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1、第十一章第十一章 植物生殖工程植物生殖工程 第一节 概 述一、植物生殖工程概念一、植物生殖工程概念 植物生殖工程植物生殖工程：是通过控制和利用植物有性生：是通过控制和利用植物有性生殖过程而改良植物的应用技术领域，主要指在殖过程而改良植物的应用技术领域，主要指在离体条件下以生殖细胞和原生质体为对象所进离体条件下以生殖细胞和原生质体为对象所进行的遗传操作，包括整个有性生殖过程的控制行的遗传操作，包括整个有性生殖过程的控制和利用。和利用。与体细胞工程比优点：与体细胞工程比优点：n有性生殖是大多数植物的自然生殖过程，有性生殖是大多数植物的自然生殖过程，是一种阻力较少的途径。是一种阻力较少的途径。n生殖
2、过程中提供了许多基因操作的机会生殖过程中提供了许多基因操作的机会如花粉管是引导雄配子完成受精作用的运载如花粉管是引导雄配子完成受精作用的运载工具，具有作为外源基因载体的功能。工具，具有作为外源基因载体的功能。n植物生殖系统中拥有许多天然的单倍体细植物生殖系统中拥有许多天然的单倍体细胞，可以直接制备单倍体原生质体。胞，可以直接制备单倍体原生质体。n生殖系统中丰富多样的细胞类型可用于不生殖系统中丰富多样的细胞类型可用于不同研究途。同研究途。n单倍性的生殖细胞经过减数分裂发生了各单倍性的生殖细胞经过减数分裂发生了各种形式的遗传重组，具有极大的遗传变异性，种形式的遗传重组，具有极大的遗传变异性，因此通
3、过生殖工程操作可以直接获得各种类因此通过生殖工程操作可以直接获得各种类型的新个体。型的新个体。n植物生殖工程包括植物生殖工程包括二大生殖系统：二大生殖系统：雄性生殖系统和雌性生殖系统雄性生殖系统和雌性生殖系统两种操作方式；两种操作方式；活体操作和离体操作；活体操作和离体操作；三个研究水平三个研究水平：即器官、细胞和原生质体水平。：即器官、细胞和原生质体水平。二、植物生殖工程的基本操作二、植物生殖工程的基本操作 1、器官水平操作、器官水平操作 A、试管授粉、试管授粉 试管授粉或试管受精是指为试管授粉或试管受精是指为了克服交配的不亲和性，离体培养子房或胚了克服交配的不亲和性，离体培养子房或胚珠而在
4、试管中完成受精过程。珠而在试管中完成受精过程。B、子房和胚珠培养、子房和胚珠培养 受精子房和胚珠培养的目的也是在于克服杂受精子房和胚珠培养的目的也是在于克服杂交或自交胚的败育。交或自交胚的败育。未受精子房和胚珠培养既是诱导卵器细胞形未受精子房和胚珠培养既是诱导卵器细胞形成单倍体植株进行单倍体育种的途径，又是研成单倍体植株进行单倍体育种的途径，又是研究人工诱导无融合生殖和实验生殖生物学的好究人工诱导无融合生殖和实验生殖生物学的好方法。方法。C、胚和胚乳培养、胚和胚乳培养 胚培养是克服远缘杂交困难经常采用的胚培养是克服远缘杂交困难经常采用的方法。胚乳是极核受精的产物，一般多为方法。胚乳是极核受精的
5、产物，一般多为3n。因此进行胚乳培养的目的之一，在于。因此进行胚乳培养的目的之一，在于培养三倍体植株以获得无籽的瓜果，如无籽培养三倍体植株以获得无籽的瓜果，如无籽西瓜、无籽柑桔和无籽枇杷等。西瓜、无籽柑桔和无籽枇杷等。D、花药培养、花药培养 离体培养花药是大量获得单倍体进行单倍离体培养花药是大量获得单倍体进行单倍体育种和遗传学研究的重要技术，也是研究体育种和遗传学研究的重要技术，也是研究雄核发育等生殖生物学问题的良好方法。雄核发育等生殖生物学问题的良好方法。2、细胞水平的操作、细胞水平的操作（1）大孢子母细胞、大孢子和胚囊的分离）大孢子母细胞、大孢子和胚囊的分离（2）花粉培养）花粉培养 花粉培
