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1、关于蛋白质的共价结构(2)第1页，讲稿共111张，创作于星期三蛋白质蛋白质 （ProteinProtein）“生命是蛋白体的存在方式，这种存在方式本质上就生命是蛋白体的存在方式，这种存在方式本质上就在于这些蛋白体的化学组成部分的不断的自我更新。在于这些蛋白体的化学组成部分的不断的自我更新。”恩格斯恩格斯反杜林论反杜林论 1878 1878年年1838年，年，J.J.Berzelius提出，由提出，由proteios衍衍生而来，生而来，第一重要，首要的物质第一重要，首要的物质第2页，讲稿共111张，创作于星期三蛋白质存在于蛋白质存在于所有所有生物细胞中，是构成生物细胞中，是构成生物体最基本的生物
2、体最基本的结构物质和功能物质结构物质和功能物质。蛋白质是生命活动的物质基础，参与蛋白质是生命活动的物质基础，参与了几乎所有的生命活动过程。了几乎所有的生命活动过程。第3页，讲稿共111张，创作于星期三一、蛋白质通论一、蛋白质通论（一）、蛋白质的化学组成和分类（一）、蛋白质的化学组成和分类、元素组成、元素组成v蛋白质是一类含氮有机化合物蛋白质是一类含氮有机化合物 第4页，讲稿共111张，创作于星期三第5页，讲稿共111张，创作于星期三、蛋白质的含氮量、蛋白质的含氮量v蛋白氮占生物组织所有含氮物质的绝大部分。蛋白氮占生物组织所有含氮物质的绝大部分。v大多数蛋白质含氮量接近于大多数蛋白质含氮量接近于
3、16%16%蛋白质含量蛋白质含量 =每克样品中含氮的克数每克样品中含氮的克数 6.256.25v凯氏定氮法凯氏定氮法第6页，讲稿共111张，创作于星期三三聚氰胺三聚氰胺含氮量：66.7%含氮量是蛋白质的含氮量是蛋白质的4.16倍。倍。第7页，讲稿共111张，创作于星期三、蛋白质的分类、蛋白质的分类（1 1）、依据外形分类）、依据外形分类球状蛋白质：球状蛋白质：globularprotein 外形接近球形或椭圆形，溶解性较好外形接近球形或椭圆形，溶解性较好纤维状蛋白质纤维状蛋白质：fibrousprotein 形似纤维或细棒，分可溶性形似纤维或细棒，分可溶性/不溶性两种不溶性两种膜蛋白质膜蛋白质
4、：membraneprotein亲水性残基少于胞质蛋白亲水性残基少于胞质蛋白第8页，讲稿共111张，创作于星期三（2 2）、依据蛋白质的组成分类）、依据蛋白质的组成分类单纯蛋白单纯蛋白 simpleprotein 单纯蛋白，仅由氨基酸组成单纯蛋白，仅由氨基酸组成缀合蛋白缀合蛋白 conjugatedprotein由简单蛋白与其它非蛋白成分结合而成由简单蛋白与其它非蛋白成分结合而成第9页，讲稿共111张，创作于星期三单单纯纯蛋蛋白白清蛋白和球蛋白清蛋白和球蛋白 albuminandglobulin 广泛存在于动物组织广泛存在于动物组织谷蛋白和醇溶谷蛋白谷蛋白和醇溶谷蛋白 glutelinandp
5、rolamin 植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸/碱碱鱼精蛋白和组蛋白鱼精蛋白和组蛋白 碱性蛋白存在于细胞核碱性蛋白存在于细胞核硬蛋白硬蛋白 存在于软骨、腱、毛发、丝等组织中，存在于软骨、腱、毛发、丝等组织中，分为角分为角/胶原胶原/弹性弹性/和丝蛋白等和丝蛋白等第10页，讲稿共111张，创作于星期三缀缀合合蛋蛋白白糖蛋白：糖蛋白：简单蛋白简单蛋白+糖类物质糖类物质脂蛋白：脂蛋白：简单蛋白简单蛋白+脂类结合脂类结合核蛋白核蛋白：简单蛋白：简单蛋白+核酸核酸磷蛋白：磷蛋白：含与含与Ser,ThrSer,Thr和和TyrTyr残基的羟基残基的羟基酯化的磷酸基。酯化的磷酸
6、基。金属蛋白：金属蛋白：含有金属离子的蛋白质含有金属离子的蛋白质血红素蛋白：血红素蛋白：金属蛋白的一个亚类；辅金属蛋白的一个亚类；辅基为血红素，是卟啉化合物。基为血红素，是卟啉化合物。黄素蛋白：黄素蛋白：含黄素，辅基为含黄素，辅基为FMNFMN和和FADFAD。第11页，讲稿共111张，创作于星期三（3）蛋白质按生物学功能分类）蛋白质按生物学功能分类酶：酶：如核糖核酸酶，胰蛋白酶等如核糖核酸酶，胰蛋白酶等调节因子：调节因子：如胰岛素、促生长素、促甲状腺素等如胰岛素、促生长素、促甲状腺素等转运蛋白：转运蛋白：如血红蛋白、血清清蛋白、和葡糖转运蛋白如血红蛋白、血清清蛋白、和葡糖转运蛋白贮存蛋白：贮
