flame atomic absorption results show that nano-TiO2 adsorbs Pb2+iron,and its adsorption rates are significantly increased with increasing concentration of nano-TiO2(P 7的稳定条件下，添加Na2CO3可以促进纳米TiO2发生聚集，特别是在TiO2浓度很低时，添加Na2CO3的浓度越高，TiO2的聚集效果越明显。纳米材料的毒性作用与它们的粒
16、径大小有关，粒径越小，纳米粒子效应越强，毒性越大，这一现象近年来已经被科学研究证实,3 22 23。研究发现在水溶液中，纳米物质的毒性作用在一定程度上依赖于其粒径大小和表面化学性质,24 25。同时，纳米材料具有很强的吸附性能，在水溶液中能够吸附金属离子：Chen，Ma等人研究发现在水溶液中纳米羟磷灰石能够吸附镉、铅、铜离子26。在水溶液中纳米颗粒物吸附金属离子，对颗粒物本身聚集性、表面性质及对金属离子的有效浓度会产生潜在作用，进而影响它们对周围环境生物的毒性作用。本实验主要研究纳米TiO2与PbAc之间的相互作用，采用：、扫描电子显微镜（SEM，scanning electron micro
17、scope）技术观察PbAc对纳米TiO2表面的影响：首先分别检测单独100g/ml 纳米TiO2和100g/ml 纳米TiO2与1000g/ml PbAc混合物来探究PbAc对纳米TiO2的影响，其次检测100g/ml 纳米TiO2与1000g/ml 醋酸（HAc）混合物和100g/ml TiO2与1000g/ml硝酸铅（Pb(NO3)2）混合物来探究主要是哪种物质对纳米TiO2产生作用；华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 10、动态光散射技术（DLS，dynamic light scattering）测量在有（无）PbAc作用下的
18、纳米TiO2粒径大小24。储备液用超纯水配制成12组浓度：纳米TiO2(1,10,100 g/ml)分别联合PbAc(0,40,200,1000 g/ml)，每个浓度有三个重复，结果取平均值，同时超纯水和PbAc溶液经DLS技术方法测定为不含颗粒物质。、用火焰原子吸收光谱技术测定纳米二氧化钛对PbAc的吸附作用：用去离子水配制含有和对照不含1g/ml 纳米TiO2的40g/ml、200g/ml、1000g/ml 6组PbAc溶液，每组3个重复样品；同时配置含有40g/ml PbAc的1g/ml、10g/ml、100g/ml 3组纳米TiO2溶液，测定方法选用火焰原子吸收方法。结果计算：吸附率=
19、（对照组-测定组）/对照组。1 实验材料与方法 1.1 实验材料 纳米TiO2(德固赛P25)购买自德国德固赛公司，粒径为25nm，表面积为50m2/g,锐钛矿与金红石矿之比为8:2，是被广泛使用的商品化纳米TiO2产品。PbAc购买于美国Sigma公司，为分析纯，使用四蒸纯水配制试剂。1.2 实验仪器 微量加样枪(Eppendorf Research公司，德国)，DelsaTM Nano C粒度分析仪（Beckman公司，英国.)，SpectrAA-240FS原子吸收光谱仪(Varian公司，美国)，Quanta 200扫描电子显微镜（FEI公司，荷兰），THZ100恒温摇床（一恒科技有限公
20、司，中国），超声机（KQ-500DE超声清洗仪，昆山市超声仪器有限公司，中国），纯水仪(SGwater公司，德国)。华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 111.3 实验方法 1.3.1 扫描电镜 、纳米TiO2储备液超声30min以充分分散纳米TiO2粒子27，配置100g/ml 纳米TiO2，100g/ml 纳米TiO2与1000g/ml PbAc混合物，100g/ml 纳米TiO2与1000g/ml 醋酸（HAc）混合物，100g/ml TiO2与1000g/ml硝酸铅混合物。、37C、150rpm（转每分钟）混匀以上样品24h（
