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1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。基因组DNA的提取-第六章基因组DNA的提取第一节概述基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交(包括RFLP)及PCR分离基因等。利用基因组DNA较长的特性,可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中,可用玻棒将其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部,从而达到提取的目的。在提取过程中,染色体会发生机械断裂,产生大小不同的片段,因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作,如尽量减少酚/氯仿抽
2、提、混匀过程要轻缓,以保证得到较长的DNA。一般来说,构建基因组文库,初始DNA长度必须在100kb以上,否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。而进行RFLP和PCR分析,DNA长度可短至50kb,在该长度以上,可保证酶切后产生RFLP片段(20kb以下),并可保证包含PCR所扩增的片段(一般2kb以下)。不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同;不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法,以获得可用的DNA大分子。尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR反应等有
3、较强的抑制作用,因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时,应考虑除去多糖和酚类物质。本实验以水稻幼苗(禾本科)、李(苹果)叶子、动物肌肉组织和大肠杆菌培养物为材料,学习基因组DNA提取的一般方法。第二节从植物组织提取基因组DNA一、材料水稻幼苗或其它禾本科植物，李（苹果）幼嫩叶子。二、设备移液器，冷冻高速离心机，台式高速离心机，水浴锅，陶瓷研钵，50ml离心管（有盖）及5ml和1.5ml离心管，弯成钩状的小玻棒。三、试剂1、提取缓冲液：100mmol/LTrisCl,pH8.0,20mmol/LEDTA,500mmol/LNaCl,1.5%SDS。2、提取缓冲液：18.6g葡萄糖，6.9g二
4、乙基二硫代碳酸钠，6.0gPVP，240ul巯基乙醇，加水至300ml。3、80:4:16/氯仿:戊醇:乙醇4、RnaseA母液：配方见第一章。5、其它试剂：液氮、异丙醇、TE缓冲液，无水乙醇、70%乙醇、3mol/LNaAc。四、操作步骤：（一）水稻幼苗或其它禾木科植物基因组DNA提取1.在50ml离心管中加入20ml提取缓冲液,60水浴预热。2.水稻幼苗或叶子5-10g,剪碎,在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中,剧烈摇动混匀,60水浴保温30-60分钟(时间长,DNA产量高),不时摇动。3.加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液,颠倒混匀(需带手套,防止损伤皮肤)，室温下静置5-10
5、分钟,使水相和有机相分层(必要时可重新混匀)。4.室温下5000rpm离心5分钟。5.仔细移取上清液至另一50ml离心管,加入1倍体积异丙醇,混匀,室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。6.在1.5mleppendorf中加入1mlTE。用钩状玻璃棒捞出DNA絮团,在干净吸水纸上吸干,转入含TE的离心管中,DNA很快溶解于TE。7.如DNA不形成絮状沉淀,则可用5000rpm离心5分钟,再将沉淀移入TE管中。这样收集的沉淀,往往难溶解于TE,可在60水浴放置15分钟以上，以帮助溶解。8.将DNA溶液3000rpm离心5分钟,上清液倒入干净的5ml离心管。9.加入5lRNaseA(10g/l),3
