第四章 第五节糖化酶.ppt

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1、第四节第四节 葡萄糖淀粉酶葡萄糖淀粉酶 葡萄糖淀粉酶葡萄糖淀粉酶 Glucoamylase,系统名为淀系统名为淀粉粉a-1a-1，4 4葡聚糖葡萄糖水解酶，葡聚糖葡萄糖水解酶，a-1a-1，4 4 GlucanGlucan glucohydrolaseglucohydrolase（EC 3.2.1.3EC 3.2.1.3），它被大量用作淀粉糖化剂，习惯上简称糖化它被大量用作淀粉糖化剂，习惯上简称糖化酶。酶。一、葡萄糖淀粉酶的性质一、葡萄糖淀粉酶的性质1 1 1 1、糖化酶的一般性质糖化酶的一般性质 糖化酶的适宜为糖化酶的适宜为pH 3.5-5.0pH 3.5-5.0，最适，最适pHpH为为4.

2、54.5，适，适宜的催化反应温度宜的催化反应温度 50 50 6060，最适温度为，最适温度为6060。2 2、糖化酶生产菌种及其酶系、糖化酶生产菌种及其酶系 工业上用得最广的菌种为：根霉、黑曲霉、泡工业上用得最广的菌种为：根霉、黑曲霉、泡盛曲霉、根霉等。由此可见霉菌是生产糖化酶的盛曲霉、根霉等。由此可见霉菌是生产糖化酶的主要生产菌种。主要生产菌种。各种菌种麸曲抽提液水解可溶性淀粉的酶活性各种菌种麸曲抽提液水解可溶性淀粉的酶活性类型类型酶活性酶活性a-淀粉酶淀粉酶 糖化酶糖化酶葡萄糖苷葡萄糖苷转移酶转移酶非发酵性糖非发酵性糖生成量生成量米曲霉米曲霉6.60 0.370.03少少黑曲霉黑曲霉0.

3、845.061.19中中泡盛曲霉泡盛曲霉3.302.620.90多多德氏根霉德氏根霉2.0 6.0 0少少3、糖化酶的类型：、糖化酶的类型：多数黑曲霉产生的糖化酶水解淀粉到多数黑曲霉产生的糖化酶水解淀粉到80%80%便终止作用，便终止作用，而大多数的根霉糖化酶可以水解到而大多数的根霉糖化酶可以水解到100%100%，前者称为，前者称为黑曲霉黑曲霉型糖化酶型糖化酶，后者称为，后者称为根霉型糖化酶根霉型糖化酶，这两类糖化酶对各种，这两类糖化酶对各种底物的水解能力有很大差异底物的水解能力有很大差异。黑曲霉糖化酶的耐酸性及耐热性比米曲霉强黑曲霉糖化酶的耐酸性及耐热性比米曲霉强4 4、淀粉中磷酸根对糖化

4、酶活性的影响、淀粉中磷酸根对糖化酶活性的影响 根茎植物淀粉分子中含有较多的磷酸，妨碍了曲霉根茎植物淀粉分子中含有较多的磷酸，妨碍了曲霉型糖化酶的糖化力。型糖化酶的糖化力。根茎植物（如马铃薯）淀粉分子中的磷酸，主要根茎植物（如马铃薯）淀粉分子中的磷酸，主要以葡萄糖以葡萄糖-6-6-磷酸或其它形式存在。曲霉型糖化酶水磷酸或其它形式存在。曲霉型糖化酶水解淀粉时，其中有一部分淀粉只能生成极限糊精，而解淀粉时，其中有一部分淀粉只能生成极限糊精，而大大影响淀粉的水解率。若将糖化酶与大大影响淀粉的水解率。若将糖化酶与a-a-淀粉酶、磷淀粉酶、磷酸酯酶一起作用，则随着游离磷的增加黑曲霉型糖化酸酯酶一起作用，则

