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1、目目 录录关于蛋白质的共价结构(4)第1页，讲稿共58张，创作于星期三目目 录录 第第 二二 章章 蛋白质的共价结构蛋白质的共价结构第一节、蛋白质通论第一节、蛋白质通论 (P157)(P157)第二节、肽第二节、肽第三节、蛋白质一级结构的测定第三节、蛋白质一级结构的测定第四节、蛋白质的氨基酸序列与生物功能第四节、蛋白质的氨基酸序列与生物功能第五节、肽和蛋白质的人工合成第五节、肽和蛋白质的人工合成(不要求不要求)第2页，讲稿共58张，创作于星期三目目 录录第一节、蛋白质通论第一节、蛋白质通论一一 、蛋白质的化学组成和分类、蛋白质的化学组成和分类二、蛋白质分子的形状和大小二、蛋白质分子的形状和大小
2、三、蛋白质构象和蛋白质结构的组织层次三、蛋白质构象和蛋白质结构的组织层次四、蛋白质功能的多样性四、蛋白质功能的多样性第3页，讲稿共58张，创作于星期三目目 录录一、蛋白质的化学组成和分类1、化学组成：蛋白质是一类含氮有机化合物，除含有碳、氢、氧外，还蛋白质是一类含氮有机化合物，除含有碳、氢、氧外，还有氮和少量的硫。某些蛋白质还含有其他一些元素，主要是磷、有氮和少量的硫。某些蛋白质还含有其他一些元素，主要是磷、铁、碘、钼、锌和铜等。这些元素在蛋白质中的组成百分比约铁、碘、钼、锌和铜等。这些元素在蛋白质中的组成百分比约为：为：碳碳 5050-55%-55%氢氢 6.5-7.36.5-7.3 氧氧
3、19-2419-24 氮氮 16%16%硫硫 0-30-3 其他其他 微微 量量第4页，讲稿共58张，创作于星期三目目 录录蛋白质的含氮量蛋白质的含氮量v大大多多数数蛋蛋白白质质的的含含氮氮量量接接近近于于16%16%，这这是是蛋蛋白白质质元元素素组组成成的的一一个个特特点点，也也是是凯凯氏氏（KjedahlKjedahl）定定氮氮法法测测定定蛋蛋白白质质含含量量的的计计算算基基础础。所以，可以根据生物样品中的含氮量来计算蛋白质的大概含量：v蛋白质含量蛋白质含量=蛋白氮蛋白氮 6.256.25v6.256.25为为蛋蛋白白质质系系数数，即即1 1克克氮氮所所代代表表的的蛋蛋白质量（克数）白质量
4、（克数）1/16%第5页，讲稿共58张，创作于星期三目目 录录2、分类(P157,了解)：*根据蛋白质组成成分根据蛋白质组成成分 单纯蛋白质单纯蛋白质：只含氨基酸只含氨基酸如清蛋白、谷蛋白、组蛋白、精蛋白如清蛋白、谷蛋白、组蛋白、精蛋白等等 结合蛋白质结合蛋白质 =蛋白质部分蛋白质部分 +非蛋白质部分非蛋白质部分*根据蛋白质结构分根据蛋白质结构分 单体蛋白单体蛋白：仅有一条多肽链构成的蛋白质。：仅有一条多肽链构成的蛋白质。寡聚寡聚(多聚多聚)蛋白蛋白：由：由2 2条或多条多肽链构成的蛋白质条或多条多肽链构成的蛋白质*根据蛋白质生物学功能分根据蛋白质生物学功能分 酶、调节蛋白、转运蛋白、结构蛋白
5、等等酶、调节蛋白、转运蛋白、结构蛋白等等第6页，讲稿共58张，创作于星期三目目 录录二、蛋白质分子的形状和大小1 1、根据蛋白质的形状和溶解度分为：、根据蛋白质的形状和溶解度分为：纤维状纤维状ProPro：分子类似纤维或细棒，线性结构，：分子类似纤维或细棒，线性结构，在生物体内主要起结构作用，在生物体内主要起结构作用，大多不溶于水和稀盐大多不溶于水和稀盐。球状球状ProPro：近球状结构，疏水：近球状结构，疏水aaaa侧链在分子内部侧链在分子内部亲水侧链在外因此溶解性较好，能形成结晶，大多数蛋亲水侧链在外因此溶解性较好，能形成结晶，大多数蛋白质属于这一类。白质属于这一类。膜膜PrPr：与细胞中
6、各种膜系统结合而存在。组成特点是所：与细胞中各种膜系统结合而存在。组成特点是所含的疏水含的疏水aaaa较多，不溶于水但溶于去污剂溶液。较多，不溶于水但溶于去污剂溶液。(p158了解)第7页，讲稿共58张，创作于星期三目目 录录2 2、蛋白质分子的大小蛋白质分子的大小蛋白质分子量的变化范围很大，从大约蛋白质分子量的变化范围很大，从大约60006000到到10000001000000道尔顿道尔顿（DaDa）或更大。）或更大。某些蛋白质是由两个或更多个蛋白质亚基某些蛋白质是由两个或更多个蛋白质亚基(多肽链多肽链)通过非共通过非共价结合而成的，称寡聚蛋白质。有些价结合而成的，称寡聚蛋白质。有些寡聚蛋白