7、存蛋白：如卵清蛋白、酪蛋白、菜豆蛋白和铁蛋白如卵清蛋白、酪蛋白、菜豆蛋白和铁蛋白收缩和游动蛋白：收缩和游动蛋白：肌动蛋白、肌球蛋白、动力蛋白肌动蛋白、肌球蛋白、动力蛋白结构蛋白：结构蛋白：角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白、丝蛋白和蛋白聚糖角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白、丝蛋白和蛋白聚糖支架蛋白：支架蛋白：如胰岛素受体底物如胰岛素受体底物-1、A激酶锚定蛋白和信号传递转录激活剂激酶锚定蛋白和信号传递转录激活剂保护和开发蛋白：保护和开发蛋白：如免疫球蛋白、凝血酶、血纤蛋白原、抗冻蛋白、蛇和如免疫球蛋白、凝血酶、血纤蛋白原、抗冻蛋白、蛇和蜂毒蛋白、白喉毒素等蜂毒蛋白、白喉毒素等异常蛋白：异常蛋白：如应乐果甜蛋
8、白、节肢弹性蛋白和胶质蛋白如应乐果甜蛋白、节肢弹性蛋白和胶质蛋白第12页，讲稿共111张，创作于星期三（二）、蛋白质的大小与分子量（二）、蛋白质的大小与分子量蛋白质是分子量很大的生物分子蛋白质是分子量很大的生物分子对任一种给定的蛋白质，其所有分子在对任一种给定的蛋白质，其所有分子在AAAA组成和顺序以及肽链的长度组成和顺序以及肽链的长度方面都应方面都应是相同的，即所谓均一的蛋白质。是相同的，即所谓均一的蛋白质。第13页，讲稿共111张，创作于星期三l人为规定人为规定PrPr分子量上下限分子量上下限下限一般认为从胰岛素开始，下限一般认为从胰岛素开始，其相对分子量为其相对分子量为57005700（
9、5151个个氨基酸残基）氨基酸残基）某些某些PrPr由两至多个亚基经由两至多个亚基经 非共非共价结合而成（价结合而成（寡聚蛋白寡聚蛋白）分子）分子量高达数百量高达数百/千万。如谷酰胺千万。如谷酰胺合成酶（合成酶（1212个亚基组成），个亚基组成），如烟草花叶病毒（如烟草花叶病毒（21302130个亚基个亚基和一条和一条RNARNA链构成。链构成。第14页，讲稿共111张，创作于星期三l蛋白质与多肽无严格的界线蛋白质与多肽无严格的界线 通常将通常将6000Dr6000Dr以上的多肽称为蛋白质。以上的多肽称为蛋白质。l蛋白质分子量变化范围很大蛋白质分子量变化范围很大蛋白质蛋白质月示月示胨胨多肽多肽
10、肽肽AAAA 1*104 5*103 2*103 1000 200 100 -500对于不含辅基的单纯蛋白质，相对分子量对于不含辅基的单纯蛋白质，相对分子量/110aa残基数残基数20种种aa的平均分子量约为的平均分子量约为138，较小的氨基酸占优势，因此平均分子质量为较小的氨基酸占优势，因此平均分子质量为128。形成一个肽键失去一分子水（分子量形成一个肽键失去一分子水（分子量18），），aa残基的平均分子量为残基的平均分子量为110。100个氨基酸残基的蛋白质，分子量约为多少？第15页，讲稿共111张，创作于星期三（三）、蛋白质构象和结构的组织层次（三）、蛋白质构象和结构的组织层次蛋白质的结
11、构层次一级结构二级结构三级结构四级结构高级结构空间构象第16页，讲稿共111张，创作于星期三蛋白质的各级结构的基本概念蛋白质的各级结构的基本概念一级（一级（1o）结构）结构：肽链中的氨基酸排列顺序。肽链中的氨基酸排列顺序。二级（二级（2o）结构：）结构：多肽链借助氢键排列成自己特有的多肽链借助氢键排列成自己特有的a a螺旋螺旋和和b b折叠股片段折叠股片段。三级（三级（3o）结构：多肽链借助各种非共价键（非共价力）结构：多肽链借助各种非共价键（非共价力）弯曲、折叠成具有特定走向的紧密球状构象。弯曲、折叠成具有特定走向的紧密球状构象。四级（四级（4o）结构：寡聚）结构：寡聚蛋白质中各亚基之间在空
12、间上的蛋白质中各亚基之间在空间上的相互关系和结合方式。相互关系和结合方式。一个蛋白质分子为获得复杂结构所需的全部信息都含于一个蛋白质分子为获得复杂结构所需的全部信息都含于1o结构即多肽结构即多肽链的氨基酸序列中链的氨基酸序列中第17页，讲稿共111张，创作于星期三示示例例第18页，讲稿共111张，创作于星期三第19页，讲稿共111张，创作于星期三肌红蛋白的三级结构和丙酮磷酸异构酶的三级结构肌红蛋白的三级结构和丙酮磷酸异构酶的三级结构第20页，讲稿共111张，创作于星期三血血红红蛋蛋白白四四级级结结构构第21页，讲稿共111张，创作于星期三（四）、蛋白质功能的多样性（四）、蛋白质功能的多样性1.