6、710分钟,除去RNA(RNA对DNA的操作、分析一般无影响，可省略该步骤）。10.加入1/10体积的3mol/LNaAc及2体积的冰乙醇,混匀,-20放置20分钟左右,DNA形成絮状沉淀。11.用玻棒捞出DNA沉淀,70%乙醇漂洗,再在干净吸水纸上吸干。12.将DNA重溶解于1mlTE,-20贮存。13.取2lDNA样品在0.7%Agarose胶上电泳,检测DNA的分子大小。同时取15l稀释20倍,测定OD260/OD280,检测DNA含量及质量。注意5g样品可保证获得500gDNA,足供RFLP、PCR等分析之用。（二）.从李(苹果)叶子提取基因组DNA1.取3-5克嫩叶,液氮磨成粉状。2
7、.加入提取缓冲液10ml,再研磨至溶浆状。10000rpm,10min。3.去上清液,沉淀加提取液20ml,混匀。65,30-60min,常摇动。4.同本节（一）中步骤3-13操作。第三节从动物组织提取基因组DNA一、材料哺乳动物新鲜组织。二、设备移液管、高速冷冻离心机、台式离心机、水浴锅。三、试剂1、分离缓冲液：10mmol/LTrisClpH7.4,10mmol/LNaCl,25mmol/LEDTA。2、其它试剂：10%SDS，蛋白酶K(20mg/ml或粉剂)，乙醚，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，无水乙醇及70%乙醇，5mol/LNaCl，3mol/LNaAc，TE。四、操作步骤:1
8、.切取组织5g左右,剔除结缔组织,吸水纸吸干血液,剪碎放入研钵(越细越好)。2.倒入液氮,磨成粉末,加10ml分离缓冲液。3.加1ml10%SDS,混匀,此时样品变得很粘稠。4.加50ul或1mg蛋白酶K,37保温1-2小时,直到组织完全解体。5.加1ml5mol/LNaCl,混匀,5000rpm离心数秒钟。6.取上清液于新离心管，用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提。待分层后,3000rpm离心5分钟。7.取上层水相至干净离心管,加2倍体积乙醚抽提(在通风情况下操作)。8.移去上层乙醚,保留下层水相。9.加1/10体积3mol/LNaAc,及2倍体积无水乙醇颠倒混合沉淀DNA。室温
9、下静止10-20分钟，DNA沉淀形成白色絮状物。10.用玻棒钩出DNA沉淀,70%乙醇中漂洗后,在吸水纸上吸干,溶解于1mlTE中,-20保存。11.如果DNA溶液中有不溶解颗粒,可在5000rpm短暂离心,取上清;如要除去其中的RNA,可加5lRNaseA(10g/l),37保温30分钟,用酚抽提后,按步骤9-10重沉淀DNA。第四节细菌基因组DNA的制备一、材料细菌培养物。二、设备移液管,高速冷冻离心机,台式离心机，水浴锅。三、试剂1、CTAB/NaCl溶液：4.1gNaCl溶解于80mlH2O,缓慢加入10gCTAB,加水至100ml。2、其它试剂：氯仿:异戊醇(24:1)，酚:氯仿:异
10、戊醇(25:24:1)，异丙醇，70%乙醇，TE，10%SDS，蛋白酶K(20mg/ml或粉剂)，5mol/LNaCl。四、操作步骤：1.100ml细菌过夜培养液,5000rpm离心10分钟,去上清液。2.加9.5mlTE悬浮沉淀,并加0.5ml10%SDS,50l20mg/ml(或1mg干粉)蛋白酶K,混匀,37保温1小时。3.加1.5ml5mol/LNaCl,混匀。4.加1.5mlCTAB/NaCl溶液,混匀,65保温20分钟。5.用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提,5000rpm离心10分钟,将上清液移至干净离心管。6.用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提,取上清液移至干净管
11、中。7.加1倍体积异丙醇,颠倒混合,室温下静止10分钟，沉淀DNA。8.用玻棒捞出DNA沉淀,70%乙醇漂洗后,吸干,溶解于1mlTE,-20保存。如DNA沉淀无法捞出,可5000rpm离心,使DNA沉淀。9.如要除去其中的RNA,可以按本章第三节中操作步骤处理。第五节基因组DNA的检测上述方法得到的DNA一般可以用作Southern,RFLP、PCR等分析。由于所用材料的不同,得到的DNA产量及质量均不同,有时DNA中含有酚类和多糖类物质,会影响酶切和PCR的效果。所以获得基因组DNA后,均需检测DNA的产量和质量。1.DNA溶液稀释20-30倍后,测定OD260/OD280比值,明确DNA