6、养的优点是：花粉培养的优点是：A、可以直接研究花粉细胞的发育、脱分化与再分化过、可以直接研究花粉细胞的发育、脱分化与再分化过程。程。B、体细胞组织来源的愈伤组织或胚状体形成的植株及、体细胞组织来源的愈伤组织或胚状体形成的植株及混倍体的频率均可大幅度降低。混倍体的频率均可大幅度降低。C、可以减少体细胞对花粉细胞发育的竞争和抑制作用，、可以减少体细胞对花粉细胞发育的竞争和抑制作用，提高花粉诱导频率和成苗率。提高花粉诱导频率和成苗率。3、原生质体的分离与培养、原生质体的分离与培养 n它包括卵及其他胚囊分子的分离、花粉原生它包括卵及其他胚囊分子的分离、花粉原生质体的分离与培养、生殖细胞与精细胞的分质体
7、的分离与培养、生殖细胞与精细胞的分离与培养、配子离与培养、配子体细胞融合的研究、受精体细胞融合的研究、受精工程的尝试等等。工程的尝试等等。第二节未受精子房和胚珠培养第二节未受精子房和胚珠培养 一、概一、概 述述 San Noeum(1976)首次利用大麦未受精子房首次利用大麦未受精子房培养出单倍体植株，该项研究成功的意义在培养出单倍体植株，该项研究成功的意义在于开辟了单倍体育种的另一途径，这对于花于开辟了单倍体育种的另一途径，这对于花粉培养尚未获成功的物种尤为重要粉培养尚未获成功的物种尤为重要.二、未受精子房和胚珠培养技术二、未受精子房和胚珠培养技术 n选择基因型材料；选择基因型材料；n确定接
8、种期；确定接种期；n选择培养基；选择培养基；n采用一定的接种方式，如固体培养、液体采用一定的接种方式，如固体培养、液体漂浮培养、平放或直插等；漂浮培养、平放或直插等；n保温培养；保温培养；n染色体鉴定；染色体鉴定；n染色体加倍；染色体加倍；n胚囊植株及其后代观察。胚囊植株及其后代观察。三、胚囊植株的起源三、胚囊植株的起源 n卵细胞孤雌生殖为主卵细胞孤雌生殖为主 n助细胞的无配子生殖助细胞的无配子生殖 n反足细胞无配子生殖反足细胞无配子生殖n其他类型其他类型四、胚囊植株的遗传表现四、胚囊植株的遗传表现 n胚囊植株中的单倍体比例较高，二倍体比例胚囊植株中的单倍体比例较高，二倍体比例较低，混倍体较少
9、。而且胚囊植株绿苗率高较低，混倍体较少。而且胚囊植株绿苗率高(可达可达893)，白化苗率低，白化苗率低(88)，与，与花粉植株白化苗率高的特点呈鲜明的对比，花粉植株白化苗率高的特点呈鲜明的对比，构成了子房培养的一个十分突出而且十分有构成了子房培养的一个十分突出而且十分有意义的特点。意义的特点。五、植物遗传工程的受体五、植物遗传工程的受体胚囊胚囊 n胚囊内的卵细胞、助细胞和中央细胞在子胚囊内的卵细胞、助细胞和中央细胞在子房成熟时期呈现部分无壁的状态房成熟时期呈现部分无壁的状态n单倍体单倍体 n世代交替的转折期与再生潜能世代交替的转折期与再生潜能 n胚囊体积大，胚囊壁结构特殊胚囊体积大，胚囊壁结构