21、小时）。、24h后，混匀样品取样品固定在玻片上备用。、在10kV电压下使用日立X-650扫描显微镜进行检测。1.3.2 纳米粒度仪 、纳米TiO2储备液超声30min，配置12组混合物，具体浓度如下：浓度（concentration）组号 PbAc(g/ml)纳米TiO2(g/ml)1 40 0 2 40 1 3 40 10 4 40 100 5 200 0 6 200 1 7 200 10 8 200 100 9 1000 0 10 1000 1 11 1000 10 12 1000 100 、37C、150转每分钟（rpm）混匀以上样品24小时（h）。、DelsaTM Nano C粒度分析
22、仪提前开机预热30min，检测以上培养24h的样品29,30。华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 121.3.3 火焰原子吸收、纳米TiO2储备液超声30min，配置浓度如下：浓度（concentration）实验号 PbAc(g/ml)纳米TiO2(g/ml)1 40 1 2 200 1 3 1000 1 4 40 0 5 200 0 6 1000 0 7 40 1 8 40 10 9 40 100、37C、150转每分钟混匀以上样品24小时（h）。、24h后混匀各样品，取10ml样品3000g/min离心10分钟，以充分沉降 纳米
23、TiO2颗粒。、取离心上清液进行Pb含量测定，采用火焰原子吸收法。1.4 统计分析 各浓度样品均设置3个重复，实验结果数据均以xS表示。应用Spss16.0统计软件进行统计分析对吸附测定结果进行均数t检验，对粒径测定结果进行多因素方差分析（ANNOV）。当P0.05时认为差异有统计学意义。2 结 果 2.1 PbAc对纳米TiO2表面性状和粒径大小的影响 2.1.1 对纳米TiO2表面性状的影响 扫描电子显微镜（SEM）结果显示这四种浓度的纳米TiO2都有不同程度的聚集(图 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 131)。其中，单一纳米
24、TiO2发生自我聚集，颗粒形状不规则，较大的聚集体大小在200nm（纳米）左右(图1 A)；添加了PbAc后,纳米TiO2更易于发生聚集，聚集物成规则的圆球形状，其粒径大小在300nm左右(图1 B)，同时图片结果显示在这种球形的聚集物表面粘附了一些较小的纳米TiO2颗粒(图1 B1)。进一步探究结果显示：加入等量的Pb离子（Pb(NO3)2）后，纳米TiO2 颗粒同样发生了聚集，但是聚集方式与单一纳米TiO2相似纳米TiO2自我聚集，形状不规则，但颗粒大小变大（较大颗粒物的粒径为350nm），同时除了纳米TiO2聚集物，球形结晶体也被发现，大小在400nm左右，可能是在样品固定处理的时候形成
25、的Pb(NO3)2结晶体(图1 C)；当添加了HAc后，颗粒聚集的最厉害，纳米TiO2与HAc相互粘连，没有发现规则的形状，较大聚集物颗粒的粒径在1000nm左右(图1 D)。华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 14图1 SEM images of 纳米TiO2,纳米TiO2 with PbAc,Pb(NO3)2,HAc.A:100g/ml Nano-TiO2 B:100g/ml Nano-TiO2 with 1000g/ml PbAc B1:100g/ml Nano-TiO2 with 1000g/ml PbAc C:100g/ml
26、 Nano-TiO2 with 1000g/ml Pb(NO3)2C:100g/ml Nano-TiO2 with 1000g/ml HAc 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 152.1.2 PbAc对纳米TiO2粒径大小的影响 Delsa纳米粒度仪测定结果显示：聚集最为严重，颗粒粒径最大的样品是1g/ml 纳米TiO2与1000g/ml PbAc的混合物，粒径最小的是100g/ml 纳米TiO2的样品（表1）。与100g/ml 纳米TiO2相比，除了10g/ml纳米TiO2，100g/ml纳米TiO2与Pb40混合物暴露的样品外，