12、的含量和质量。2.取2-5l在0.7%agarose胶上电泳,检测DNA的分子大小。3.取2gDNA,用10单位(U)Hind酶切过夜,0.7%agarose胶上电泳,检测能否完全酶解(做RFLP,DNA必须完全酶解)。如果DNA中所含杂质多,不能完全酶切,或小分子DNA多,影响接续的分析和操作,可以用下列方法处理：（1）选用幼嫩植物组织，可减少淀粉类的含量。（2）酚:氯仿抽提,去除蛋白质和多糖。（3）Sepharose柱过滤,去除酚类、多糖和小分子DNA。（4）CsCl梯度离心,去除杂质,分离大片段DNA(可用作文库构建)。第七章RFLP和RAPD技术第一节概述DNA分子水平上的多态性检测技
13、术是进行基因组研究的基础。RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphism,限制片段长度多态性)已被广泛用于基因组遗传图谱构建、基因定位以及生物进化和分类的研究。RFLP是根据不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失，导致酶切片段大小发生了变化，这种变化可以通过特定探针杂交进行检测，从而可比较不同品种（个体）的DNA水平的差异（即多态性），多个探针的比较可以确立生物的进化和分类关系。所用的探针为来源于同种或不同种基因组DNA的克隆，位于染色体的不同位点，从而可以作为一种分子标记(Mark)，构建分子图谱
14、。当某个性状（基因）与某个（些）分子标记协同分离时，表明这个性状（基因）与分子标记连锁。分子标记与性状之间交换值的大小，即表示目标基因与分子标记之间的距离，从而可将基因定位于分子图谱上。分子标记克隆在质粒上，可以繁殖及保存。不同限制性内切酶切割基因组DNA后，所切的片段类型不一样，因此，限制性内切酶与分子标记组成不同组合进行研究。常用的限制性内切酶一般是Hind，BamH,EcoR,EcoRV,Xba,而分子标记则有几个甚至上千个。分子标记越多，则所构建的图谱就越饱和。构建饱和图谱是RFLP研究的主要目标之一。运用随机引物扩增寻找多态性DNA片段可作为分子标记。这种方法即为RAPD(Rando
15、mamplifiedpolymorphicDNA，随机扩增的多态性DNA)。尽管RAPD技术诞生的时间很短,但由于其独特的检测DNA多态性的方式以及快速、简便的特点,使这个技术已渗透于基因组研究的各个方面。该RAPD技术建立于PCR技术基础上,它是利用一系列(通常数百个)不同的随机排列碱基顺序的寡聚核苷酸单链(通常为10聚体)为引物,对所研究基因组DNA进行PCR扩增.聚丙烯酰胺或琼脂糖电泳分离,经EB染色或放射性自显影来检测扩增产物DNA片段的多态性,这些扩增产物DNA片段的多态性反映了基因组相应区域的DNA多态性。RAPD所用的一系列引物DNA序列各不相同,但对于任一特异的引物,它同基因组
16、DNA序列有其特异的结合位点.这些特异的结合位点在基因组某些区域内的分布如符合PCR扩增反应的条件,即引物在模板的两条链上有互补位置,且引物3端相距在一定的长度范围之内,就可扩增出DNA片段.因此如果基因组在这些区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变就可能导致这些特定结合位点分布发生相应的变化,而使PCR产物增加、缺少或发生分子量的改变。通过对PCR产物检测即可检出基因组DNA的多态性。分析时可用的引物数很大,虽然对每一个引物而言其检测基因组DNA多态性的区域是有限的,但是利用一系列引物则可以使检测区域几乎覆盖整个基因组。因此RAPD可以对整个基因组DNA进行多态性检测。另外，RAPD片段克隆
17、后可作为RFLP的分子标记进行作图分析。本实验将学习RFLP的酶切,电泳和膜的制作以及RAPD技术。探针标记及杂交检测方法请另详见分子杂交技术。第二节RFLP技术一、材料基因组DNA(大于50kb,分别来自不同的材料)。二、设备电泳仪及电泳槽，照相用塑料盆5只，玻璃或塑料板(比胶块略大)4块，吸水纸若干，尼龙膜(依胶大小而定)，滤纸，eppendorf管(0.5ml)若干。三、试剂：1、限制性内切酶(BamH,EcoR,Hind,Xba)及10酶切缓冲液。2、5TBE电泳缓冲液：配方见第一章。3、变性液：0.5mol/LNaOH，1.5mol/LNaCl。4、中和液：1mol/LTrisCl,