5、随着游离磷的增加黑曲霉型糖化酶照样可以将淀粉水解进行到底。因此可以认为黑曲酶照样可以将淀粉水解进行到底。因此可以认为黑曲霉和根霉这两类糖化酶的水解力之所以不同，原因之霉和根霉这两类糖化酶的水解力之所以不同，原因之一是淀粉中含有磷酸酯键。单独用糖化酶与磷酸酯酶，一是淀粉中含有磷酸酯键。单独用糖化酶与磷酸酯酶，不能水解马铃薯糖化极限糊精，但在不能水解马铃薯糖化极限糊精，但在a-a-淀粉酶存在时，淀粉酶存在时，可使之成为小分子含磷糊精，经磷酸酯酶脱酶和糖化可使之成为小分子含磷糊精，经磷酸酯酶脱酶和糖化酶作用而水解。酶作用而水解。二、影响糖化酶生产的因素二、影响糖化酶生产的因素1、菌种繁殖方法对产酶的

6、影响、菌种繁殖方法对产酶的影响 培养基：保存菌种的斜面培养基对产酶与孢子形成有影培养基：保存菌种的斜面培养基对产酶与孢子形成有影响。响。NovoNovo公司报道将黑曲霉在公司报道将黑曲霉在麦芽汁斜面麦芽汁斜面保藏传代保藏传代6 6次后次后糖化酶活性下降糖化酶活性下降50%50%，但若在，但若在察氏斜面察氏斜面反复移植时，糖化反复移植时，糖化酶活性仍保持不变，只是孢子形成能力随着传代次数增加酶活性仍保持不变，只是孢子形成能力随着传代次数增加而减少。而减少。因此，交替使用两种斜面，不仅孢子密集，糖化酶活性因此，交替使用两种斜面，不仅孢子密集，糖化酶活性也可以保持原有水平。也可以保持原有水平。培养温

7、度：培养温度：将黑曲霉接种在察氏培养基中，将黑曲霉接种在察氏培养基中，34培培养具有形成孢子的能力，而升高温度无论孢子着养具有形成孢子的能力，而升高温度无论孢子着生还是糖化酶活性的生产均无影响，因此认为用生还是糖化酶活性的生产均无影响，因此认为用察氏斜面时，采用察氏斜面时，采用30培养为宜培养为宜。2 2、促进剂的效果、促进剂的效果许多研究表明，向黑曲霉或根霉培养基中添加少量许多研究表明，向黑曲霉或根霉培养基中添加少量某些物质可促进产酶。如某些物质可促进产酶。如 0.1%0.1%糖酯，或糖酯，或SpanSpan等分子中以等分子中以-OH-OH基为主的含硫基为主的含硫疏水性基团。疏水性基团。脂肪

8、酸和酯类脂肪酸和酯类 0.01%0.01%植酸质、植酸钙、肌醇以及谷氨酸等氨基植酸质、植酸钙、肌醇以及谷氨酸等氨基酸。酸。微量元素：钼盐、铬盐等。微量元素：钼盐、铬盐等。3 3、去除葡萄糖苷转移酶的方法、去除葡萄糖苷转移酶的方法 由于葡萄糖苷转移酶严重影响葡萄糖收率，异麦芽由于葡萄糖苷转移酶严重影响葡萄糖收率，异麦芽糖还有碍葡萄糖的结晶，因此我们研究用以下方法去糖还有碍葡萄糖的结晶，因此我们研究用以下方法去除转苷酶。除转苷酶。调节调节pHpH法法：调节：调节pHpH使转苷酶失活的最简便方法。使转苷酶失活的最简便方法。因为无论是哪一种糖化酶，它们的最适因为无论是哪一种糖化酶，它们的最适pHpH值

9、均为酸值均为酸性，黑曲霉性，黑曲霉C-5-11C-5-11为为4.54.5，黑曲霉，黑曲霉165165为为3 33.53.5。一般当一般当pHpH值倾向中性时，值倾向中性时，a-a-淀粉酶、转苷酶活性淀粉酶、转苷酶活性高，而糖化酶活性低；高，而糖化酶活性低；当当pHpH值倾向于酸性时，糖化酶活性高，而另两种值倾向于酸性时，糖化酶活性高，而另两种酶的活性降低。酶的活性降低。在实际操作中在实际操作中若发酵液中盐分浓度低，则可在若发酵液中盐分浓度低，则可在pH 2pH 2以下以下,在室温放在室温放置使转苷酶失活；置使转苷酶失活；若发酵液中无机盐浓度达若发酵液中无机盐浓度达0.5M0.5M，pHpH过