7、质寡聚蛋白质的分子量的分子量可高达数百万甚至数千万（可高达数百万甚至数千万（TMVTMV：4x104x107 7）对于那些不含辅基的简单蛋白质，用对于那些不含辅基的简单蛋白质，用110110除它的分子量可除它的分子量可以以粗略的估计其氨基酸残基的数目粗略的估计其氨基酸残基的数目。蛋白质的。蛋白质的2020种氨基酸的种氨基酸的平均分子量是平均分子量是138138，但在大多数蛋白质中较小的氨基酸占优势，但在大多数蛋白质中较小的氨基酸占优势，因此平均分子量接近因此平均分子量接近128128。因形成一个肽键脱掉一个水分子，。因形成一个肽键脱掉一个水分子，故故氨基酸残基的平均分子量是氨基酸残基的平均分子
8、量是110110。(P160)(P160)第8页，讲稿共58张，创作于星期三目目 录录三、蛋白质构象和蛋白质结构的组织层次三、蛋白质构象和蛋白质结构的组织层次每种天然蛋白质都有自己特有的空间（三维）结构，每种天然蛋白质都有自己特有的空间（三维）结构，这种结构就是这种结构就是蛋白质的构象蛋白质的构象。构型：是由于化合物分子中某一不对称碳原子上四种构型：是由于化合物分子中某一不对称碳原子上四种不同的取代基团（或原子）的空间排列所形成的一种不同的取代基团（或原子）的空间排列所形成的一种光学活性立体结构。一个不对称碳原子只能形成两种光学活性立体结构。一个不对称碳原子只能形成两种不同的构型，分子从一种构
9、型变成另一种构型，必须不同的构型，分子从一种构型变成另一种构型，必须发生发生共价键的断裂共价键的断裂。构象：构象是分子内所有原子或原子团的空间排布所构象：构象是分子内所有原子或原子团的空间排布所形成的一种立体结构。天然蛋白质分子都有与其生物形成的一种立体结构。天然蛋白质分子都有与其生物活性相关的一种或少数几种特定的构象，这种天然构活性相关的一种或少数几种特定的构象，这种天然构象相当稳定。象相当稳定。一个给定的蛋白质理论上可采取多种构象，但在生理一个给定的蛋白质理论上可采取多种构象，但在生理条件下一般条件下一般只有一种或很少几种只有一种或很少几种。第9页，讲稿共58张，创作于星期三目目 录录 为
10、了表示蛋白质结构的不同组织层次，一般采用这样的专门术语：为了表示蛋白质结构的不同组织层次，一般采用这样的专门术语：蛋白质的蛋白质的4 4级结构级结构(掌握掌握)：P160P160一级结构一级结构指多肽链中的氨基酸的组成和排列顺序。指多肽链中的氨基酸的组成和排列顺序。二级结构二级结构是指蛋白质多肽链主链借助氢键排列成自己特有的是指蛋白质多肽链主链借助氢键排列成自己特有的-螺旋和螺旋和-折叠片段。折叠片段。二级结构仅仅是主链构象，不讨二级结构仅仅是主链构象，不讨论侧链基团的空间排布论侧链基团的空间排布。三级结构三级结构指多肽链借助各种非共价键弯曲、折叠成具有特定走指多肽链借助各种非共价键弯曲、折叠
11、成具有特定走向的紧密球状构象。向的紧密球状构象。四级结构四级结构指两条或两条以上具有独立三级结构的多肽链通过指两条或两条以上具有独立三级结构的多肽链通过非共价键相互结合而成的蛋白质空间结构非共价键相互结合而成的蛋白质空间结构-即寡聚蛋白，即寡聚蛋白，其中每条多肽链形成的独立其中每条多肽链形成的独立3 3级结构单元称为亚基。级结构单元称为亚基。一级结构一级结构二级结构二级结构三级结构三级结构四级结构四级结构第10页，讲稿共58张，创作于星期三目目 录录虾红素虾红素为为 研研 究究 方方 便便，分分 四层四层 次次 探探 讨讨第11页，讲稿共58张，创作于星期三目目 录录四、蛋白质功能的多样性四、
12、蛋白质功能的多样性(了解了解)1.1.蛋白质是生物蛋白质是生物 体重要组成成分体重要组成成分n分布广：分布广：所有器官、组织都含有蛋白质；细所有器官、组织都含有蛋白质；细胞的各个部分都含有蛋白质。胞的各个部分都含有蛋白质。n含量高：含量高：蛋白质是细胞内最丰富的有机分子，蛋白质是细胞内最丰富的有机分子，占人体干重的占人体干重的4545，某些组织含量更高，例，某些组织含量更高，例如脾、肺及横纹肌等高达如脾、肺及横纹肌等高达8080。第12页，讲稿共58张，创作于星期三目目 录录 蛋白质种类非常多，原因？蛋白质种类非常多，原因？蛋白质的生物学功能有以下几方面：蛋白质的生物学功能有以下几方面：1.1