18、pH7.5/1.5mol/LNaCl。5、10SSC：配方见第九章。6、其它试剂：0.4mol/LNaOH，0.2mol/LTrisCl,pH7.5/2SSC，ddH2O，Agarose0.8%，0.25mol/LHCl。四.操作步骤1.基因组DNA的酶解(1)大片断DNA的提取详见基因组DNA提取实验,要求提取的DNA分子量大于50kb,没有降解。(2)在50l反应体系中,进行酶切反应:5g基因组DNA5l10酶切缓冲液20单位（U）限制酶(任意一种)加ddH2O,至50l(3)轻微振荡,离心,37反应过夜。(4)取5l反应液,0.8琼脂糖电泳观察酶切是否彻底，这时不应有大于30kb的明显亮
19、带出现。注意未酶切的DNA要防止发生降解,酶切反应一定要彻底。2.Southern转移（1）酶解的DNA经0.8琼脂糖凝胶电泳(可18V过夜)后EB染色观察。（2）将凝胶块浸没于0.25mol/LHCl中脱嘌呤,10分钟。（3）取出胶块,蒸馏水漂洗,转至变性液变性45分钟。经蒸馏水漂洗后转至中和液中和30分钟。（4）预先将尼龙膜,滤纸浸入水中,再浸入10SSC中,将一玻璃板架于盆中铺一层滤纸(桥)然后将胶块反转放置,盖上尼龙膜,上覆二层滤纸,再加盖吸水纸,压上半公斤重物,以10SSC盐溶液吸印,维持18-24小时。也可用电转移或真空转移。（5）取下尼龙膜,0.4mol/LNaOH30秒,迅速转
20、至0.2mol/LTrisCl,pH7.5/2SSC,溶液中,5分钟。（6）将膜夹于2层滤纸内,80真空干燥2小时。（7）探针的制备和杂交见第九章分子杂交部分。注意1、步骤（2）中脱嘌呤时间不能过长。2、除步骤（1）、（4）、（5）外,其余均在摇床上进行操作。3、步骤（4）中,当尼龙膜覆于胶上时,绝对防止胶与膜之间有气泡发生,加盖滤时也不应有气泡发生。4、有时用一种限制性内切酶不能发现RFLP的差异，这时应该试用另一种酶。第三节RAPD技术一、材料不同来源的DNA(50ng/ul)。二、设备PCR仪，PCR管或硅化的0.5mleppendorf管，电泳装置。三、试剂1、随机引物(10mer)(
21、5umol/L)：购买成品。2、Taq酶：购买成品。3、10xPCR缓冲液：配方见第八章。4、MgCl2：25mmol/L。5、dNTP：每种2.5mmol/L。四、操作步骤：1.在25ul反应体系中,加入模板DNA1ul(50ng)随机引物1ul(约5pmol)10xPCRBuffer2.5ulMgCl22uldNTP2ulTaq酶1单位（U）加ddH2O至25ul混匀稍离心,加一滴矿物油。2.在加热至90以上的PCR仪中预变性942分钟,然后循环:941分钟，361分钟，721分钟，共40轮循环。3.循环结束后,7210分钟，4保存。4.取PCR产物15ul加3ul上样缓冲液(6x)于2%
22、琼脂糖胶上电泳,稳压50-100（电压低带型整齐，分辨率高）。5.电泳结束，观察、拍照。注意1、电泳时一般RAPD带有5-15条,大小0.1-2.0kb。2、特异性的DNA带可以克隆作为一个新的分子标记应用。第八章聚合酶链式反应(PCR)扩增和扩增产物克隆第一节概述PCR(PolymeraseChainReaction,聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法.它包括三个基本步骤:(1)变性(Denature):目的双链DNA片段在94下解链;(2)退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对;(3)延伸(Extension):在T
23、aqDNA聚合酶合成DNA的最适温度下,以目的DNA为模板进行合成.由这三个基本步骤组成一轮循环,理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍（图4）,这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板,所以经25-35轮循环就可使DNA扩增达106倍。一、PCR反应中的主要成份1.引物：PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。引物的好坏往往是PCR成败的关键。引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则：(1)引物长度约为16-30bp，太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。太长则比较浪费,且难以合成。(2)引物中G+C含量通常为40%-60%,可按下式粗略估计引物的解链