27、其他浓度样品的粒径都显著性增大（P0.05）。当PbAc浓度一定时，纳米TiO2颗粒的粒径大小随着其浓度的增加而显著减小；当纳米TiO2浓度一定时，纳米TiO2颗粒的粒径大小随着PbAc浓度的增加而显著增大（P0.05）。表1.PbAc 对纳米TiO2粒径大小的影响 纳米纳米TiO2浓度浓度(g/ml)PbAc 浓度浓度(g/ml)1 10 100 0 256.112.4a205.59.5 191.17.9 40 430.625.2 a，b206.48.7 a199.64.24 200 902.490.7 a,b305.712.5a,b227.73.1a,b1000 1611.8111 a,b
28、527.769.8 a,b309.26.9a,ba,P0.05，与NT100 比较 b,P0.05，与相应浓度纳米TiO2比较 2.1.3 纳米TiO2对PbAc的吸附作用 吸附实验结果显示纳米TiO2颗粒能够吸附Pb离子，进而减少了Pb离子在水溶液中的有效浓度(图2)。在9组不同浓度的混合物中，100g/ml纳米TiO2与40g/ml PbAc样品中的吸附率是最高的，为0.26；吸附率最低的样品是最低浓度纳米TiO2（1g/ml）与最高浓度PbAc（1000g/ml）的联合组样品。虽然当PbAc浓度一定时，吸附率随纳米TiO2浓度的升高而显著升高（P0.05）；当纳米TiO2 浓度一定时，吸
29、附率随PbAc浓度的升高而显著降低。但是每克纳米TiO2吸附的PbAc量却随着PbAc浓度的升高而升高。华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 16图2.纳米TiO2对PbAc的吸附作用 00.050.10.150.20.250.3110100Nano TiO2 concentration(g/ml)Adsorptionpercent40g/ml PbAc200g/ml PbAc1000g/ml PbAc 3 讨 论 随着纳米TiO2和铅的不断使用，例如用于化妆品、涂料、衣饰品、污水处理等,大量的纳米TiO2和铅可能释放到环境中，对环境中
30、的生物和人体健康将产生严重威胁。纳米颗粒的大小和形状已经被证实对它们的毒性作用有重要作用,25 28。并且有研究报道：环境中的有机物对纳米颗粒物的稳定性有显著影响27。在本实验中，纳米TiO2和纳米TiO2与PbAc混合物都发生了聚集，但是后者的聚集更严重，聚集的较大颗粒物的粒径大小从单一纳米TiO2的200nm增加到300nm左右，同时形状也由无规则形变为规则的球形聚集物，在聚集物的表面更是有小颗粒纳米TiO2粘附。这表明在加入PbAc之后，纳米TiO2更易于发生聚集，形成大颗粒的聚集物，同时颗粒的表面性质也发生了改变。同时球形聚集物的出现提示可能因为某种物质或离子参与了聚集，而使得纳米Ti
31、O2的聚集物形态发生改变。从纳米TiO2与Pb(NO3)2混合物和纳米TiO2与HAc混合物的扫描电镜图中可以清晰地看到与不添加相比，添加Pb(NO3)2 或者HAc都使纳米TiO2发生了严重的聚集，并且形状和聚集物形状都有变化。当加入Pb(NO3)2时，纳米TiO2倾向于自身聚集形成不规则聚集物，与单一纳米TiO2组聚集物类似，但同时类似于纳米TiO2与PbAc联合组的圆形颗粒物也被发现，推测为某种物质的固体结晶；当加入HAc的时候，纳米TiO2发生更为严重的聚集反应，与HAc粘连在一起，聚集更为严重。并且纳米TiO2与HAc粘连类似于纳米TiO2与PbAc联合组中圆形聚集物对纳米TiO2的
32、粘连，推测可能是醋酸根离子 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 17在发生作用。所以综上所述，在水溶液中添加PbAc能够刺激纳米TiO2发生聚集，并且推测纳米TiO2能够吸附Pb粒子并与醋酸根离子相互粘连形成圆球形的聚集物。除了表征纳米TiO2的形状外，其颗粒物在有无PbAc情况下的粒径大小也用动态光散射技术进行了测量，后者被广泛应用于纳米颗粒物粒径大小的测量29。结果显示添加PbAc与否，纳米TiO2的粒径大小都随着其浓度的增长（从1 到 100 g/ml）而显著降低（P0.05）。提示纳米TiO2自身浓度的升高可以有效抵制外界条件