10、特殊 第三节第三节 花药和花粉培养花药和花粉培养 一、花药和花粉培养的意义一、花药和花粉培养的意义n花药和花粉培养最易大批量地获得单倍体，花药和花粉培养最易大批量地获得单倍体，并且从花药或花粉获得的单倍体植株可以经并且从花药或花粉获得的单倍体植株可以经自发或诱发染色体加倍而形成纯合二倍体，自发或诱发染色体加倍而形成纯合二倍体，因此应用得最为广泛。因此应用得最为广泛。n此外，花药内花粉数量多，本身为单倍体细此外，花药内花粉数量多，本身为单倍体细胞，离散性好，发育同步性高，因此在遗传胞，离散性好，发育同步性高，因此在遗传操作中具重要作用。操作中具重要作用。二、花药培养的基本技术和影响因素二、花药培
11、养的基本技术和影响因素 基本过程包括：挑选适宜的基因型作材料；挑选适宜的基因型作材料；确定花粉发育时期；确定花粉发育时期；材料的预处理；材料的预处理；诱导培养；诱导培养；分化培养；分化培养；染色体数观察和染色体数加倍；染色体数观察和染色体数加倍；花粉植株当代及后代观察鉴定。花粉植株当代及后代观察鉴定。影响因素：影响因素：n1 1、材料基因型：、材料基因型：茄科、禾本科、十字花科的茄科、禾本科、十字花科的植物所占比例较大。植物所占比例较大。n2 2、材料的预处理：、材料的预处理：低温预处理；低温预处理；离心预处理；离心预处理；高温预处理高温预处理或预培养。或预培养。三、雄核发育途径、饥饿与花粉二
12、型性三、雄核发育途径、饥饿与花粉二型性 1、雄核发育的途径雄核发育的途径 n营养细胞发育；营养细胞发育；小孢子发育；小孢子发育；营养核、生营养核、生殖核共同发育；殖核共同发育；生殖核发育；生殖核发育；其他发育类型。其他发育类型。2、花粉的二型性：指同一花药中存在两类不同的花花粉的二型性：指同一花药中存在两类不同的花粉。粉。一类为正常花粉，它们的细胞质较浓，发育较一一类为正常花粉，它们的细胞质较浓，发育较一致，染色较深；另一类为异常花粉，这类花粉较致，染色较深；另一类为异常花粉，这类花粉较小，它们的细胞质较淡、染色较浅，发育落后。小，它们的细胞质较淡、染色较浅，发育落后。nSunderlandS
13、underland等在研究花药培养的发育途径中等在研究花药培养的发育途径中发现后一类花粉具有雄核发育能力，形成花发现后一类花粉具有雄核发育能力，形成花粉胚，因此特称为胚性花粉或粉胚，因此特称为胚性花粉或E E花粉花粉.n从曼陀罗、烟草等植物中观察到花药从曼陀罗、烟草等植物中观察到花药(粉粉)培培养诱导率与这种养诱导率与这种E E花粉的多少有关，因此认花粉的多少有关，因此认为选择为选择E E花粉多的材料，是花药和花粉培养花粉多的材料，是花药和花粉培养的关键。的关键。n小孢子胚胎发生机制小孢子胚胎发生机制 在烟草花药培养中发现，胚胎发生的小在烟草花药培养中发现，胚胎发生的小孢子的蛋白质和孢子的蛋白
14、质和RNARNA含量仅及无胚胎发生的花含量仅及无胚胎发生的花粉粒的六分之一。某些物质的亏缺即粉粒的六分之一。某些物质的亏缺即“饥饿饥饿”被看作是胚胎发生启动的重要条件。被看作是胚胎发生启动的重要条件。蔗糖饥饿蔗糖饥饿四、花粉培养四、花粉培养 n花粉培养是以游离花粉粒进行直接培养花粉培养是以游离花粉粒进行直接培养n药壁组织对小孢子的启动发育可能提供重要药壁组织对小孢子的启动发育可能提供重要的促进物质，称为花药因子。的促进物质，称为花药因子。作用：作用：在花粉去分化中药壁组织向花粉提供在花粉去分化中药壁组织向花粉提供了必要的营养物质。了必要的营养物质。药壁组织吸收、贮存和转化培养基中药壁组织吸收、