13、.催化功能催化功能-酶酶2.2.结构功能结构功能-皮毛骨牙细胞骨架皮毛骨牙细胞骨架3.3.载运功能载运功能-膜蛋白膜蛋白4.4.调控功能调控功能-激素激素5.5.运动功能运动功能-鞭毛、肌肉蛋白鞭毛、肌肉蛋白6.6.防御功能防御功能-免疫球蛋白免疫球蛋白7.7.神经传导神经传导 其他蛋白（受体蛋白、毒素蛋白、激素蛋白等）其他蛋白（受体蛋白、毒素蛋白、激素蛋白等）蛋白质分布广泛、功能多样第13页，讲稿共58张，创作于星期三目目 录录蛋白质的功能与分布单细胞生物胞外酶鞭毛-蛋白质（运动器官）细胞壁-糖、脂、肽细胞膜-载运蛋白、酶蛋白细胞质-酶蛋白（催化物质代谢）细胞核-酶蛋白（催化遗传）第14页，
14、讲稿共58张，创作于星期三目目 录录多细胞动物多细胞动物个体层次个体层次毛发、皮肤-角蛋白骨骼、牙齿-钙+胶原蛋白第15页，讲稿共58张，创作于星期三目目 录录食道（口、胃、肠）食道（口、胃、肠）-消化酶消化酶（细胞外）（细胞外）血管中血管中-免疫蛋白免疫蛋白 （Antibody）激素蛋白激素蛋白器官层次器官层次第16页，讲稿共58张，创作于星期三目目 录录细胞水平细胞水平提问：为什么人体细胞会有不同的形状呢？细胞内有支撑体？w细胞内丝网状骨架蛋白（决定细胞形状及运动）；地衣细胞带有绿色荧光的骨架蛋白质食物酵母细胞w细胞粘连物质细胞粘连物质-胶原胶原蛋白蛋白w细胞膜细胞膜载体蛋白载体蛋白w细胞
15、质细胞质(包括细胞器包括细胞器)酶酶（物质代谢）、信号传递（物质代谢）、信号传递w细胞核细胞核酶（遗传）、结构酶（遗传）、结构蛋白（染色体骨架）蛋白（染色体骨架）w结构蛋白结构蛋白,均为均为纤维状纤维状；功能功能 蛋蛋 白白,大多为大多为 球球 状状；第17页，讲稿共58张，创作于星期三目目 录录其他组成以及结构复杂程度不同其他组成以及结构复杂程度不同 结构决定功能结构决定功能即分子结构的不同决定其具有不同的生物功能即分子结构的不同决定其具有不同的生物功能同样是有同样是有20种种Aa组成，为何这些蛋白质的功能组成，为何这些蛋白质的功能大不相同？大不相同？第18页，讲稿共58张，创作于星期三目目
16、 录录第二节第二节 肽（肽（peptidepeptide）P162（熟悉）（熟悉）一、肽和肽键的结构一、肽和肽键的结构二、肽的物化性质二、肽的物化性质三、天然存在的活性肽三、天然存在的活性肽第19页，讲稿共58张，创作于星期三目目 录录一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基之间一个氨基酸的氨基之间失水形成的酰胺键称为失水形成的酰胺键称为肽键，所形成的化合物肽键，所形成的化合物称为肽称为肽。一、肽与肽键的结构一、肽与肽键的结构由由两两个个氨氨基基酸酸组组成成的的肽肽称称为为二二肽肽，由由多多个个氨氨基基酸酸组组成成的的肽肽则则称称为为多多肽肽。组组成成多多肽肽的的氨氨基基酸酸单
17、单元元称称为为氨氨基基酸酸残基。残基。第20页，讲稿共58张，创作于星期三目目 录录+-HOH甘氨酰甘氨酸甘氨酰甘氨酸肽键第21页，讲稿共58张，创作于星期三目目 录录两分子氨基酸缩合形成两分子氨基酸缩合形成二肽二肽，三分子氨基，三分子氨基酸缩合则形成酸缩合则形成三肽三肽由十个以内氨基酸相连而成的肽称为由十个以内氨基酸相连而成的肽称为寡肽寡肽(oligopeptide)(oligopeptide)，由更多的氨基酸相连形由更多的氨基酸相连形成的肽称成的肽称多肽多肽(polypeptide)(polypeptide)。*肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被
18、称为团不全，被称为氨基酸残基氨基酸残基(residue)(residue)。肽的命名肽的命名第22页，讲稿共58张，创作于星期三目目 录录在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为种排列顺序称为氨基酸顺序氨基酸顺序氨基酸的顺序是从氨基酸的顺序是从N-N-端的氨基酸残基开始，以端的氨基酸残基开始，以C-C-端氨基酸残基为终点的排列顺序。如上述五肽可表示端氨基酸残基为终点的排列顺序。如上述五肽可表示为：为：Ser-Val-Tyr-Asp-GlnSer-Val-Tyr-Asp-Gln命名为：某氨基酰某氨基酰。某氨基酸命名为：某氨基酰某氨基酰。某
