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1、第五单元 微生物分离纯化及鉴定技术,模块一 微生物纯培养的分离方法,微生物纯种分离,将多种混杂微生物，经某种技术或方法分离成纯种的过程,纯培养（pure culture）,将在实验室条件下从一个细胞或一种细胞群繁殖得到的后代称为纯培养。,微生物样品,多种混杂,某种方法,分散成单个微生物,平板,培养,单菌落,每个菌落为纯种（纯培养）,单菌落转接培养,纯种（纯培养）,微生物纯种分离的原理和方法,单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体，称为菌落。,菌落,一个菌落是一个纯种，也是一个纯培养； 单个微生物只在固体培养基上形成菌落； 在液体
2、培养基中不会形成菌落,同一细菌在不同的培养平板上形成不同的特征菌落,分区划线法（蛇形线法）操作图,第一区划线,第二区划线,第三区划线,一、划线法,分区划线法适用范围： 适用于浓度较大的样品,连续划线法操作图,连续划线法适用范围： 适用于浓度较小的样品,二、稀释平板法,从土壤中分离纯微生物,104/ml,103/ml,102/ml,101/ml,1、稀释倾注分离法,涂布平板法,稀释倒平板法,2、稀释涂布分离法,采用显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以得到纯培养，称为单细胞（单孢子）分离法。,个体较小的微生物需采用显微操作仪,分离难度与细胞或个体的大小成反比,营养琼脂平板上不
3、能形成菌落,较大的微生物可使用毛细管提取,三、单细胞挑取法,五、小滴分离法,Each colony was examined microscopically,四、选择培养基分离法,创造适于目的微生物生长条件,原理,促使目的微生物快速生长呈优势菌,抑制非目的微生物生长,从混杂微生物中分离目的微生物,1、利用选择培养基进行直接分离,选择培养基 只允许特定微生物生长，而同时抑制或阻止其他微生物生长的培养基,土壤,目的菌优势,非目的菌,选择培养基 直接分离,单细胞,选择培养基平板 （含牛奶或酪蛋 白唯一C、N源）,37 培养,目的菌落 菌落周围有透明蛋白水解圈,1、利用选择培养基进行直接分离,例一：分
4、离筛选蛋白酶产生细菌,含牛奶选择培养基目的菌生长平板,营养选择因子：牛奶或酪蛋白,只允许分解利用蛋白质的目的菌生长，淘汰非目的菌 长出的目的菌并不一定是同种细菌，但皆产蛋白酶,例一：分离筛选蛋白酶产生细菌,例二：分离筛选产高温淀粉酶（65）细菌,单细胞,选择培养基平板 （淀粉为唯一C源）,65培养,淀粉水解透明圈,目的菌菌落,选择因子：营养选择因子淀粉 环境选择因子65高温,人为创造一些条件只让所需的微生物生长，在这些条件下，所需要的微生物能有效地与其他微生物进行竞争，在生长能力方面远远超过其他微生物。,2、富集培养法,富集培养是分离微生物菌种最强有力的技术之一,营养选择因子和生理条件选择因子可无穷尽组合，可从自然界选择分离各类特异微生物,例：从土壤中分离能产生半乳糖苷酶的微生物,富集培养,选择培养基分离,目的菌验证,1.接种针 2.接种环 3.接种钩 4.接种锄 5.接种铲6.接种匙 7.接种刀 8.接种刀9.剪刀10.钢钩 11.镊子 12.弹簧接种枪13.接种、枪（日本式）,涂布棒,弹簧接种枪,接种环的灭菌,接种环烧红,接种环稍冷却,接种工具,挑选单个菌落,划线,1、实验台 2、空气,环境条件,