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1、实验六 氨基酸的纸层析法氨基酸的纸层析法一、原理一、原理一、原理一、原理 以滤纸为支持物的层析法，称为纸层析法。纸层析所用展层以滤纸为支持物的层析法，称为纸层析法。纸层析所用展层剂大多由水和有机溶剂组成。展层时，水为静止相，他与滤纸纤剂大多由水和有机溶剂组成。展层时，水为静止相，他与滤纸纤维亲和力强；有机溶剂为流动相，它与滤纸纤维亲和力弱。有机维亲和力强；有机溶剂为流动相，它与滤纸纤维亲和力弱。有机溶剂在滤纸上又下向上移动的，称为上行法；有上向下移动的，溶剂在滤纸上又下向上移动的，称为上行法；有上向下移动的，称为下行法。称为下行法。将样品在滤纸上确定的原点处展层，由于样品中各种氨基酸将样品在滤
2、纸上确定的原点处展层，由于样品中各种氨基酸在两相中不断进行分配，且他们的分离系数各不相同，所以不同在两相中不断进行分配，且他们的分离系数各不相同，所以不同的氨基酸随流动相移动的速率也不相同，于是各种氨基酸在滤纸的氨基酸随流动相移动的速率也不相同，于是各种氨基酸在滤纸上就相互分离出来，形成距原点不等的层析点。上就相互分离出来，形成距原点不等的层析点。在一定条件下（室温、展层剂的组成、滤纸的质量、在一定条件下（室温、展层剂的组成、滤纸的质量、PHPH值等值等不变），不同的氨基酸有固定的移动速率（不变），不同的氨基酸有固定的移动速率（RfRf值）值）RfRf=原点到层析点中心的距离原点到层析点中心的
3、距离/原点到溶剂前沿的距离原点到溶剂前沿的距离 用混合氨基酸做样品时，如果只用一种溶剂展层，由于某些用混合氨基酸做样品时，如果只用一种溶剂展层，由于某些氨基酸的移动速率相同或相近，就不能将它们分开，为此，当用氨基酸的移动速率相同或相近，就不能将它们分开，为此，当用一种溶剂展层后，可将滤纸旋转一种溶剂展层后，可将滤纸旋转9090度，以第一次所的层析点为原度，以第一次所的层析点为原点，在用另一溶剂展层，从而达到分离的目的。这种方法称为双点，在用另一溶剂展层，从而达到分离的目的。这种方法称为双向层析法。向层析法。本试验主要介绍的是单向层析法。其中本试验主要介绍的是单向层析法。其中混合氨基酸有精氨酸、
4、混合氨基酸有精氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸组成。酪氨酸、苯丙氨酸组成。二、实验仪器二、实验仪器 1、新华滤纸 2、层析缸 3、细线 4、点样管 5、橡皮筋 6、电吹风 7、喷雾器三、实验试剂三、实验试剂1 1、混合氨基酸（精氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸）混合氨基酸（精氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸）2 2、展展层层剂剂：正正丁丁醇醇：12%12%氨氨水水：95%95%乙乙醇醇：蒸蒸馏馏水水=13=13：3 3：3 3：1 1（v:vv:v）3 3、0.5%0.5%茚三酮茚三酮无水丙酮溶液：无水丙酮溶液：0.5g0.5g茚三酮溶于茚三酮溶于100ml100ml无水丙酮，贮于棕色瓶中无水丙酮，贮于棕色瓶中 四、试验步
5、骤四、试验步骤四、试验步骤四、试验步骤 1 1、取取滤滤纸纸剪剪成成2020 1010厘厘米米的的滤滤纸纸条条一一张张，在在一一端端打打孔孔，系系一一根根细细线线，在在另另一一端端23cm23cm处处用用铅铅笔笔画画一一横横线线，中中间画一圆点间画一圆点（原点）（原点）。2 2、取取毛毛细细管管一一支支(回回收收)，吸吸取取氨氨基基酸酸混混合合液液，在在原原点点处处点点样样，样样点点直直径径不不宜宜超超过过5mm,5mm,每每点点一一次次用用吹吹风风机机吹吹干，点干，点2323次为佳。次为佳。3 3、点点样样后后将将滤滤纸纸放放入入层层析析缸缸中中展展层层，注注意意点点样样线线要要高高于于层层
6、析析液液面面，滤滤纸纸不不要要贴贴在在层层析析缸缸璧璧上上，当当展展层层至至另另一端一端12cm12cm处时，停止展层（大约处时，停止展层（大约2323小时）。小时）。4 4、取取出出滤滤纸纸，用用铅铅笔笔记记下下溶溶剂剂前前沿沿，然然后后用用热热风风吹吹干干（或烘箱（或烘箱6060）烘干。）烘干。5 5、均均匀匀喷喷上上茚茚三三酮酮无无水水丙丙酮酮液液，注注意意使使溶溶液液不不倒倒流流，不间断。不间断。6 6、用吹风机吹干，观察层析点，确定其几何中心。、用吹风机吹干，观察层析点，确定其几何中心。7 7、量量取取数数值值，计计算算各各自自的的RfRf值值，与与表表中中标标准准氨氨基基酸酸RfRf值比较，确定样品氨基酸种类。值比较，确定样品氨基酸种类。（书上图谱横着看）（书上图谱横着看）