15、贮存和转化培养基中的外源物质，起着花粉代谢库的作用。的外源物质，起着花粉代谢库的作用。nChuongChuong和和Beversdorf(1985)Beversdorf(1985)在油菜游离花粉在油菜游离花粉培养中也获得重大进展，在一定条件下高频培养中也获得重大进展，在一定条件下高频率地诱导出胚状体，最高使每个花药的花粉率地诱导出胚状体，最高使每个花药的花粉形成形成5454个胚状体。个胚状体。将适期花药的花粉离散出来，先在将适期花药的花粉离散出来，先在3232下培下培养养3d3d，然后转入，然后转入2525下培养下培养3-43-4星期。星期。用用1313蔗糖改良蔗糖改良NitschNitsch
16、培养基加入培养基加入lmglmgL L NAANAA和和0 05mg5mgL BAL BA进行诱导培养。进行诱导培养。五、花粉植株的遗传研究五、花粉植株的遗传研究 n花药培养产生的花粉植株常出现染色体数和花药培养产生的花粉植株常出现染色体数和染色体倍数性的各种变异类型。染色体倍数性的各种变异类型。n烟草花药培养通过胚状体途径形成的花粉植烟草花药培养通过胚状体途径形成的花粉植株几乎全是单倍体。株几乎全是单倍体。n禾本科植物花药培养主要经愈伤组织途径形禾本科植物花药培养主要经愈伤组织途径形成植株，染色体倍性比较复杂。成植株，染色体倍性比较复杂。n水稻和小麦花粉植株中以单倍体为主，也有水稻和小麦花粉
17、植株中以单倍体为主，也有少数二倍体。在小麦中发现有多倍体、混倍少数二倍体。在小麦中发现有多倍体、混倍体或非整倍体如缺体等。体或非整倍体如缺体等。n玉米、大麦花粉植株中多数为混倍体，典型玉米、大麦花粉植株中多数为混倍体，典型单倍件与二倍体植株却较少。单倍件与二倍体植株却较少。n禾本科花药培养的另一障碍是产生白化苗。禾本科花药培养的另一障碍是产生白化苗。n在水稻中产生白苗的趋势是野生稻在水稻中产生白苗的趋势是野生稻籼稻籼稻粳稻。粳稻。n对水稻白苗的一系列研究表明，白化苗产生对水稻白苗的一系列研究表明，白化苗产生是由于叶绿体不能正常形成，而叶绿体的异是由于叶绿体不能正常形成，而叶绿体的异常是由于存在
18、于细胞质中的常是由于存在于细胞质中的rRNA缺失。缺失。第四节第四节 胚囊类细胞的分离胚囊类细胞的分离 一、意义一、意义 胚囊类细胞是大孢子母细胞、大孢子、胚胚囊类细胞是大孢子母细胞、大孢子、胚囊的细胞的合称。囊的细胞的合称。胚囊分离技术的建立，对于研究和利用胚胚囊分离技术的建立，对于研究和利用胚囊类细胞具有十分重要的意义。囊类细胞具有十分重要的意义。n胚囊细胞是天然单倍体胚囊细胞是天然单倍体n可以直接研究生活胚囊可以直接研究生活胚囊n进行雌性生殖系统的再生与发育研究进行雌性生殖系统的再生与发育研究n提供离散的卵提供离散的卵n用活胚囊为受体进行遗传操作与基因转化用活胚囊为受体进行遗传操作与基因
19、转化研究研究二、分离方法二、分离方法 1、酶解涂抹法：用果胶酶处理雀稗属酶解涂抹法：用果胶酶处理雀稗属(Paspalum)的几个种的子房，使子房壁离解的几个种的子房，使子房壁离解疏松，然后挑出离解的子房置于玻片上进行疏松，然后挑出离解的子房置于玻片上进行涂抹，观察到成熟胚囊的基本结构。涂抹，观察到成熟胚囊的基本结构。2、酶解振荡法、酶解振荡法：将固定或活体的胚珠置于含：将固定或活体的胚珠置于含有纤维素酶、果胶酶或蜗牛酶及一定渗透稳有纤维素酶、果胶酶或蜗牛酶及一定渗透稳定剂、膜稳定剂的酶液中，在小型振荡器上定剂、膜稳定剂的酶液中，在小型振荡器上保温保温(28-30)连续振荡酶解，使珠被组织连续振