33、对颗粒自身外层双电子层的破坏，进而抑制聚集的发生。当添加PbAc的时候，纳米TiO2的粒径随着PbAc浓度的升高而显著增加，表明Pb2+、Ac-离子的加入破坏了纳米TiO2颗粒物外层的双电子层,影响了纳米TiO2的自身稳定性，诱导纳米TiO2发生聚集反应。水溶液中纳米粒子表面因自身所带电荷而与周围水分子形成离子双电层，因此在不受干扰情况下带有相同电荷的纳米颗粒物在相互接近时发生电荷互斥作用而防止聚集的发生，但是当有外界物质加入及其他干扰的时候，这一状态将发生改变20。当1g/ml 纳米TiO2添加1000 g/ml PbAc时，聚集颗粒物的粒径最大的超过1000nm，已经超出了纳米范畴。综上，
34、结果显示PbAc能够诱导纳米TiO2发生聚集，并且聚集程度随着PbAc浓度的提高而加重。这与SEM的实验结果是一致，表明PbAc对纳米TiO2粒径的大小有显著影响，同时与先前的研究结果也是一致的30。纳米颗粒物因为其粒径小，比表面积大而具较高的化学能，对溶液中的其他物质有很强的吸附性能。Chen等研究发现纳米羟基磷灰石比普通羟基磷灰石有更好的吸附性能，并且在Cd2+,Pb2+,Cu2+几种离子中，对Pb2+离子的吸附率最高26。纳米颗粒物不仅对金属离子有吸附作用，对有机物也有很强的吸附性：Wang等研究发现与普通Cu颗粒相比，纳米Cu颗粒对乙酰胆碱酯酶有更高的吸附率；除了纳米Cu颗粒外，纳米S
35、iO2,TiO2,Al2O3,Al等7种颗粒物对乙酰胆碱酯酶都有较高的吸附性能31。本研究中，通过实验证明，纳米TiO2对Pb2+具有吸附作用，这与SEM实验结果是一致的。并且随着纳米TiO2浓度的升高，吸附率随之升高；而随着PbAc浓度的升高，吸附率反而降低。主要原因是单位纳米TiO2吸附量的升高速率小于PbAc浓度的增加速率。华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 184 小小 结结 纳米颗粒物的毒性作用大小在一定程度上依赖于其自身颗粒大小和其表面性质28。本研究结果显示：在纳米TiO2与PbAc的混合溶液中，PbAc诱导并参与纳米T
36、iO2聚集，增大了纳米TiO2聚集物的粒径大小和其表面性质；并且随着PbAc浓度的增大，这种聚集现象也越来越严重。除了PbAc影响纳米TiO2的稳定性意外，纳米TiO2颗粒同时能够吸附Pb2+离子，减小了溶液中Pb2+离子的有效浓度，并且随着纳米TiO2浓度的升高，吸附率也显著增大。总之，在水溶液中，纳米TiO2与PbAc之间的相互作用在一定程度上改变了自身的物理、化学性质，将影响它们对环境生物的毒性作用。华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 19第二部分第二部分 纳米纳米TiO2与与PbAc对大肠杆菌生长的联合作用对大肠杆菌生长的联合
37、作用 近年来纳米TiO2在越来越多的领域得到应用，关于其对健康的影响越来越引起人们的关注,3 32。最近的研究结果显示：纳米TiO2能够对环境生物和人体造成多种损伤，如：纳米TiO2对水生生物大型蚤（Daphnia magna）具有很明显的慢性毒性作用，造成大型蚤生长严重迟缓、死亡和繁殖功能障碍等33。纳米TiO2对斑马鱼具有发育毒性作用，导致斑马鱼胚胎脊索发育不全并损伤幼仔表皮34。纳米TiO2经呼吸道暴露能够引起小鼠和大鼠的肺部炎症反应，经食道暴露能够在小鼠的脾、肝、肺、肾器官中蓄积，引起脾脏损伤，肺维管系统中血栓形成，肝细胞坏死、凋亡和纤维化的发生，肾小球的肿胀等35。在体外试验中，纳米
38、TiO2能够损伤人体纤维细胞功能，降低细胞表面积、增殖能力、活动能力和产生胶原蛋白的能力。单个纳米颗粒物可以穿透细胞膜进入细胞内，产生蓄积，大颗粒物也可以通过胞吞作用进入细胞内，产生损伤作用36。但是近年来研究报道证明：环境中某种物质产生的生物损伤作用不仅仅与自身理化性质有关，还与环境中接触的其他物质及可能产生的相互作用有关，环境污染物表现出来的毒性作用往往是环境中混合物共同作用的结果,2 17 37。纳米TiO2因为其自身特性如粒径小，比表面积大等更容易与环境中其他物质产生吸附作用，并可能影响自身性质，同时在环境中纳米TiO2能够与多种物质相互影响，相互吸附，有不同的毒性作用。为了准确评价纳