24、温度Tm4(G+C)+2(A+T).(3)四种碱基应随机分布，在3端不存在连续3个G或C,因这样易导致错误引发。(4)引物3端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应,以减少由于密码子摆动产生的不配对。(5)在引物内,尤其在3端应不存在二级结构。两引物之间尤其在3端不能互补,以防出现引物二聚体,减少产量。两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性。(7)引物5端对扩增特异性影响不大,可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等.通常应在5端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。引物不与模板结合位点以外的序列互补。所扩增
25、产物本身无稳定的二级结构,以免产生非特异性扩增,影响产量。(9)简并引物应选用简并程度低的密码子,例如选用只有一种密码子的Met,3端应不存在简并性。否则可能由于产量低而看不见扩增产物。一般PCR反应中的引物终浓度为0.2-1.0mol/L。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体,过低则降低产量。利用紫外分光光度计,可精确计算引物浓度,在1cm光程比色杯中,260nm下,引物浓度可按下式计算：Xmol/LOD260/A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600)X:引物摩尔浓度,A、C、G、T:引物中4种不同碱基个数。2.4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)：dNTP应用Na
26、OH将pH调至7.0,并用分光光度计测定其准确浓度.dNTP原液可配成5-10mmol/L并分装,-20贮存。一般反应中每种dNTP的终浓度为20-200mol/L。理论上4种dNTP各20mol/L,足以在100l反应中合成2.6g的DNA。当dNTP终浓度大于50mmol/L时可抑制TaqDNA聚合酶的活性.4种dNTP的浓度应该相等,以减少合成中由于某种dNTP的不足出现的错误掺入。3.Mg2+：Mg2+浓度对TaqDNA聚合酶影响很大,它可影响酶的活性和真实性,影响引物退火和解链温度,影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。通常Mg2+浓度范围为0.5-2mmol/L.对于一种新的PC
27、R反应,可以用0.1-5mmol/L的递增浓度的Mg2+进行预备实验,选出最适的Mg2+浓度。在PCR反应混合物中,应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团,例如磷酸基团或EDTA等可能影响Mg2+离子浓度的物质,以保证最适Mg2+浓度。4.模板：PCR反应必须以DNA为模板进行扩增,模板DNA可以是单链分子,也可以是双链分子,可以是线状分子,也可以是环状分子(线状分子比环状分子的扩增效果稍好).就模板DNA而言,影响PCR的主要因素是模板的数量和纯度.一般反应中的模板数量为102-105个拷贝,对于单拷贝基因,这需要0.1g的人基因组DNA,10ng的酵母DNA,1ng的大肠杆菌DNA.扩增多拷贝
28、序列时,用量更少.灵敏的PCR可从一个细胞,一根头发,一个孢子或一个精子提取的DNA中分析目的序列.模板量过多则可能增加非特异性产物.DNA中的杂质也会影响PCR的效率。5.TaqDNA聚合酶：一般TaqDNA聚合酶活性半衰期为92.5130min,9540min,975min.现在人们又发现许多新的耐热的DNA聚合酶,这些酶的活性在高温下活性可维持更长时间.TaqDNA聚合酶的酶活性单位定义为74下,30min,掺入10nmol/LdNTP到核酸中所需的酶量.TaqDNA聚合酶的一个致命弱点是它的出错率,一般PCR中出错率为210-4核苷酸/每轮循环,在利用PCR克隆和进行序列分析时尤应注意