19、氨基酸通通常常在在多多肽肽链链的的一一端端含含有有一一个个游游离离的的-氨氨基基，称称为为氨氨基基端端或或N-N-端端；在在另另一一端端含含有有一一个个游游离离的的-羧羧基基，称为羧基端或称为羧基端或C-C-端。端。肽肽链链中中A AA A的的排排列列顺顺序序和和命命名名第23页，讲稿共58张，创作于星期三目目 录录是根据参与其组成的氨基酸残基来确定是根据参与其组成的氨基酸残基来确定的。规定从肽链的的。规定从肽链的NHNH2 2末端氨基酸残基开末端氨基酸残基开始，始，肽链的肽链的NHNH2 2末端一般放左边末端一般放左边，称为某，称为某氨基酰某氨基酰氨基酰某氨基酰某氨基酸。例如，某氨基酸。例如
20、，具有下列化学结构的五肽命名为丝氨酰具有下列化学结构的五肽命名为丝氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸，简写为甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸，简写为 SerGlySerGlyTyrAlaLeuTyrAlaLeu。第24页，讲稿共58张，创作于星期三目目 录录肽链也像氨基酸一样具有极性，通常总是把肽链也像氨基酸一样具有极性，通常总是把NHNH2 2末端氨末端氨基酸残基放在左边，基酸残基放在左边，COOHCOOH末端氨基酸残基放在右边。末端氨基酸残基放在右边。除特别指明者外，上面举例的五肽丝氨酸残基一除特别指明者外，上面举例的五肽丝氨酸残基一侧为侧为NHNH2 2末端，亮氨酸残基一侧为末端，亮氨酸残基一侧为 C
21、OOHCOOH末端。注末端。注意，反过来书写的意，反过来书写的 LeuAlaTyrGlySerLeuAlaTyrGlySer是是与前者不同的另一种五肽。与前者不同的另一种五肽。第25页，讲稿共58张，创作于星期三目目 录录 肽键肽键（peptide bondpeptide bond）：肽肽键键的的特特点点是氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用。组成肽键的原子处于同一平面组成肽键的原子处于同一平面。0.125nm0.125nm键长键长=0.133nm=0.133nm 0.145nm0.145nm第26页，讲稿共58张，创作于星期三目目 录录肽键肽键肽肽键键中中的的C-NC-N键键具具有有部
22、部分分双双键键性质，不能自由旋转。性质，不能自由旋转。在大多数情况下，以反式在大多数情况下，以反式结构存在。结构存在。第27页，讲稿共58张，创作于星期三目目 录录肽键有部分双键性质肽键有部分双键性质肽键由于肽键由于共振共振而具有而具有部分双键部分双键性质，因此，性质，因此，1)肽键比一般肽键比一般C-N键键短短，且不能自由旋转，且不能自由旋转2)肽键原子及相邻的肽键原子及相邻的 碳原子组成碳原子组成肽平面肽平面3)相邻的相邻的 碳原子呈碳原子呈反式反式构型构型第28页，讲稿共58张，创作于星期三目目 录录肽键比一般肽键比一般肽键比一般肽键比一般C-NC-N键短键短键短键短肽键为一平面肽键为一
23、平面肽键为一平面肽键为一平面相邻的相邻的相邻的相邻的 碳原子呈反式构型碳原子呈反式构型碳原子呈反式构型碳原子呈反式构型第29页，讲稿共58张，创作于星期三目目 录录肽的结构肽的结构第30页，讲稿共58张，创作于星期三目目 录录N 末端：多肽链中有末端：多肽链中有自由氨基自由氨基的一端的一端C 末端：多肽链中有末端：多肽链中有自由羧基自由羧基的一端的一端多肽链有两端多肽链有两端*多多肽肽链链(polypeptide chain)是是指指许许多多氨氨基基酸酸之间以肽键连接而成的一种结构。之间以肽键连接而成的一种结构。第31页，讲稿共58张，创作于星期三目目 录录N末端末端C末端末端牛核糖核酸酶牛核
