《分子与基因工程实验七精选PPT.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《分子与基因工程实验七精选PPT.ppt（16页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、分子与基因工程实验七第1页，此课件共16页哦二、实验原理二、实验原理 农杆菌重组子中携带经改造的农杆菌重组子中携带经改造的Ti 质粒（含有帮助质粒（含有帮助T-DNA跳到跳到植物染色体上的植物染色体上的Vir 区）和包含区）和包含T-DNA的双元载体的双元载体pBinGUS，质粒，质粒pBinGUS上上T-DNA上插入了报告基因（上插入了报告基因（GUS）和卡那霉）和卡那霉素筛选标记基因素筛选标记基因NPTII。叶叶盘盘法法转转化化是是通通过过人人为为在在烟烟草草叶叶片片上上产产生生伤伤口口，侵侵染染时时农农杆杆菌菌吸吸附附于于植植物物的的表表面面伤伤口口部部位位，受受伤伤后后双双子子叶叶植植
2、物物分分泌泌的的酚酚类类化化合合物物透透过过农农杆杆菌菌的的细细胞胞膜膜，活活化化vir区区基基因因，vir区区基基因因的的活活化化，促促使使T-DNA进进行行加加工工和和转转移移。T-DNA进进入入植植物物细细胞胞后后整整合合到到核核DNA上上。共共培培养养可可使使T-DNA上上携携带带的的编编码码抗抗生生素素的的抗抗性性基基因因得得到到表表达达，因因此此，转转化化了了的的烟烟草草外外植植体体可可在在含含有有相相应抗生素的培养基上生长。应抗生素的培养基上生长。第2页，此课件共16页哦植物基因转化受体系统植物基因转化受体系统指用于转化的外植体通过组织培养途径或其他非组织培养途径，指用于转化的外
3、植体通过组织培养途径或其他非组织培养途径，能高效、稳定地再生无性系，并能接受外源能高效、稳定地再生无性系，并能接受外源DNA整合，对转化整合，对转化选择抗生素敏感的再生系统。选择抗生素敏感的再生系统。具备条件：具备条件：（1）高效稳定的再生能力）高效稳定的再生能力（2）较高的遗传稳定性）较高的遗传稳定性（3）具有稳定的外植体来源）具有稳定的外植体来源（4）对选择性抗生素敏感）对选择性抗生素敏感（5）对农杆菌侵染有敏感性）对农杆菌侵染有敏感性第3页，此课件共16页哦外植体的种类外植体的种类叶片、叶柄、子叶、子叶柄叶片、叶柄、子叶、子叶柄茎、花茎、块茎、茎尖分生组织茎、花茎、块茎、茎尖分生组织根根
4、合子胚合子胚成熟种子成熟种子第4页，此课件共16页哦第5页，此课件共16页哦叶盘法转化叶盘法转化双子叶植物双子叶植物以以叶叶片片作作为为外外植植体体，在在叶叶片片上上产产生生伤伤口口，侵侵染染时时农农杆杆菌菌吸附于植物的表面伤口部位吸附于植物的表面伤口部位;受受伤伤后后双双子子叶叶植植物物分分泌泌的的酚酚类类化化合合物物透透过过农农杆杆菌菌的的细细胞胞膜膜，活活化化vir区区基基因因，vir区区基基因因的的活活化化，促促使使T-DNA进进行行加加工工和和转转移移。T-DNA进进入入植植物物细细胞胞后后整整合合到到核核DNA上。上。第6页，此课件共16页哦农杆菌与外植体共培养农杆菌与外植体共培养
5、接种菌体后的外植体培养在诱导愈伤组织的固体培养基上，在外植体细胞分裂、生长的同时，农杆菌在外植体切口面也增殖生长，该两者共同培养过程称之为共培养。是整个转化过程中非常重要的环节。因为农杆菌吸附，T-DNA的转移及整合都在这共培养时期内完成。第7页，此课件共16页哦Events An event is the insertion of a particular transgene into a specific location on a chromosome.Conceptions第8页，此课件共16页哦Transformation frequency Independent transgen
6、ic plants/inoculated immature embryo or callus.Line The seedlings from one transgenic cell,namely,one independent successfully transformation event,belong to one line,also are called clones.Generation These transgenic seedlings are T0 generation seedlings,T0 generation mature seeds are T1 generation
7、Meiosis or pollination is the boundary of different generations.第9页，此课件共16页哦实验仪器、材料和试剂实验仪器、材料和试剂仪器：超净工作台，培养箱，台式离心机，培养皿，加样器仪器：超净工作台，培养箱，台式离心机，培养皿，加样器 及吸头，无菌滤纸；及吸头，无菌滤纸；材料：携带质粒植物表达材料：携带质粒植物表达(pBI121)载体土壤农杆菌载体土壤农杆菌LBA4404 烟草无菌苗烟草无菌苗试剂：试剂：YEB液体培养基（液体培养基（1升）：升）：酵母提取物酵母提取物1g，牛肉膏，牛肉膏5g，蛋白胨，蛋白胨5g，蔗糖，蔗糖5g，Mg
8、SO4.7H2O 0.5g,pH7.0 MS盐：盐：MS大量元素、微量元素、大量元素、微量元素、pH7.0；MS基本培养基：基本培养基：MS大量元素、微量元素、有机物，大量元素、微量元素、有机物，3%蔗糖，蔗糖，0.8%琼脂，琼脂，pH5.8；第10页，此课件共16页哦实验步骤实验步骤第11页，此课件共16页哦1.从平板上挑取含有pBI121的农杆菌LBA4404单菌落，接种于50ml YEB液体培养液(含有100mg/L Kan和125mg/L Sm)中，28C振荡培养至OD600为0.6-0.8；2.4000rpm，室温离心10分钟，倒掉上清.3.用MS盐溶液（pH7.0）重新悬浮菌体，侵
9、染时采用MS盐溶液稀释至原体积的20-50倍。4.在超净台上从烟草无菌苗上切下叶片,切去边缘和主要叶脉，切成0.40.6cm2大小；第12页，此课件共16页哦5.侵染：将切好的外植体在农杆菌菌液中浸泡10分钟，取出外植体置于无菌滤纸上吸去材料表面的菌液。6.共培养，将侵染过的外植体接种在上铺一层滤纸的MS基本培养基，28C暗培养三天。7.外植体暗培养三天后，转到含有抗生素的分化培养基（MS+3mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+Kan 100mg/L+Cb 500mg/L）上，在光照为2000-10000lx，25C条件下进行选择培养。8.三天观察一次，发现污染，立刻转入新的相同培养基中第13页，此课件共16页哦第14页，此课件共16页哦注意事项注意事项1烟草无菌苗上切下叶片后，注意迅速盖好封口膜。烟草无菌苗上切下叶片后，注意迅速盖好封口膜。2严格控制叶盘在农杆菌菌液中的浸泡时间。严格控制叶盘在农杆菌菌液中的浸泡时间。3避免外植体于无菌滤纸上过于干燥。避免外植体于无菌滤纸上过于干燥。第15页，此课件共16页哦思考题1培养农杆菌培养农杆菌LBA4404时加时加Sm的作用是什么？的作用是什么？2暗培养时培养基中是否要加抗生素？为什么？暗培养时培养基中是否要加抗生素？为什么？第16页，此课件共16页哦