29、.在100lPCR反应中,1.5-2单位的TaqDNA聚合酶就足以进行30轮循环.所用的酶量可根据DNA、引物及其它因素的变化进行适当的增减.酶量过多会使产物非特异性增加,过少则使产量降低.反应结束后,如果需要利用这些产物进行下一步实验,需要预先灭活TaqDNA聚合酶,灭活TaqDNA聚合酶的方法有：(1)PCR产物经酚:氯仿抽提,乙醇沉淀。(2)加入10mmol/L的EDTA螯合Mg2+。(3)99-100加热10min.目前已有直接纯化PCR产物的Kit可用。6.反应缓冲液：反应缓冲液一般含10-50mmol/LTrisCl(20下pH8.3-8.8),50mmol/LKCl和适当浓度的M
30、g2+.TrisCl在20时pH为8.3-8.8,但在实际PCR反应中,pH为6.8-7.8.50mmol/L的KCl有利于引物的退火.另外,反应液可加入5mmol/L的二硫苏糖醇(DDT)或100g/ml的牛血清白蛋白(BSA),它们可稳定酶活性,另外加入T4噬菌体的基因32蛋白则对扩增较长的DNA片段有利.各种TaqDNA聚合酶商品都有自己特定的一些缓冲液。二、PCR反应参数1.变性：在第一轮循环前,在94下变性5-10min非常重要,它可使模板DNA完全解链,然后加入TaqDNA聚合酶(hotstart),这样可减少聚合酶在低温下仍有活性从而延伸非特异性配对的引物与模板复合物所造成的错误
31、。变性不完全,往往使PCR失败,因为未变性完全的DNA双链会很快复性,减少DNA产量.一般变性温度与时间为941min。在变性温度下,双链DNA解链只需几秒钟即可完全,所耗时间主要是为使反应体系完全达到适当的温度。对于富含GC的序列,可适当提高变性温度.但变性温度过高或时间过长都会导致酶活性的损失。2.退火：引物退火的温度和所需时间的长短取决于引物的碱基组成，引物的长度、引物与模板的配对程度以及引物的浓度.实际使用的退火温度比扩增引物的Tm值约低5。一般当引物中GC含量高,长度长并与模板完全配对时,应提高退火温度。退火温度越高,所得产物的特异性越高。有些反应甚至可将退火与延伸两步合并,只用两种
32、温度(例如用60和94)完成整个扩增循环,既省时间又提高了特异性。退火一般仅需数秒钟即可完成,反应中所需时间主要是为使整个反应体系达到合适的温度。通常退火温度和时间为37-55,1-2min。3.延伸：延伸反应通常为72,接近于TaqDNA聚合酶的最适反应温度75.实际上,引物延伸在退火时即已开始,因为TaqDNA聚合酶的作用温度范围可从20-85.延伸反应时间的长短取决于目的序列的长度和浓度.在一般反应体系中,TaqDNA聚合酶每分钟约可合成2kb长的DNA。延伸时间过长会导致产物非特异性增加.但对很低浓度的目的序列,则可适当增加延伸反应的时间。一般在扩增反应完成后,都需要一步较长时间(10
33、-30min)的延伸反应,以获得尽可能完整的产物,这对以后进行克隆或测序反应尤为重要。4.循环次数：当其它参数确定之后,循环次数主要取决于DNA浓度。一般而言25-30轮循环已经足够。循环次数过多,会使PCR产物中非特异性产物大量增加。通常经25-30轮循环扩增后,反应中TaqDNA聚合酶已经不足,如果此时产物量仍不够,需要进一步扩增,可将扩增的DNA样品稀释103-105倍作为模板,重新加入各种反应底物进行扩增,这样经60轮循环后,扩增水平可达109-1010。扩增产物的量还与扩增效率有关,扩增产物的量可用下列公式表示:CC0(1+P)n。其中：C为扩增产物量,C0为起始DNA量,P为增效率
34、,n为循环次数。在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。平台期会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增，达到较高水平。因此，应适当调节循环次数，在平台期前结束反应，减少非特异性产物。三、PCR产物的克隆在许多研究中,需要将PCR产物克隆,以获得目的DNA片段。此时,所用PCR循环数应尽量小,以减少平台效应或非特异性扩增产物的干扰。通常将PCR产物插入到载体中有下列一些方法。1.平末端连接：由于TaqDNA聚合酶往往在PCR产物3端加上多余的非模板依赖碱基,在用平末端连接克隆PCR产物前,可用Klenow片段或T4