39、米TiO2在环境中的毒副作用，需要综合考虑纳米TiO2与环境中的其他物质，特别是其他污染物的相互影响和相互作用，以及对目标物的联合作用。然而虽然目前关于纳米TiO2对环境、环境生物和人体健康安全性评价的研究报道层出不穷，但是对纳米TiO2与环境中其他污染物的相互作用及其对环境生物体联合作用的研究很少有报道。铅是应用最广、危害最为严重的重金属之一。铅拥有悠久的使用历史，被使用了5000多年，美国工业卫生委员会（ACGIH）把铅列为动物致癌物之一38。铅长期的开采和广泛使用造成大量的铅释放到环境中，从19世纪50年代到80年代，墨西哥生产了170000吨的铅，并且检测结果显示铅在河水中的浓度为3到
40、30mg/L，在湖水中的浓度为1 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 20到50 mg/L17。实验研究证明：铅对胎儿和儿童具有显著的毒性作用，铅可以透过胎盘屏障从母亲血液中转移到胎儿体内并可以蓄积下来，蓄积的铅对对胎儿具有毒性作用，可以造成胎儿发育迟缓、尤其是智力发育，更严重可以造成胎儿死亡、流产等39。当铅的浓度水平达到0.483mol/L时可以影响儿童的生长发育40，长期接触铅可引起儿童行为功能改变，如：模拟学习困难、注意力不集中、运动失调、智力下降等41。铅对成人亦有毒性作用，长期接触铅可以引起成人呼吸、消化、免疫、泌尿、生殖
41、等系统的损伤42。目前关于在水环境中纳米TiO2与环境重金属污染物铅的相互作用及其对环境微生物联合影响的研究结果尚未见有文献报道。基于弥补在这方面的研究缺陷，我们开展了本项研究。本研究以纳米TiO2和重金属污染物PbAc为毒物，研究它们对环境中常见菌种-大肠杆菌的毒性作用，主要通过研究纳米TiO2和重金属铅对大肠杆菌的生长影响如对细菌生长曲线及不同时间段细菌生长生长数目的影响来探究纳米TiO2和PbAc单独对大肠杆菌的毒性作用及二者的联合毒性作用，分析鉴别二者之间的交互作用。同时先前研究多采用600nm处细菌菌液的吸光度值（OD600）来代表细菌的浓度43，然而本课题初步研究发现这种方法不合适
42、，不能准确表示细菌菌液的浓度，在本课题中将进一步探讨OD600与大肠杆菌悬液中细菌浓度的关系，寻找一种更为合适的方法。1 材料与方法材料与方法 1.1 实验生物 大肠杆菌（ATCC 8099）（湖北省疾病预防控制中心提供，在本科室-80冷冻保存）使用前取出菌种快速升温复苏，并接种到LB液体培养基中150rpm、37培养8小时，使细菌恢复活性并处于对数生长期，备用。1.2 试剂 蛋白胨（Oxoid公司,英国）华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 21 酵母提取物（Oxoid公司,英国）琼脂糖(Gene Tech公司，上海)NaCl（天津化
43、学试剂三厂，分析纯，中国）1.3 仪器 电子天平（BS223S，Sartorius，德国）酸度计（Sartorius，德国）全自动高压消毒锅（Hirayama，日本）台式离心机（Eppendorf Research，德国）生化培养箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂，中国）Spectrumlab 22pc型分光光度计（上海棱光技术有限公司，中国）THZ100恒温摇床（一恒科技有限公司，中国），KQ-500DE超声清洗仪（昆山市超声仪器有限公司，中国），纯水仪(SGwater公司，德国)。1.4 实验方法 1.4.1 大肠杆菌的复苏、培养 配制LB培养基1000ml，122高压灭菌30分钟，备用。
44、将冻存在-80的大肠杆菌菌种取出快速放入37温水中升温。立即取升温融化的菌液1ml，接种到50ml新鲜LB培养基中，150rpm、37恒温培养8h恢复细菌活性。以下实验细菌培养接种皆取自恢复活性的细菌。1.4.2 大肠杆菌培养及建立 OD600 与细菌生长数目的关系 配制LB培养基1000ml，122高压灭菌30分钟，备用。华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 22 配制固体LB培养基3000ml（1.5%的琼脂糖LB培养基），122高压灭菌30分钟，保温至80备用。取恢复活性的大肠杆菌菌液(OD600约为1.4)1ml接种到50ml