24、糖核酸酶第32页，讲稿共58张，创作于星期三目目 录录2.2 肽肽多个氨基酸形成的肽叫多肽多个氨基酸形成的肽叫多肽，呈链呈链状故又称状故又称多肽链。多肽链。蛋白质蛋白质=1=1或几条长多肽链或几条长多肽链 +或不或不+辅辅助基团助基团 短链且具有生物功能的多肽不算蛋短链且具有生物功能的多肽不算蛋 白白质，通常称为活性肽！质，通常称为活性肽！第33页，讲稿共58张，创作于星期三目目 录录二、肽的重要理化性质二、肽的重要理化性质（P165,了解了解）1.每种肽也有其晶体，晶体的熔点都很高。每种肽也有其晶体，晶体的熔点都很高。2.在在pH0-14范围内，肽的酸碱性质主要来自游离末范围内，肽的酸碱性质
25、主要来自游离末端端-NH2和游离末端和游离末端-COOH以及侧链上可解以及侧链上可解离的基团离的基团。3.每一种肽都有其相应的等电点，计算方法与每一种肽都有其相应的等电点，计算方法与AA一致且复杂。一致且复杂。B2+B B+B BB B-B B2-2-KK1 1KK2 2K K3 3KK4 4pI=pKpI=pK2 2+pK+pK3 3/2/2第34页，讲稿共58张，创作于星期三目目 录录4.原则：原则：当溶液当溶液pH大于解离侧链的值，占优大于解离侧链的值，占优 势的离子形式是该侧链的共轭碱，当溶液势的离子形式是该侧链的共轭碱，当溶液pH小于解离侧链的值，占优势的离子形式小于解离侧链的值，占
26、优势的离子形式是该侧链的共轭酸是该侧链的共轭酸。（。（P166例子）例子）5.肽的化学反应肽的化学反应：也能发生茚三酮反应、也能发生茚三酮反应、Sanger反应、反应、DNS反应和反应和Edman反应；反应；还可发生双缩脲反应。还可发生双缩脲反应。(P166)第35页，讲稿共58张，创作于星期三目目 录录三、三、天然存在的活性肽天然存在的活性肽在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚单位。白质的亚单位。但是，也有许多分子量比较小的多肽以游离状但是，也有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在。这类多肽通常都具有特殊的生理功能，态存在。这类多肽通常都具
27、有特殊的生理功能，常称为活性肽（常称为活性肽（active peptideactive peptide）。）。如：脑啡肽；激素类多肽；抗生素类多肽；谷如：脑啡肽；激素类多肽；抗生素类多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。胱甘肽；蛇毒多肽等。P167，了解第36页，讲稿共58张，创作于星期三目目 录录与真核生物的与真核生物的RNARNA聚合酶聚合酶 和和牢固结合牢固结合第37页，讲稿共58张，创作于星期三目目 录录 +H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO-+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO-Met-脑啡肽 Leu-脑啡肽第38页，讲稿共58张，创作于星期三目目 录录
28、L-Leu-D-Phe-L-Pro-L-ValL-OrnL-OrnL-Val-L-Pro-D-Phe-L-Leu短杆菌肽短杆菌肽S(S(环十肽环十肽)由由细细菌菌分分泌泌的的多多肽肽，有有时时也也都都含含有有D-D-氨氨基基酸酸和和一一些些非非蛋蛋白白氨氨基基酸酸。如如鸟鸟氨氨酸酸（OrnOrnithine,ithine,缩缩写写为为 OrnOrn）。）。第39页，讲稿共58张，创作于星期三目目 录录CO-NH-CH-CO-NH-CH2-COOHCHCH2 2CHCH2 2CHNHCHNH2 2COOHCOOHCHCH2 2SHSH 谷胱甘肽谷胱甘肽存在与动、植物及存在与动、植物及微生物中：微
29、生物中：1.1.参与体内氧化还原反应参与体内氧化还原反应 2.2.作为辅酶参与氧化还原反应作为辅酶参与氧化还原反应 保护巯基酶或含保护巯基酶或含CysCys的蛋白质中的蛋白质中 SHSH的还原性的还原性 防止氧化物积累防止氧化物积累2GSH2GSHGS-SGGS-SG第40页，讲稿共58张，创作于星期三目目 录录w干扰素、胸腺肽是治疗乙肝、肿瘤的首选药干扰素、胸腺肽是治疗乙肝、肿瘤的首选药w机理：由受损细胞分泌促使其他细胞产生机理：由受损细胞分泌促使其他细胞产生相应的抗病毒蛋白质。相应的抗病毒蛋白质。w详见：详见：w 脑肽是人在受到突然伤害，脑垂体自然分泌的脑肽是人在受到突然伤害，脑垂体自然分