10、低或时间过长过低或时间过长也会引起糖化酶的失活。可将发酵液调节也会引起糖化酶的失活。可将发酵液调节pH pH 2.25-2.752.25-2.75，55放置放置7 7天可去除转苷酶天可去除转苷酶.吸附法：吸附法：向发酵液中加入非水溶性的试剂，依靠分子向发酵液中加入非水溶性的试剂，依靠分子之间的吸附作用将转苷酶除去。之间的吸附作用将转苷酶除去。该法选择性差，易造成糖化酶的损失。如黑曲霉该法选择性差，易造成糖化酶的损失。如黑曲霉7 7的发酵液，在的发酵液，在pH 2.5-2.8pH 2.5-2.8，4%4%酸性白土酸性白土处理，糖化处理，糖化液的液的DEDE由由86.9%86.9%升到升到96%9

11、6%，但糖损失了，但糖损失了10-20%10-20%。常用吸附剂有常用吸附剂有MgSiOMgSiO3 3 、硅藻土、蒙脱土（、硅藻土、蒙脱土（Mg.CaMg.Ca AlSiOAlSiO5 5O O1616）加入表面活性剂加入表面活性剂 常用试剂为烷基苯磺酸钠、木素、单宁酸等，能有常用试剂为烷基苯磺酸钠、木素、单宁酸等，能有效去除转苷酶。效去除转苷酶。如在黑曲霉发酵液在如在黑曲霉发酵液在pH 2-4pH 2-4，加入，加入0.01-0.5%0.01-0.5%十十二烷基硫酸镁、二辛基琥珀酸磺酸钠等，二烷基硫酸镁、二辛基琥珀酸磺酸钠等，15-4015-40处处理数分钟可除去转苷酶。理数分钟可除去转苷

12、酶。杂多酸活高分子共聚物沉淀法杂多酸活高分子共聚物沉淀法 杂多酸是磷钼酸、磷钨酸、磷钒酸、硅钼酸、杂多酸是磷钼酸、磷钨酸、磷钒酸、硅钼酸、杂多酸是磷钼酸、磷钨酸、磷钒酸、硅钼酸、杂多酸是磷钼酸、磷钨酸、磷钒酸、硅钼酸、硼钨酸、硼钒酸、硅钨酸、硅钒酸或它们的混合硼钨酸、硼钒酸、硅钨酸、硅钒酸或它们的混合硼钨酸、硼钒酸、硅钨酸、硅钒酸或它们的混合硼钨酸、硼钒酸、硅钨酸、硅钒酸或它们的混合物。物。物。物。处理时，当处理时，当处理时，当处理时，当pHpHpHpH低于低于低于低于2.52.52.52.5则糖化酶也被沉淀，则糖化酶也被沉淀，则糖化酶也被沉淀，则糖化酶也被沉淀，pHpHpHpH高于高于高于高

13、于3.53.53.53.5，则无效，因此在工业生产中，在，则无效，因此在工业生产中，在，则无效，因此在工业生产中，在，则无效，因此在工业生产中，在pH2.5-pH2.5-pH2.5-pH2.5-3.5 3.5 3.5 3.5 向黑曲霉加入向黑曲霉加入向黑曲霉加入向黑曲霉加入0.075-0.45%0.075-0.45%0.075-0.45%0.075-0.45%的杂多酸，的杂多酸，的杂多酸，的杂多酸，37373737搅搅搅搅拌拌拌拌30min30min30min30min，其糖化酶的回收率可达，其糖化酶的回收率可达，其糖化酶的回收率可达，其糖化酶的回收率可达98%98%98%98%以上。以上。以

14、上。以上。添加氯仿沉淀法添加氯仿沉淀法PH 2.5PH 2.5加入加入0.1-5%0.1-5%氯仿能沉淀转苷酶。但当温度低氯仿能沉淀转苷酶。但当温度低于于4040或或PHPH低于低于2.32.3时则糖化酶失活。时则糖化酶失活。蛋白酶处理法蛋白酶处理法 黑曲霉转苷酶在黑曲霉转苷酶在pH 7-8pH 7-8，35-4035-40用中性蛋白酶用中性蛋白酶（或在（或在pH 2-3pH 2-3，用酸性蛋白酶）水解后破坏，糖，用酸性蛋白酶）水解后破坏，糖化酶回收率可达化酶回收率可达99%99%，糖化液，糖化液DEDE值由值由92%92%升高至升高至97%97%。三、深层培养三、深层培养（黑曲霉（黑曲霉A.