20、荡酶解，使珠被组织离散，再经过离心分离、清洗纯化，获得较离散，再经过离心分离、清洗纯化，获得较清净的胚囊类细胞，最后进行显微观察和细清净的胚囊类细胞，最后进行显微观察和细胞学研究。胞学研究。3、酶解压片分离法、酶解压片分离法获得无菌胚珠获得无菌胚珠酶解：将生活胚珠放入酶液中酶解：将生活胚珠放入酶液中28黑暗条黑暗条件下处理件下处理35-4h.清洗：用清洗：用0.6molL甘露醇洗净酶液甘露醇洗净酶液压片：滴一滴含有酶解后胚珠的液体于压片：滴一滴含有酶解后胚珠的液体于载玻片上，加上盖玻片。载玻片上，加上盖玻片。观察：制好的压片用石蜡封边后在相差观察：制好的压片用石蜡封边后在相差显微镜下观察。显微
21、镜下观察。压片：滴一滴含有酶解后胚珠的液三、问题三、问题 n胚囊壁及胚囊周围组织的结构特异性。胚囊壁及胚囊周围组织的结构特异性。n酶类的应用：木质化或栓质化的组织，采酶类的应用：木质化或栓质化的组织，采用目前应用的酶类去分离则比较困难。用目前应用的酶类去分离则比较困难。n胚囊数少胚囊数少第五节第五节 植物性细胞原生质体植物性细胞原生质体 的分离、培养和融合的分离、培养和融合 n与体细胞相比，性细胞具有其独自的特色：与体细胞相比，性细胞具有其独自的特色：第一，它们具单倍性基因组，遗传组成单一。第一，它们具单倍性基因组，遗传组成单一。第二，它们经历两性分化与一系列的发育程第二，它们经历两性分化与一
22、系列的发育程序，产生形态与生理各异的多种细胞类型。序，产生形态与生理各异的多种细胞类型。第三，它们适应于有性生殖，能通过传粉受第三，它们适应于有性生殖，能通过传粉受精，繁殖种子与后代。精，繁殖种子与后代。一、原生质体分离一、原生质体分离 1、花粉原生质体的分离、花粉原生质体的分离 花粉具有结构简单、单倍体遗传组成、发花粉具有结构简单、单倍体遗传组成、发育同步、数量众多、参与传粉受精作用等特育同步、数量众多、参与传粉受精作用等特点。点。三条技术路线：三条技术路线：化学药品降解花粉壁化学药品降解花粉壁 非酶脱壁非酶脱壁 酶解法酶解法 n一步酶解法一步酶解法 花粉置于酶液中，通过水合膨花粉置于酶液中
23、，通过水合膨胀，使外壁沿萌发沟裂开，内壁大面积地暴胀，使外壁沿萌发沟裂开，内壁大面积地暴露在酶的作用之下而分解，释放出原生质体。露在酶的作用之下而分解，释放出原生质体。n水合水合-酶解二步法酶解二步法 第一步，花粉在蔗糖液内充分水合，使外壁裂第一步，花粉在蔗糖液内充分水合，使外壁裂开。开。第二步，转入酶液，降解内壁，获得原生质体。第二步，转入酶液，降解内壁，获得原生质体。甘蓝型油菜与紫菜苔、凌霄花甘蓝型油菜与紫菜苔、凌霄花n萌发萌发-酶解二步法酶解二步法 第一步是将成熟花粉置于花粉萌发培养基中，第一步是将成熟花粉置于花粉萌发培养基中，待花粉大量萌发，长出短花粉管，及时转入待花粉大量萌发，长出短
24、花粉管，及时转入第二步，在酶液中酶解。第二步，在酶液中酶解。由于花粉管尖端的壁为果胶质与纤维素所组由于花粉管尖端的壁为果胶质与纤维素所组成，酶液由此处开始降解花粉管壁，再扩展成，酶液由此处开始降解花粉管壁，再扩展至降解花粉内壁，从而释放出原生质体。烟至降解花粉内壁，从而释放出原生质体。烟草。草。n影响分离效果的因素影响分离效果的因素 (1)植物种类植物种类 (2)花粉发育时期花粉发育时期 (3)酶的种类酶的种类 (4)酶液渗透压酶液渗透压 (5)新鲜与保存花粉新鲜与保存花粉 2、生殖细胞与精细胞的分离、生殖细胞与精细胞的分离 细胞核大，细胞质与细胞器稀少，核质比很细胞核大，细胞质与细胞器稀少，
