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1、实验实验14、15、16 微生物的分离微生物的分离计数计数实验目的、要求实验目的、要求（1 1）学学习习并并掌掌握握细细菌菌、放放线线菌菌、真真菌菌等等微微生生物物的的稀释分离计数等技术。稀释分离计数等技术。（2 2）了解）了解3 3大类微生物的培养条件和培养时间。大类微生物的培养条件和培养时间。（3 3）学习平板菌落计数法。）学习平板菌落计数法。以细菌为例以细菌为例以细菌为例以细菌为例实验原理实验原理q纯种分离技术是微生物学中重要的基本技术之一。纯种分离技术是微生物学中重要的基本技术之一。分离分离：从混杂的微生：从混杂的微生物群体中获得单一菌株纯培养的方法。物群体中获得单一菌株纯培养的方法。
2、纯种（纯培养）纯种（纯培养）：一株菌种或一：一株菌种或一个培养物中所有的细胞或孢子都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代。个培养物中所有的细胞或孢子都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代。q微生物的分离与纯化技术的应用：分离具有特殊功能的微生物、优良菌微生物的分离与纯化技术的应用：分离具有特殊功能的微生物、优良菌种及纯化被污染的菌种等。种及纯化被污染的菌种等。q土壤是微生物的大本营，混杂着大量的微生物，从中分离可得到只含有土壤是微生物的大本营，混杂着大量的微生物，从中分离可得到只含有这一种微生物的纯培养。这一种微生物的纯培养。q稀释分离法稀释分离法有倾注法和涂布法两种；菌种被其他杂菌污染时或混合菌
3、悬有倾注法和涂布法两种；菌种被其他杂菌污染时或混合菌悬液常用液常用划线法划线法进行纯种分离。进行纯种分离。q要获得某种微生物的纯培养，还需提供有利于该微生物生长繁殖的要获得某种微生物的纯培养，还需提供有利于该微生物生长繁殖的最适最适培养基及培养条件培养基及培养条件。q微生物四大类菌的分离培养基、培养温度、培养时间详见微生物四大类菌的分离培养基、培养温度、培养时间详见实验指导书实验指导书表表格。细菌常用牛肉膏蛋白胨培养基，在格。细菌常用牛肉膏蛋白胨培养基，在30-37 30-37 温度下培养温度下培养1-21-2天。天。q平板菌落计数平板菌落计数活菌计数活菌计数0.90.10.1ml0.1ml0
4、.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.9ml分离纯化分离纯化基本流程基本流程实验仪器、材料实验仪器、材料n实验材料实验材料 菌源菌源:土样土样10g;10g;n培养基培养基 牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基;n实验仪器与用具实验仪器与用具1)1)超净工作台、恒温培养箱、酒精灯超净工作台、恒温培养箱、酒精灯2 2）1000ul1000ul及及100ul100ul移液枪、移液枪、1000ul1000ul及及100ul100ul枪头、无菌枪头、无菌1.5ml1.5ml的离心管、离心管架的离心管、离心管架3 3）无菌平皿、涂布棒、接种环）无菌平皿、涂布棒、接种环n实验试剂实
5、验试剂:无菌水无菌水;实验内容实验内容1 1、采土样、采土样:选择肥沃土壤选择肥沃土壤,去表层土去表层土,挖挖5 520cm20cm深度的土壤数深度的土壤数10g,10g,装入已灭菌的牛皮纸袋装入已灭菌的牛皮纸袋,封好袋口封好袋口,带回实验室。带回实验室。2 2、制备土壤稀释液、制备土壤稀释液：称取土样称取土样1.0g1.0g，放入盛，放入盛99ml99ml无菌水的三角瓶中，置无菌水的三角瓶中，置摇床振荡摇床振荡20min20min使土壤均匀分散成为土壤悬液（使土壤均匀分散成为土壤悬液（1010-2-2）。用）。用100ul100ul移液枪从中吸取移液枪从中吸取100ul100ul土壤悬液，注
6、入事先分装有土壤悬液，注入事先分装有900ul900ul无菌水的离心管中，吹吸无菌水的离心管中，吹吸3 3次，振荡均匀（次，振荡均匀（1010-3-3）。）。然后同样方法，配置成稀释度为然后同样方法，配置成稀释度为1010-4-4，1010-5-5的土壤菌悬液。的土壤菌悬液。3、分离、分离1）涂布法）涂布法 用一支用一支新的无菌枪头新的无菌枪头，由，由低浓度开始低浓度开始，从各浓度土壤稀释，从各浓度土壤稀释液中各吸取液中各吸取100ul，对号较均匀对号较均匀地放入已写好稀释度的牛肉地放入已写好稀释度的牛肉蛋白胨培养基平板上，用蛋白胨培养基平板上，用灼烧冷却灼烧冷却后的无菌玻璃涂棒后的无菌玻璃涂
