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1、实验七实验七 农杆菌介导的叶盘法转化农杆菌介导的叶盘法转化目的及要求：目的及要求：通过叶盘法将带有报告基因的农杆菌转通过叶盘法将带有报告基因的农杆菌转入烟草中，诱导获得转基因植株。入烟草中，诱导获得转基因植株。了解农杆菌转化植物的原理，掌握农杆了解农杆菌转化植物的原理，掌握农杆菌的培养和侵染植物的方法。菌的培养和侵染植物的方法。二、实验原理二、实验原理 农杆菌重组子中携带经改造的农杆菌重组子中携带经改造的Ti 质粒（含有帮助质粒（含有帮助T-DNA跳到植物染色体上的跳到植物染色体上的Vir 区）和包含区）和包含T-DNA的双元的双元载体载体pBinGUS，质粒，质粒pBinGUS上上T-DNA
2、上插入了报告上插入了报告基因（基因（GUS）和卡那霉素筛选标记基因和卡那霉素筛选标记基因NPTII。叶叶盘盘法法转转化化是是通通过过人人为为在在烟烟草草叶叶片片上上产产生生伤伤口口，侵侵染染时时农农杆杆菌菌吸吸附附于于植植物物的的表表面面伤伤口口部部位位，受受伤伤后后双双子子叶叶植植物物分分泌泌的的酚酚类类化化合合物物透透过过农农杆杆菌菌的的细细胞胞膜膜，活活化化vir区区基基因因，vir区区基基因因的的活活化化，促促使使T-DNA进进行行加加工工和和转转移移。T-DNA进进入入植植物物细细胞胞后后整整合合到到核核DNA上上。共共培培养养可可使使T-DNA上上携携带带的的编编码码抗抗生生素素的
3、的抗抗性性基基因因得得到到表表达达，因因此此，转转化化了了的的烟烟草草外外植植体体可可在在含含有有相相应应抗抗生生素素的的培培养养基基上上生生长。长。植物基因转化受体系统植物基因转化受体系统指用于转化的外植体通过组织培养途径或其他非组织培养指用于转化的外植体通过组织培养途径或其他非组织培养途径，能高效、稳定地再生无性系，并能接受外源途径，能高效、稳定地再生无性系，并能接受外源DNA整整合，对转化选择抗生素敏感的再生系统。合，对转化选择抗生素敏感的再生系统。具备条件：具备条件：（1）高效稳定的再生能力）高效稳定的再生能力（2）较高的遗传稳定性）较高的遗传稳定性（3）具有稳定的外植体来源）具有稳定
4、的外植体来源（4）对选择性抗生素敏感）对选择性抗生素敏感（5）对农杆菌侵染有敏感性）对农杆菌侵染有敏感性外植体的种类外植体的种类叶片、叶柄、子叶、子叶柄叶片、叶柄、子叶、子叶柄茎、花茎、块茎、茎尖分生组织茎、花茎、块茎、茎尖分生组织根根合子胚合子胚成熟种子成熟种子叶盘法转化叶盘法转化双子叶植物双子叶植物以以叶叶片片作作为为外外植植体体，在在叶叶片片上上产产生生伤伤口口，侵侵染染时农杆菌吸附于植物的表面伤口部位时农杆菌吸附于植物的表面伤口部位;受受伤伤后后双双子子叶叶植植物物分分泌泌的的酚酚类类化化合合物物透透过过农农杆杆菌菌的的细细胞胞膜膜，活活化化vir区区基基因因，vir区区基基因因的的活
5、活化化，促促使使T-DNA进进行行加加工工和和转转移移。T-DNA进进入入植植物物细细胞后整合到核胞后整合到核DNA上。上。农杆菌与外植体共培养农杆菌与外植体共培养接种菌体后的外植体培养在诱导愈伤组织的固体培养基上，在外植体细胞分裂、生长的同时，农杆菌在外植体切口面也增殖生长，该两者共同培养过程称之为共培养。是整个转化过程中非常重要的环节。因为农杆菌吸附，T-DNA的转移及整合都在这共培养时期内完成。Events An event is the insertion of a particular transgene into a specific location on a chromosom
6、e.ConceptionsTransformation frequency Independent transgenic plants/inoculated immature embryo or callus.Line The seedlings from one transgenic cell,namely,one independent successfully transformation event,belong to one line,also are called clones.Generation These transgenic seedlings are T0 generat
7、ion seedlings,T0 generation mature seeds are T1 generationMeiosis or pollination is the boundary of different generations.实验仪器、材料和试剂实验仪器、材料和试剂仪器：超净工作台，培养箱，台式离心机，培养皿，加样器仪器：超净工作台，培养箱，台式离心机，培养皿，加样器 及吸头，无菌滤纸；及吸头，无菌滤纸；材料：携带质粒植物表达材料：携带质粒植物表达(pBI121)载体土壤农杆菌载体土壤农杆菌LBA4404 烟草无菌苗烟草无菌苗试剂：试剂：YEB液体培养基（液体培养基（1升）：
8、升）：酵母提取物酵母提取物1g，牛肉膏，牛肉膏5g，蛋白胨，蛋白胨5g，蔗糖，蔗糖5g，MgSO4.7H2O 0.5g,pH7.0 MS盐：盐：MS大量元素、微量元素、大量元素、微量元素、pH7.0；MS基本培养基：基本培养基：MS大量元素、微量元素、有机物，大量元素、微量元素、有机物，3%蔗糖，蔗糖，0.8%琼脂，琼脂，pH5.8；实验步骤实验步骤1.从平板上挑取含有pBI121的农杆菌LBA4404单菌落，接种于50ml YEB液体培养液(含有100mg/L Kan和125mg/L Sm)中，28C振荡培养至OD600为0.6-0.8；2.4000rpm，室温离心10分钟，倒掉上清.3.用
9、MS盐溶液（pH7.0）重新悬浮菌体，侵染时采用MS盐溶液稀释至原体积的20-50倍。4.在超净台上从烟草无菌苗上切下叶片,切去边缘和主要叶脉，切成0.40.6cm2大小；5.侵染：将切好的外植体在农杆菌菌液中浸泡10分钟，取出外植体置于无菌滤纸上吸去材料表面的菌液。6.共培养，将侵染过的外植体接种在上铺一层滤纸的MS基本培养基，28C暗培养三天。7.外植体暗培养三天后，转到含有抗生素的分化培养基（MS+3mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+Kan 100mg/L+Cb 500mg/L）上，在光照为2000-10000lx，25C条件下进行选择培养。8.三天观察一次，发现污染，立刻转入新的相同培养基中注意事项注意事项1烟草无菌苗上切下叶片后，注意迅速盖好封口烟草无菌苗上切下叶片后，注意迅速盖好封口膜。膜。2严格控制叶盘在农杆菌菌液中的浸泡时间。严格控制叶盘在农杆菌菌液中的浸泡时间。3避免外植体于无菌滤纸上过于干燥。避免外植体于无菌滤纸上过于干燥。思考题1培养农杆菌培养农杆菌LBA4404时加时加Sm的作用是什么？的作用是什么？2暗培养时培养基中是否要加抗生素？为什么？暗培养时培养基中是否要加抗生素？为什么？