15、S.3.4309 A.S.3.4309）1 1、发酵工艺、发酵工艺 斜面培养斜面培养一级种子培养一级种子培养种子罐培养种子罐培养发酵罐培养发酵罐培养察氏蔗糖培养，察氏蔗糖培养，3232，培养，培养6d6d，玉玉米米粉粉2.5%2.5%，玉玉米米浆浆 2%2%，3232摇摇瓶瓶培培养养24-36h24-36h，接种量接种量1%1%，培养基同上，通风培养，培养基同上，通风培养24-36h24-36h培养基：玉米粉培养基：玉米粉15%15%，玉米浆，玉米浆 2%2%，豆饼粉，豆饼粉2%2%，接接种种量量5-7%5-7%，通通风风量量1 1：1.21.2以以上上，搅搅拌拌速速度度 270r/min27

16、0r/min，培培 养养 96h96h，糖糖 化化 酶酶 活活 性性 接接 近近 6 6，000U/ml000U/ml时，可终止发酵。时，可终止发酵。2 2、发酵过程中糖化酶活性、发酵过程中糖化酶活性、pHpH值等的变化值等的变化 第三章第三章 复习题复习题1.1.定义：厚层通风制曲、液体深层发酵定义：厚层通风制曲、液体深层发酵2.2.根据水解淀粉的方式不同，淀粉酶主要分为哪四根据水解淀粉的方式不同，淀粉酶主要分为哪四类？类？3.3.a-a-淀粉酶的性质有哪些？淀粉酶的性质有哪些？4.4.米曲霉固定培养法生产米曲霉固定培养法生产a-a-淀粉酶工艺流程主要有淀粉酶工艺流程主要有哪些？哪些？5.5

17、.简述制曲工艺，制曲不当常出现的问题以及预防简述制曲工艺，制曲不当常出现的问题以及预防措施措施6.6.厚层通风制曲的操作要点厚层通风制曲的操作要点7.7.影响影响a-a-淀粉酶液体生产的因素淀粉酶液体生产的因素第三章第三章 复习题复习题1 1、定义：厚层通风制曲、液体深层发酵定义：厚层通风制曲、液体深层发酵2 2、按照水解淀粉的方式不同，淀粉酶主要分为哪四类、按照水解淀粉的方式不同，淀粉酶主要分为哪四类？3 3、请画一幅米曲霉固体发酵工艺流程图、请画一幅米曲霉固体发酵工艺流程图4 4、简述如何根据霉菌生长规律进行固体发酵制曲？、简述如何根据霉菌生长规律进行固体发酵制曲？5 5、制曲不当常出现哪

18、些问题？如何进行防治？、制曲不当常出现哪些问题？如何进行防治？6 6、何谓液体深层发酵？这种发酵方式有何特点？、何谓液体深层发酵？这种发酵方式有何特点？7 7、举例说明液体深层发酵工艺流程？、举例说明液体深层发酵工艺流程？8 8、影响、影响a-a-淀粉酶液体深层发酵生产的因素有哪淀粉酶液体深层发酵生产的因素有哪些？些？9 9、影响发酵染菌的主要因素有哪些？如何进行、影响发酵染菌的主要因素有哪些？如何进行判断？判断？1010、发酵前、中、后期染菌对发酵有何影响？、发酵前、中、后期染菌对发酵有何影响？如何进行控制？如何进行控制？1111、如何去除糖化酶中的葡萄糖转苷酶？（举、如何去除糖化酶中的葡萄