7、棒涂匀涂匀。每个浓度做每个浓度做3个平板（重复）。个平板（重复）。2）倾注法）倾注法 用一支用一支新的无菌枪头新的无菌枪头，由，由低浓度开始低浓度开始，从各浓度土壤稀释，从各浓度土壤稀释液中各吸取液中各吸取100ul，对号较均匀对号较均匀地放入已写好稀释度的空白地放入已写好稀释度的空白无菌平皿中，然后在各平皿中加入无菌平皿中，然后在各平皿中加入已经融化已经融化并冷却到并冷却到45-50的牛肉膏蛋白胨培养基（的牛肉膏蛋白胨培养基（已灭菌已灭菌）12-15ml12-15ml，将培养皿，将培养皿在超净工作台面上轻轻转动，使稀释的菌悬液与融化的培在超净工作台面上轻轻转动，使稀释的菌悬液与融化的培养基养
8、基混合均匀混合均匀，直至培养基凝固直至培养基凝固。注意：无菌操作；用枪头吸取菌悬液时注意注意：无菌操作；用枪头吸取菌悬液时注意“吹打数次吹打数次”确保混匀。确保混匀。4、培养、培养待平板上液体被完全吸收，将平板倒置于待平板上液体被完全吸收，将平板倒置于370C温箱中温箱中培养培养24h；5、菌落计数、菌落计数含菌样品的微生物经稀释分离培养后，每一个活菌细胞可在平板含菌样品的微生物经稀释分离培养后，每一个活菌细胞可在平板上繁殖形成一个肉眼可见的菌落，故可据平板上菌落的数目推算上繁殖形成一个肉眼可见的菌落，故可据平板上菌落的数目推算出每克含菌样品中所含的活菌总数（菌落形成数目）。出每克含菌样品中所
9、含的活菌总数（菌落形成数目）。每克含菌样品中微生物的活细胞数（菌落形成数，每克含菌样品中微生物的活细胞数（菌落形成数，CFU（同一稀释度平板上菌落平均数（同一稀释度平板上菌落平均数 10稀释倍数）稀释倍数）/含菌样品克数含菌样品克数菌落计数规则：菌落计数规则：选择平均菌落数在选择平均菌落数在30300间的平板间的平板1、只有一个稀释度符合，以该稀释度的平均菌落数乘、只有一个稀释度符合，以该稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告；以稀释倍数报告；2、有两个稀释度符合，取决于二者比值（高稀释度的、有两个稀释度符合，取决于二者比值（高稀释度的菌落数除以低稀释度的菌落数的值）：菌落数除以低稀释度的菌落数的
10、值）：1）若）若0.5比值比值2 2，以两稀释度的菌落数乘稀释倍数所，以两稀释度的菌落数乘稀释倍数所得的值的均值报告。得的值的均值报告。2）若）若2比值或比值比值或比值 0.5，则取其中较少的菌落总数进，则取其中较少的菌落总数进行报告。行报告。3、若所有稀释度的菌落平均数均大于、若所有稀释度的菌落平均数均大于300，则按稀释倍数，则按稀释倍数最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告；最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告；4、若所有稀释度的菌落平均数均小于、若所有稀释度的菌落平均数均小于30，则按稀释倍数，则按稀释倍数最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告；最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告；所有菌落数均不在所有菌
11、落数均不在30300间间以最接近以最接近30或或300的平均菌落数乘稀释倍数的平均菌落数乘稀释倍数结果与讨论结果与讨论计算含菌样品中的所含活菌总数计算含菌样品中的所含活菌总数在恒温箱中培养微生物时为何要倒置？在恒温箱中培养微生物时为何要倒置？细菌培养基牛肉膏 3g 蛋白胨 10g NaCl 5g 琼脂 1520g 水 1000ml pH 7.2高氏一号培养基（放线菌分离培养）可溶性淀粉 20g KNO3 1g NaCl 0.5g 琼脂 1520g K2HPO43H2O 0.5gMgSO47H2O 0.5gFeSO47H2O 0.01g水 1000ml pH 7.27.4马丁氏培养基（培养真菌）葡萄糖 10g 蛋白胨 5g 1/3000孟加拉红水溶液 100mlKH2PO4 1gMgSO47H2O 0.5g琼脂 1520g 水 900ml pH 自然灭菌后，待培养基融化后冷却至灭菌后，待培养基融化后冷却至5560C时加入链霉素稀释液，使培时加入链霉素稀释液，使培养基中含链霉素养基中含链霉素30ug/mL.