35、DNA聚合酶处理补平末端。2.在PCR产物尾部加dT或ddT：TaqDNA聚合酶会在3端加上多余的非模板依赖碱基,而且对A优先聚合,所以PCR产物末端的多余碱基大部分都是A.。利用这一特点,可以经限制酶切割产生的平末端用酶加上dT或ddT,使载体与PCR产物末端互补并进行连接.载体末端加dT尾可直接用TaqDNA聚合酶和dTTP或ddTTP,ddTTP因缺少3-OH而不能再形成磷酸二酯键,保证在载体3端只加上一个ddTTP,而其5端所含的磷酸基团可与PCR产物的3端OH连接,连接产物在载体和PCR产物之间的双链上带两个切口,这种重组DNA仍可转化合适的受体菌,并在细菌体内修复.目前一些公司已开
36、发出可直接用于克隆PCR产物的带3-T的T-Vector。3.粘性末端连接：利用引物中附加在5端的限制酶位点,直接将PCR产物经适当的限制酶切割后产生粘性末端,与载体连接,产生重组DNA.如果下游两个引物中含有两个不同的限制酶位点.经酶切后定向克隆到载体中。第二节材料、设备及试剂一、材料不同来源的模板DNA。二、设备移液器及吸头，硅烷化的PCR小管，DNA扩增仪(PE公司)，琼脂糖凝胶电泳所需设备(电泳槽及电泳仪)，台式高速离心机。三、试剂：1、10PCR反应缓冲液：500mmol/LKCl,100mmol/LTrisCl,在25下,pH9.0,1.0TritonX-100。2、MgCl2：2
37、5mmol/L。3、4种dNTP混合物:每种2.5mmol/L。4、TaqDNA聚合酶5U/l。5、T4DNA连接酶及连接缓冲液：配方见第五章。6、经Sma酶切和加dT的pUC质粒。7、其它试剂：矿物油（石蜡油），1%琼脂糖，5TBE，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，无水乙醇和70乙醇。第三节操作步骤一、PCR反应1.依次混匀下列试剂35lH2O5l10PCR反应缓冲液4l25mmol/LMgCl24l4种dNTP0.5l上游引物（引物）0.5l下游引物（引物）0.5l模板DNA(约1ng)混匀后离心5秒。2.将混合物在94下加热5分钟后冰冷,迅速离心数秒,使管壁上液滴沉至管底,加入Taq
38、DNA聚合酶（0.5l约2.5U），混匀后稍离心,加入一滴矿物油覆盖于反应混合物上。3.用94变性1分钟，45退火1分钟,72延伸2分钟,循环35轮,进行PCR。最后一轮循环结束后,于72下保温10分钟，使反应产物扩增充分。二、电泳按第二章所述,取10l扩增产物用1琼脂糖凝胶进行电泳分析,检查反应产物及长度。三、PCR产物的纯化扩增的PCR产物如利用T-Vector进行克隆，可直接使用，如用平未端或粘性未端连接，往往需要将产物纯化。（一）酚/氯仿法1.取反应产物加100lTE.。2.加等体积氯仿混匀后用微型离心机10000rpm离心15秒,用移液器将上层水相吸至新的小管中.这样抽提一次,可除去
39、覆盖在表面的矿物油。3.再用酚:氯仿:异戊醇抽提二次,每次回收上层水相。4.在水相中加300l95乙醇,置-20下30min沉淀。5.在小离心机上10000rpm离心10min,吸净上清液。加入1ml70乙醇,稍离后,吸净上清液.重复洗涤沉淀2次。将沉淀溶于7mlddH2O中，待用。（二）WizardPCRDNA纯化系统WizardPCRDNA纯化系统可以快速、有效、可靠地提取PCR扩增液中的DNA，提纯后的DNA可用于测序、标记、克隆等。该系统中含有的试剂和柱子可供50次PCR产物的纯化，试剂包括：50mlWizardPCRDNA纯化树脂5ml直接提取缓冲液50支Wizard微型柱1、吸取P
40、CR反应液水相放于1.5mleppendorf管中。2、加100ml直接提取缓冲液，涡旋混匀。3、加1mlPCRDNA纯化树脂，1分钟内涡旋混合3次。4、取一次性注射器,取出注塞,并使注射筒与Wizard微型柱连接,用移液枪将上述混合液加入注射筒中,并用注塞轻推,使混合物进入微型柱。5、将注射器与微型柱分开,取出注塞,再将注射筒与微型柱相连,加入2ml80%异丙醇，对微型柱进行清洗。6、取出微型柱置于eppendorf管中,12000g离心20秒，以除去微型柱中的洗液。7、将微型柱放在一个新eppendorf管中，加50lTE或水，静止1分钟后，12000g离心20秒。8、丢弃微型柱，eppe