25、核质比很高。类似天然的单倍性的核质体，在植物性高。类似天然的单倍性的核质体，在植物性细胞工程中有特殊作用。细胞工程中有特殊作用。n生殖细胞的分离生殖细胞的分离 (1)一步渗透压冲击法一步渗透压冲击法 花粉置于低渗蔗糖溶液中保温一段时间后，花粉置于低渗蔗糖溶液中保温一段时间后，花粉自行破裂，生殖细胞随营养细胞质流花粉自行破裂，生殖细胞随营养细胞质流出。棉花出。棉花(2)二步渗透压冲击法二步渗透压冲击法 花粉置于等渗蔗糖溶液中培养，当大部分花花粉置于等渗蔗糖溶液中培养，当大部分花粉开始萌发时，加入蒸馏水使渗透压骤降，粉开始萌发时，加入蒸馏水使渗透压骤降，导致花粉破裂释放生殖细胞。导致花粉破裂释放生
26、殖细胞。石蒜、风雨花、玉帘、烟草、凤仙花、蚕豆石蒜、风雨花、玉帘、烟草、凤仙花、蚕豆(3)低酶法低酶法 花粉在低浓度酶花粉在低浓度酶(一般为一般为01纤维素酶与纤维素酶与01果胶酶果胶酶)与低渗蔗糖溶液中保温，促与低渗蔗糖溶液中保温，促使花粉破裂释放生殖细胞。使花粉破裂释放生殖细胞。黄花菜、韭菜、朱顶红、唐菖蒲、鸢尾黄花菜、韭菜、朱顶红、唐菖蒲、鸢尾 (4)花粉原生质体释放法花粉原生质体释放法 首先分离出花粉原生质体，然后用渗透压冲首先分离出花粉原生质体，然后用渗透压冲击法或机械法，使花粉原生质体破裂，获得击法或机械法，使花粉原生质体破裂，获得生殖细胞。生殖细胞。鸢尾、唐菖蒲、朱顶红、风雨花等
27、。鸢尾、唐菖蒲、朱顶红、风雨花等。n精细胞的分离精细胞的分离 三细胞花粉三细胞花粉 二细胞花粉二细胞花粉(1)三细胞花粉的精细胞分离方法三细胞花粉的精细胞分离方法研磨法：研磨法：用玻璃匀浆器轻轻研磨花粉悬浮液，用玻璃匀浆器轻轻研磨花粉悬浮液，使花粉壁破碎，释放出精细胞。使花粉壁破碎，释放出精细胞。甘蓝型油菜、甘蓝、紫菜苔、非洲菊、菠菜甘蓝型油菜、甘蓝、紫菜苔、非洲菊、菠菜渗透压冲击法渗透压冲击法：将花粉置于低渗溶液中，使花：将花粉置于低渗溶液中，使花粉自行破裂。白花丹、玉米、小麦、甜菜粉自行破裂。白花丹、玉米、小麦、甜菜(2)二细胞花粉的精细胞分离二细胞花粉的精细胞分离 活体活体-离体法：将花
28、粉授于柱头上，切下一定离体法：将花粉授于柱头上，切下一定长度的花柱插入液体培养基中。当花粉管由长度的花柱插入液体培养基中。当花粉管由花柱切口中长出后，用渗透压冲击或酶液处花柱切口中长出后，用渗透压冲击或酶液处理，促使花粉管尖端破裂释放精细胞。理，促使花粉管尖端破裂释放精细胞。杜鹃花、唐菖蒲、鸢尾、棉花、朱顶红、烟杜鹃花、唐菖蒲、鸢尾、棉花、朱顶红、烟草、黄花菜、萱草、草、黄花菜、萱草、n离体萌发法：花粉置于培养基中人工萌发，离体萌发法：花粉置于培养基中人工萌发，待生殖细胞在花粉管中已分裂形成精细胞之待生殖细胞在花粉管中已分裂形成精细胞之后，用渗透压冲击等方法使花粉管破裂，释后，用渗透压冲击等方
29、法使花粉管破裂，释放出精细胞。放出精细胞。3、胚囊内成员细胞的分离、胚囊内成员细胞的分离 一般先用人工解剖法除去子房壁，然后以胚珠一般先用人工解剖法除去子房壁，然后以胚珠为单位分离出胚囊，再由胚囊分离出其成员为单位分离出胚囊，再由胚囊分离出其成员细胞。细胞。n酶法酶法 胚珠置于酶液中酶解，使珠被与珠心胚珠置于酶液中酶解，使珠被与珠心细胞离散，裸露出胚囊。一般需在酶解的基细胞离散，裸露出胚囊。一般需在酶解的基础上，适当辅加机械处理，如吸打、压片或础上，适当辅加机械处理，如吸打、压片或解剖，以提高分离胚囊的效果。解剖，以提高分离胚囊的效果。n解剖法解剖法 应用显微操作器直接解剖胚囊及其成应用显微操