19、糖转苷酶？（举3 3种以上方法）种以上方法）THE ENDTHE END 活性活性(酸性酸性)白土的加工流程一般为：白土的加工流程一般为：膨润土膨润土 破碎破碎 加入盐酸或硫酸加入盐酸或硫酸(湿法需加水湿法需加水和分散剂和分散剂)充分搅拌充分搅拌 混合挤压混合挤压 回转炉回转炉干燥干燥 加热空气粉磨加热空气粉磨 空气分级空气分级 储存。储存。Span-80Span-80Span-80Span-80，（又名斯盘）即，（又名斯盘）即，（又名斯盘）即，（又名斯盘）即失水山梨醇油酸酯，其组失水山梨醇油酸酯，其组失水山梨醇油酸酯，其组失水山梨醇油酸酯，其组成为成为成为成为1,4-1,4-1,4-1,4-

20、失水山梨醇，失水山梨醇，失水山梨醇，失水山梨醇，1,5-1,5-1,5-1,5-失水山梨醇及失水山梨醇及失水山梨醇及失水山梨醇及1,4-1,4-1,4-1,4-3,6-3,6-3,6-3,6-双失水山梨醇的单双多油酸酯的混合物。具双失水山梨醇的单双多油酸酯的混合物。具双失水山梨醇的单双多油酸酯的混合物。具双失水山梨醇的单双多油酸酯的混合物。具有良好的乳化、分散和润湿性能，加之无毒无害，有良好的乳化、分散和润湿性能，加之无毒无害，有良好的乳化、分散和润湿性能，加之无毒无害，有良好的乳化、分散和润湿性能，加之无毒无害，被广泛地应用于各个领域。被广泛地应用于各个领域。被广泛地应用于各个领域。被广泛地

21、应用于各个领域。极限糊精极限糊精：是指支链淀粉中带有支链的核心部是指支链淀粉中带有支链的核心部位，该糊精分子量大，位，该糊精分子量大，遇碘呈紫色遇碘呈紫色，进一步降解，进一步降解需要需要-（16）糖苷键的水解）糖苷键的水解.（C6H10O5）n (C6H10O5)n-x C12H22O11 C6H12O6淀粉淀粉 紫糊精紫糊精 红糊精红糊精 无色糊精无色糊精 麦芽糖麦芽糖 葡萄糖葡萄糖（蓝色）（紫糊精）（红色）（蓝色）（紫糊精）（红色）（无色）（无色）（无色）（无色）（无色）（无色）在酒精发酵时，糖化醪中由转苷酶生成的非发酵在酒精发酵时，糖化醪中由转苷酶生成的非发酵性糖在发酵后期，当糖浓度降低

22、时，由于转苷性糖在发酵后期，当糖浓度降低时，由于转苷酶的可逆反应，仍可转变成发酵性糖。（利用酶的可逆反应，仍可转变成发酵性糖。（利用黑曲霉糖化酶）黑曲霉糖化酶）在制造葡萄糖时，由于糖浓度高，转苷酶的存在在制造葡萄糖时，由于糖浓度高，转苷酶的存在可时葡萄糖收率明显降低。（利用根酶糖化酶）可时葡萄糖收率明显降低。（利用根酶糖化酶）葡萄糖苷转移酶的作用葡萄糖苷转移酶的作用 葡萄糖苷转移酶（葡萄糖苷转移酶（a-a-葡萄糖苷酶）可切开麦葡萄糖苷酶）可切开麦芽糖的芽糖的a-1a-1、4 4键，并将游离出的一个葡萄糖残基键，并将游离出的一个葡萄糖残基转移到另一个葡萄糖活麦芽糖分子转移到另一个葡萄糖活麦芽糖分子a-1a-1，6 6位，生位，生成非发酵性的潘糖和异麦芽糖等低聚糖：成非发酵性的潘糖和异麦芽糖等低聚糖：l可发酵性糖：可发酵性糖：在酒精生产中，能被酵母利在酒精生产中，能被酵母利用、同化的糖类称为可发酵性糖。用、同化的糖类称为可发酵性糖。可发酵性糖主要包括有：蔗糖、麦芽糖、可发酵性糖主要包括有：蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、果糖和半乳糖等。葡萄糖、果糖和半乳糖等。l非发酵性糖：非发酵性糖：不能被酵母利用、同化的糖不能被酵母利用、同化的糖类，称为非发酵性糖。类，称为非发酵性糖。非发酵性糖包括潘糖（非发酵性糖包括潘糖（C C3 3），异麦芽糖），异麦芽糖（C C2 2）及纤维素等。）及纤维素等。