45、LB培养基中，37、150rpm培养24h。培养24h后，混匀菌液，取15ml菌液，用同批次LB培养基稀释，稀释倍数为原菌液的1、0.875、0.75、0.625、0.5、0.375、0.25、0.125、0.1、0.075、0.05、0.025、0.005、0倍，各稀释液6ml，备用。提前将分光光度计开机预热半个小时，结束后测定各稀释样品的600nm吸光值（OD600）。同时取出保温琼脂糖LB培养基，每个平板15ml，铺设固体LB培养基 冷却。用平板计数法计算各浓度悬液中细菌的生长数目。记录结果，建立OD600与细菌浓度（个/ml）的关系式。取不同浓度的未知细菌悬液样本，分别测定OD600，
46、用建立的关系式计算细菌生长数目（每毫升），同时用平板计数法测得悬液中的生长数目（每毫升），比较二者结果，检测建立的关系式的准确度。重复以上操作3次。1.4.3 纳米纳米TiO2与与PbAc对大肠杆菌生长的影响对大肠杆菌生长的影响 1.4.3.1 生长曲线抑制 提前半小时超声纳米TiO2的储备液，分散聚集的纳米TiO2粒子。配制1000ml LB培养基，高压灭菌备用。配制分别含10 g/ml 纳米TiO2、1000g/ml PbAc、10 g/ml 纳米TiO2与1000g/ml PbAc的LB培养基。往150ml的锥形瓶（已高压灭菌）中分别加入50ml配制好的含TiO2或（和）PbAc的LB培
47、养基，设置对照组（不含TiO2或PbAc），每个浓度均重复3瓶，结果取均值。取恢复活性的大肠杆菌菌液，接种到锥形瓶中，每瓶接种1ml。华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 23 在恒温摇床上以150 rpm，37培养24小时。在以下时间点：0，1.5，3，4，6，8，10，12，14，16，18，20，24 h 分别取2 ml菌液测定吸光度值OD600。用测得的OD600值，通过上述建立的OD600与悬液中大肠杆菌生长数目的关系式，计算各时间点各浓度样本中细菌每毫升的生长数目。根据计算得到的结果，绘制各浓度和对照组的生长曲线。1.4.3
48、.2 对数生长期（8h）及平台期（24h）纳米TiO2与PbAc对大肠杆菌抑制的定量分析 提前超声纳米TiO2的储备液，充分分散纳米TiO2粒子。配制4000ml LB培养基。配制浓度如下的LB培养基：浓度（concentration）实验号 PbAc(g/ml)纳米TiO2(g/ml)1 0 0 2 0 1 3 0 10 4 0 100 5 40 0 6 40 1 7 40 10 8 40 100 9 200 0 10 200 1 11 200 10 12 200 100 13 1000 0 14 1000 1 15 1000 10 16 1000 100 往100ml的锥形瓶中分别加入50
49、ml上述配制好LB培养基，每个浓度重复3瓶，结果取均值，高压灭菌备用。取恢复活性的大肠杆菌菌液，接种到上述装有LB培养基已灭菌的锥形瓶中，每 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 24瓶接种1ml。封口放置在恒温摇床上，150rpm、37培养24h，备用。在对数生长期8h和平台期24h分别取各浓度菌液2ml测定吸光度值OD600，用同批次无菌LB培养液做对照。记录测定结果，并统计分析备用。1.5 统计分析 各浓度样品均设置3个重复，实验结果数据均以xS表示。应用Spss16.0统计软件进行统计分析。纳米TiO2和PbAc对大肠杆菌的生长
50、抑制作用采用44完全析因设计，多因素方差分析方法（ANOVA）对结果进行统计分析。并采用响应面模型（RSM，Response surface Model）对纳米TiO2和PbAc之间的交互作用进行分析，模型如下：公式公式1 +=wXXXXY2211 X1是纳米TiO2的浓度（g/ml），X2是PbAc的浓度(g/ml)，是纳米TiO2对目标物作用效果的未知参数，是PbAc对目标物作用效果的未知参数，则是纳米TiO2与PbAc之间交互作用效果的未知参数，是效果基线值的未知参数，w是基线值与基线平均值的差，是均值为0，方差为常数的正态随机变量。未知参数通过最大似然法进行估计。正态性通过Shapir