30、泌的“鸦片鸦片”。w有什么生物意义？有什么生物意义？w不受疼痛的干扰，迅速自救不受疼痛的干扰，迅速自救第41页，讲稿共58张，创作于星期三目目 录录附：附：几种生物活性肽几种生物活性肽 1.谷胱甘肽谷胱甘肽(glutathione,GSH)第42页，讲稿共58张，创作于星期三目目 录录GSH过氧化过氧化物酶物酶H2O2 2GSH 2H2O GSSG GSH还原酶还原酶NADPH+H+NADP+第43页，讲稿共58张，创作于星期三目目 录录 体内许多激素属寡肽或多肽体内许多激素属寡肽或多肽 神经肽神经肽(neuropeptide)2.多肽类激素及神经肽多肽类激素及神经肽第44页，讲稿共58张，创
31、作于星期三目目 录录第三节、蛋白质一级结构的测定第三节、蛋白质一级结构的测定(了解了解)1.1.蛋白质一级结构蛋白质一级结构(Primary(Primary structure)structure)包括：包括：(1)(1)组成蛋白质的多肽链数目组成蛋白质的多肽链数目.(2)(2)多肽链的氨基酸顺序，多肽链的氨基酸顺序，(3)(3)多肽链内或链间二硫键多肽链内或链间二硫键的数目和位置。的数目和位置。其中最重要的是多肽链的其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础生物功能的基础。P168第45页，讲稿共58张，创作于星期三目目 录录2.蛋白质的一级结构蛋白质的
32、一级结构的测定的测定 蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从基础。自从19531953年年F.SangerF.Sanger测定了胰岛素的一级结测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构构以来，现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被测定。被测定。(1)(1)测定蛋白质的一级结构的要求测定蛋白质的一级结构的要求A.A.样品必需纯（样品必需纯（97%97%以上）；以上）；B.B.知道蛋白质的分子量；知道蛋白质的分子量；C.C.知道蛋白质由几个亚基组成；知道蛋白质由几个亚基组成；D.D.测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每
33、种氨基酸测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸 的个数。的个数。E.E.测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。第46页，讲稿共58张，创作于星期三目目 录录蛋白质测序的一般步骤 样品要求：纯度，均一，知道分子量样品要求：纯度，均一，知道分子量（1 1）测定）测定ProPro分子中多肽链的数目，根据分子中多肽链的数目，根据N N末端和末端和C C末端的数量。末端的数量。（2 2）拆分蛋白质分子的多肽链）拆分蛋白质分子的多肽链（3 3）断开多肽链内的二硫键，一般用甲酸氧化或巯基化合物）断开多肽链内的二硫键，一般用甲酸氧化或巯基化合物还原。还原。（4 4
34、）分析每一多肽链的氨基酸组成，一部分样品完全水解，测定）分析每一多肽链的氨基酸组成，一部分样品完全水解，测定氨基酸组成，并计算氨基酸成分的分子比。氨基酸组成，并计算氨基酸成分的分子比。（5 5）鉴定多肽链的）鉴定多肽链的N-N-末端和末端和C-C-末端残基，建立两个氨基酸序列的参末端残基，建立两个氨基酸序列的参考点。考点。（6 6）断裂多肽链为较小的片段）断裂多肽链为较小的片段（7 7）测定各肽段的氨基酸序列，目前常用）测定各肽段的氨基酸序列，目前常用EdmanEdman降解法。降解法。（8 8）根据上述个肽段的氨基酸序列测定结果，利用两套或几套肽段）根据上述个肽段的氨基酸序列测定结果，利用两