30、作器直接解剖胚囊及其成员细胞，技术上较难，效率较低。员细胞，技术上较难，效率较低。二、原生质体体培养二、原生质体体培养1、花粉原生质体的培养花粉原生质体的培养 花粉原生质体也有配子体发育与孢子体发育花粉原生质体也有配子体发育与孢子体发育两条途径。两条途径。成熟花粉原生质体培养能够萌发出花粉管，其成熟花粉原生质体培养能够萌发出花粉管，其中生殖细胞分裂形成精细胞，表现出配子体中生殖细胞分裂形成精细胞，表现出配子体发育的趋势。发育的趋势。n2、生殖细胞培养生殖细胞培养 吴新莉与周嫦将分离的黄花菜生殖细胞在含吴新莉与周嫦将分离的黄花菜生殖细胞在含多种附加物以及花药作为饲养物的多种附加物以及花药作为饲养
31、物的MS琼脂培琼脂培养基中离体培养，部分细胞发生养基中离体培养，部分细胞发生1-2次核分裂，次核分裂，形成形成24核的细胞。平均分裂率为核的细胞。平均分裂率为327，最高分裂率达最高分裂率达1146。3、胚囊与卵细胞培养胚囊与卵细胞培养 最近，最近，Holm等培养大麦受精的卵细胞，发等培养大麦受精的卵细胞，发生了细胞分裂。单独的受精卵培养能够发育生了细胞分裂。单独的受精卵培养能够发育到小愈伤组织；用大麦小孢子作饲养物，受到小愈伤组织；用大麦小孢子作饲养物，受精卵能发育成胚状体，最后达到成熟植株，精卵能发育成胚状体，最后达到成熟植株，开花结实。开花结实。三、原生质体融合三、原生质体融合1、性细胞
32、与体细胞之间的融合性细胞与体细胞之间的融合 1986年首次报道粘毛烟草四分体原生质年首次报道粘毛烟草四分体原生质体和普通烟草硝酸还原酶缺陷型的叶肉原生体和普通烟草硝酸还原酶缺陷型的叶肉原生质体的融合及其融合体再生植株。质体的融合及其融合体再生植株。n最近，在幼嫩花粉原生质体分离成功的基础最近，在幼嫩花粉原生质体分离成功的基础上，游离时期的花粉原生质体与体细胞原生上，游离时期的花粉原生质体与体细胞原生质体的融合获得成功。质体的融合获得成功。李昌功等李昌功等 青菜幼嫩花粉原生质体青菜幼嫩花粉原生质体*甘蓝型油菜下胚轴原甘蓝型油菜下胚轴原生质体融合了生质体融合了 小植株。小植株。2、性细胞与性细胞之
33、间的融合性细胞与性细胞之间的融合 性性融合有多种组合，其中以精卵融合工作性性融合有多种组合，其中以精卵融合工作进展最快，是当前研究的热点。进展最快，是当前研究的热点。n Kranz等曾首次报道用微电融合技术诱导了等曾首次报道用微电融合技术诱导了玉米单个精细胞与单个卵细胞成对融合，融玉米单个精细胞与单个卵细胞成对融合，融合体在离体条件下发生细胞分裂，形成多细合体在离体条件下发生细胞分裂，形成多细胞结构。由胞结构。由28个融合体培养再生了个融合体培养再生了11个植株个植株.n 一个新的发展趋势是采用非电融合诱导精卵一个新的发展趋势是采用非电融合诱导精卵融合。非电融合方式，比较接近体内受精条件，融合
34、。非电融合方式，比较接近体内受精条件，有利于研究受精理论。有利于研究受精理论。n低浓度低浓度CaCl25mmol溶液进行玉米精卵融合。溶液进行玉米精卵融合。融合率达融合率达797。他们用玉米卵细胞、精细。他们用玉米卵细胞、精细胞与叶肉原生质体为材料，做了各种组合的胞与叶肉原生质体为材料，做了各种组合的融合试验。结果，精卵融合率最高即融合试验。结果，精卵融合率最高即797，表明精卵细胞之间的融合是有特异性的。表明精卵细胞之间的融合是有特异性的。n显微注射显微注射 用显微操作器将分离的精细胞或用显微操作器将分离的精细胞或精核注入胚囊，是体外受精的另一种尝试。精核注入胚囊，是体外受精的另一种尝试。n