41、ndorf管中的溶液即为纯化DNA，存放于4或-20。注意1、纯化树脂在使用前必须充分混匀。2、PCR产物中矿物油应尽量吸去，否则会影响提取DNA的产量。四、载体加dT尾1.将1gpUC19用Sma全酶切。2.在小管中按上述PCR反应,加入各种混合物,除将4l4种dNTP改为4l25mMdTTP。3.加入1l(5U)的TaqDNA聚合酶在72下加热2h。4.按前面三中所述,用酚:氯仿:异戊醇抽提二次。5.加入2倍体积95乙醇,在-20下沉淀1hr。6、离心，用70%乙醇漂洗后，真空抽干，溶于10mlddH2O中。五、PCR产物与载体粘末端连接1、在7mlPCR产物中加1ml带dT尾的pUC质粒
42、。2、加1mlT4DNA连接酶，1ml10连接缓中液，混匀，16连接过夜。3、取5ml连接产物转化感受态细胞并筛选重组子。六、PCR产物3突出端切平及平末端连接1.在50ml的PCR产物中,直接加0.5mlT4DNA聚合酶混匀。2.37反应10分钟后,70灭活10分钟。3.用酚:氯仿抽提2次。4.乙醇沉淀。沉淀用70%乙醇漂洗后，真空抽干，溶于7mlddH2O中。5.质粒用Smal切开后，7015分钟灭活酶，取1ml（约0.1mg）加入上述PCR产物中。加T4DNA连接酶1ml，连接缓冲液1ml。6.取5ml连接产物转化感受态细胞并筛选重组子。注意1.PCR非常灵敏,操作应尽可能在无菌操作台中
43、进行。2.吸头、离心管应高压灭菌,每次吸头用毕应更换,不要互相污染试剂。3.加试剂前,应短促离心10秒钟,然后再打开管盖,以防手套污染试剂及管壁上的试剂污染吸头侧面。4.应设含除模板DNA所有其它成分的负对照。第九章分子杂交技术互补的核苷酸序列通过Walson-Crick碱基配对形成稳定的杂合双链分子DNA分子的过程称为杂交。杂交过程是高度特异性的,可以根据所使用的探针已知序列进行特异性的靶序列检测。杂交的双方是所使用探针和要检测的核酸。该检测对象可以是克隆化的基因组DNA,也可以是细胞总DNA或总RNA。根据使用的方法被检测的核酸可以是提纯的，也可以在细胞内杂交,即细胞原位杂交。探针必须经过
44、标记，以便示踪和检测。使用最普遍的探针标记物是同位素,但由于同位素的安全性，近年来发展了许多非同位素标记探针的方法。核酸分子杂交具有很高的灵敏度和高度的特异性,因而该技术在分子生物学领域中已广泛地使用于克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组中特定基因序列的定性、定量检测和疾病的诊断等方面。因而它不仅在分子生物学领域中具有广泛地应用,而且在临床诊断上的应用也日趋增多。第一节核酸探针标记的方法核酸探针根据核酸的性质，可分为DNA和RNA探针;根据是否使用放射性标记物的与否,可分为放射性标记探针和非放射性标记探针;根据是否存在互补链,可分为单链和双链探针;根据放射性标记物掺入情况,可分为均匀标记和末
45、端标记探针。下面将介绍各种类型的探针及标记方法。一、双链DNA探针及其标记方法分子生物研究中，最常用的探针即为双链DNA探针，它广泛应用于基因的鉴定、临床诊断等方面。双链DNA探针的合成方法主要有下列两种:切口平移法和随机引物合成法。1.切口平移法(nicktranslation)当双链DNA分子的一条链上产生切口时,E.coliDNA聚合酶就可将核苷酸连接到切口的3羟基末端。同时该酶具有从53的核酸外切酶活性,能从切口的5端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同时又在切口的3端补上核苷酸,从而使切口沿着DNA链移动,用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸，将放射性同位素掺入到合成新链中。最合适的切
46、口平移片段一般为50-500个核苷酸。切口平移反应受几种因素的影响:产物的比活性取决于-32PdNTP的比活性和模板中核苷酸被置换的程度。DNA酶的用量和E.coliDNA聚合酶的质量会影响产物片段的大小。DNA模板中的抑制物如琼脂糖会抑制酶的活性,故应使用仔细纯化后的DNA。材料：待标记的DNA。设备：高速台式离心机，恒温水浴锅等。试剂：(1)10切口平移缓冲液:0.5mol/LTrisCl(pH7.2);0.1mol/LMgSO4;10mmol/LDTT;100g/mlBSA。(2)未标记的dNTP原液:除同位素标记的脱氧三磷酸核苷酸外,其余3种分别溶解于50mmol/LTrisCl(pH7.5)溶液中,浓度为0.3mmol/L。(3)-32PdCTP或-32PdATP:400Ci/mmol,10Ci/l。(4)E.coliDNA聚合酶(4单位/l):溶于50g/mlBSA,1mmol/LDT