35、套或几套肽段的序列彼此间的交错重叠，可拼凑出整条多肽链的氨基酸序列。的序列彼此间的交错重叠，可拼凑出整条多肽链的氨基酸序列。（9 9）确定二硫键的位置。）确定二硫键的位置。第47页，讲稿共58张，创作于星期三目目 录录(2)(2)测定步骤测定步骤测定蛋白质分子中测定蛋白质分子中多肽链的多肽链的数目数目：通过测定末端氨基酸残基通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。系，即可确定多肽链的数目。N-AA or C-AA=proN-AA or C-AA=pro 单链蛋白单链蛋白N-AA or C-AA=X proN-AA or C-A
36、A=X pro 多链蛋白多链蛋白若末端若末端AAAA多于一种，蛋白质由两条多于一种，蛋白质由两条或多条不同的多肽链组成。或多条不同的多肽链组成。第48页，讲稿共58张，创作于星期三目目 录录 多肽链的拆分：由多条多肽链组成的多肽链的拆分：由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。几条多蛋白质分子，必须先进行拆分。几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，烯聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用醇化酶为二聚体；可用8mol/L8mol/L尿素或尿素或6mol/L6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链盐酸胍处理，即
37、可分开多肽链(亚亚基基).).二硫键的断裂：几条多肽链通过二硫二硫键的断裂：几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在可用键交联在一起。可在可用8mol/L8mol/L尿素或尿素或6mol/L6mol/L盐酸胍存在下，用过量的盐酸胍存在下，用过量的-巯基巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。它重新被氧化。可以通过加入盐酸胍方可以通过加入盐酸胍方法解离多肽链之间的非共价力；应用过法解离多肽链之间的非共价力；应用过甲酸氧化法或巯基还原法拆分多肽链间甲酸氧化法或巯基还原法拆分多肽链间的二硫键
38、。的二硫键。第49页，讲稿共58张，创作于星期三目目 录录 巯基的保护巯基的保护测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比；测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比；分析多肽链的分析多肽链的N-N-末端和末端和C-C-末端末端 末端氨基酸的测定：多肽链端基氨基酸分为两类，末端氨基酸的测定：多肽链端基氨基酸分为两类，N-N-端氨基酸和端氨基酸和C-C-端氨端氨基酸。在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是基酸。在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-N-端氨基酸分析法。末端氨基端氨基酸分析法。末端氨基酸测定的主要方法有：酸测定的主要方法有：第50页，讲稿共58张，创作于星期三目
39、目 录录 A.A.A.A.二硝基氟苯（二硝基氟苯（二硝基氟苯（二硝基氟苯（DNFBDNFBDNFBDNFB）法）法）法）法B.B.B.B.丹磺酰氯法丹磺酰氯法丹磺酰氯法丹磺酰氯法:在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。此法的氨基酸。此法的优点是丹磺酰优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到1 1 1010-9-9molmol。第51页，讲稿共58张，创作于星期三目目 录录C.C.C.C.肼解法：
40、肼解法：肼解法：肼解法：此法是多肽链此法是多肽链C-C-端氨基酸分析法。多肽与端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条件下加热，肼在无水条件下加热，C-C-端氨基酸即从肽链上解离端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-C-端氨基酸分离端氨基酸分离。第52页，讲稿共58张，创作于星期三目目 录录 D.D.D.D.(P170)(P170)(P170)(P170)氨肽酶法：氨肽酶法：氨肽酶法：氨肽酶法：氨肽酶是一种氨肽酶是一种肽链外切酶肽链外切酶，它能从，它能从多肽链的多肽链