35、最近，最近，Mathys-Rochon等将玉米分离的精等将玉米分离的精细胞核注入分离胚囊的卵细胞与中央细胞内。细胞核注入分离胚囊的卵细胞与中央细胞内。细胞学观察显示细胞学观察显示14卵细胞和卵细胞和14中央细中央细胞内含精细胞核。其中有一个卵细胞，雌雄胞内含精细胞核。其中有一个卵细胞，雌雄核接触，进行核的融合。核接触，进行核的融合。n融合体鉴定融合体鉴定 雄性细胞与其它材料融合时，由雄性细胞与其它材料融合时，由于雄性细胞体积很小，很难鉴别融合体。于雄性细胞体积很小，很难鉴别融合体。n吴新莉利用石蒜生殖细胞质呈黄褐色的形态吴新莉利用石蒜生殖细胞质呈黄褐色的形态特征，与花瓣原生质体融合时，能够较好
36、地特征，与花瓣原生质体融合时，能够较好地分辨融合体，但绝大多数生殖细胞与精细胞分辨融合体，但绝大多数生殖细胞与精细胞并无明显形态特征，在此情况下，采用荧光并无明显形态特征，在此情况下，采用荧光染料预先标记雄性细胞的方法，效果很好。染料预先标记雄性细胞的方法，效果很好。n杂种筛选杂种筛选 以四分体与体细胞融合开展以四分体与体细胞融合开展“配子配子-体细体细胞杂交胞杂交”时，由于四分体不能单独发育，因此，筛时，由于四分体不能单独发育，因此，筛选工作中只需阻止体细胞单独的发育即可，比一般选工作中只需阻止体细胞单独的发育即可，比一般体细胞杂交时杂种筛选简便。体细胞杂交时杂种筛选简便。n例如，例如，Pe
37、tal等利用抗卡那霉素显性基因的烟草四等利用抗卡那霉素显性基因的烟草四分体与黄花烟草的体细胞融合，在含卡那霉素培养分体与黄花烟草的体细胞融合，在含卡那霉素培养基上，黄花烟草的体细胞不能发育，只有杂种才能基上，黄花烟草的体细胞不能发育，只有杂种才能发育，取得了良好的筛选效果。发育，取得了良好的筛选效果。n 融合体培养与植株再生融合体培养与植株再生 迄今已实现了多种迄今已实现了多种组合的融合，但融合体培养达到再生植株者组合的融合，但融合体培养达到再生植株者为数不多。性体融合方面，仅在烟草属、矮为数不多。性体融合方面，仅在烟草属、矮牵牛属的四分体与体细胞融合以及芸苔属的牵牛属的四分体与体细胞融合以及
38、芸苔属的幼嫩花粉与体细胞融合中能够再生植株。幼嫩花粉与体细胞融合中能够再生植株。植物生殖工程的问题与展望n在短短的十多年中，植物生殖工程的研究无在短短的十多年中，植物生殖工程的研究无疑已取得巨大成就。雄性生殖系统的再生成疑已取得巨大成就。雄性生殖系统的再生成功，胚珠再生的初步实现，为深入进行花粉功，胚珠再生的初步实现，为深入进行花粉和胚囊的形成和分化的离体研究奠定了基础。和胚囊的形成和分化的离体研究奠定了基础。n 植物生殖工程研究所面临的问题有以下几个植物生殖工程研究所面临的问题有以下几个方面方面n(1)再生整个雌性生殖系统尚未成功再生整个雌性生殖系统尚未成功 n(2)合子至原胚的离体培养困难合子至原胚的离体培养困难n(3)基因型的局限基因型的局限n(4)植物激素的作用机制植物激素的作用机制 n(5)活胚囊、生殖细胞、精子的大量分离和活胚囊、生殖细胞、精子的大量分离和培养技术培养技术