41、的N-N-端逐个的向里水端逐个的向里水解解。根基不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和。根基不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的N-N-末端残基顺序。最常用的末端残基顺序。最常用的氨氨肽酶是亮氨酸氨肽酶肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为，水解以亮氨酸残基为N-N-末端的肽键速度最大。末端的肽键速度最大。E.E.羧肽酶法：羧肽酶是一种羧肽酶法：羧肽酶是一种肽链外切酶肽链外切酶，它能，它能从多肽链的从多肽链的C-C-端逐个的水解端逐个的水解。根基。根
42、基不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的C-C-末末端残基顺序。目前常用的羧肽酶有四种：端残基顺序。目前常用的羧肽酶有四种：A,B,CA,B,C和和Y Y；A A和和B B来自胰脏；来自胰脏；C C来自柑桔叶；来自柑桔叶；Y Y来自面包酵母。来自面包酵母。羧肽酶羧肽酶A A能水解除能水解除Pro,ArgPro,Arg和和LysLys以外的所有以外的所有C-C-末端氨基酸残基；末端氨基酸残基；B B只能只能水解水解ArgArg和和LysLys为为C-C-末端残基的肽键末端残基的肽键。羧肽酶羧肽酶A+
43、BA+B：除：除ProPro外的所有外的所有C C端端AA;AA;羧肽酶羧肽酶Y Y：所有所有C C端端AAAA多肽链断裂成多个肽段，可采用两种或多种不同的断裂方法将多多肽链断裂成多个肽段，可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。多肽的肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。多肽的选择性降解选择性降解的方法有：的方法有：第53页，讲稿共58张，创作于星期三目目 录录A.酶解法:胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶 (P174，考研的掌握)B.化学法：溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。第54
44、页，讲稿共58张，创作于星期三目目 录录测定每个肽段的氨基酸顺序。测定每个肽段的氨基酸顺序。确定肽段在多肽链中的次序：利用两套或多套肽段的确定肽段在多肽链中的次序：利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。氨基酸顺序。(P179)(P179)确定原多肽链中二硫键的位置：确定原多肽链中二硫键的位置：一般采用胃蛋白酶处一般采用胃蛋白酶处理没有断开二硫键的多肽链，再利用双向电泳技术理没有断开二硫键的多肽链，再利用双向电泳技术分离出各个肽段，用过甲酸处理后，将每个肽段进分离出各个肽段，用过甲酸处理后，将每个肽段进行组成及
45、顺序分析，然后同其它方法分析的肽段进行组成及顺序分析，然后同其它方法分析的肽段进行比较，确定二硫键的位置。行比较，确定二硫键的位置。第55页，讲稿共58张，创作于星期三目目 录录3 3、蛋白质测序举例、蛋白质测序举例(P180P180)第56页，讲稿共58张，创作于星期三目目 录录间接法：间接法：通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列序列按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列排列出排列出mRNAmRNA序列序列测定测定DNADNA序列序列分离编码蛋白质的基因分离编码蛋白质的基因第57页，讲稿共58张，创作于星期三目目 录录感谢大家观看第58页，讲稿共58张，创作于星期三