13、1.催化功能催化功能-酶酶2.2.调节功能调节功能-激素、基因调控因子激素、基因调控因子3.3.转运功能转运功能-膜转运蛋白、血红膜转运蛋白、血红/血清蛋白血清蛋白4.4.贮存功能贮存功能-乳、蛋、谷蛋白乳、蛋、谷蛋白5.5.运动功能运动功能-鞭毛、肌肉蛋白鞭毛、肌肉蛋白6.6.结构成分结构成分-皮、毛、骨、牙、细胞骨架皮、毛、骨、牙、细胞骨架7.7.支架作用支架作用-接头蛋白接头蛋白8.8.防御功能防御功能-免疫球蛋白免疫球蛋白9.9.异常功能异常功能第22页，讲稿共111张，创作于星期三第23页，讲稿共111张，创作于星期三生老病死，万物轮回(蛋白质层次)生（诞生、生长）：生（诞生、生长）
14、：在酶催化下老细胞在酶催化下老细胞 计划性凋亡和新细胞的再生计划性凋亡和新细胞的再生（新陈代谢）（新陈代谢）、活、活细胞细胞的代谢的代谢老？老？蛋白质功能普遍衰退蛋白质功能普遍衰退(?)(?)病病个别蛋白质的功能障碍个别蛋白质的功能障碍死？死？蛋白质功能的全部停止蛋白质功能的全部停止/分解分解 蛋白质蛋白质生物功能分子生物功能分子第24页，讲稿共111张，创作于星期三单细胞生物胞外酶鞭毛-蛋白质（运动器官）细胞壁-糖、脂、肽细胞膜-载运蛋白、膜蛋白细胞质-酶蛋白（催化物质代谢）细胞核-酶蛋白（遗传）第25页，讲稿共111张，创作于星期三多细胞动物多细胞动物个体层次个体层次毛发、皮肤-角蛋白骨骼
15、、牙齿-钙+胶原蛋白肌肉-肌球蛋白/肌丝蛋白第26页，讲稿共111张，创作于星期三二、肽（二、肽（peptidepeptide）AA-NHAA-NH2 2与另一与另一AA-COOHAA-COOH间失水形成的间失水形成的酰胺键酰胺键称称肽键肽键，所形成的化合物称，所形成的化合物称肽肽。第27页，讲稿共111张，创作于星期三第28页，讲稿共111张，创作于星期三l由两个由两个AAAA组成的肽称为组成的肽称为二肽。二肽。l含几个至十几个含几个至十几个AAAA的肽链称为的肽链称为寡肽寡肽l由由2020个个AAAA以上组成的肽则称为以上组成的肽则称为多肽。多肽。l组成多肽的组成多肽的AAAA单元称为单元
16、称为氨基酸残基。氨基酸残基。第29页，讲稿共111张，创作于星期三多肽链中多肽链中AAAA残基按一定顺序排列：残基按一定顺序排列：氨基酸顺序氨基酸顺序含游离含游离-氨基的一端：氨基端或氨基的一端：氨基端或N-N-端端 含游离含游离-羧基的一端：羧基端或羧基的一端：羧基端或C-C-端端AAAA顺序是从顺序是从N-N-端开始以端开始以C-C-端氨基酸残基为终点端氨基酸残基为终点 如上述五肽：如上述五肽：Ser-Val-Tyr-Asp-GlnSer-Val-Tyr-Asp-Gln反过来写的是一个不同的肽反过来写的是一个不同的肽第30页，讲稿共111张，创作于星期三肽键是肽键是aaaa间的基本连接方式
17、。证据：间的基本连接方式。证据：、PrPr中游离中游离氨基和氨基和羧基很少。羧基很少。、人工合成的多肽能被蛋白酶水解。、人工合成的多肽能被蛋白酶水解。、PrPr能发生双缩脲反应（紫红色或蓝紫色）能发生双缩脲反应（紫红色或蓝紫色）、人工合成的多聚、人工合成的多聚aaaa的射线衍射图案和红的射线衍射图案和红外吸收光谱与天然的纤维状蛋白质十分相似。外吸收光谱与天然的纤维状蛋白质十分相似。、我国首次人工合成结晶牛胰岛素。、我国首次人工合成结晶牛胰岛素。第31页，讲稿共111张，创作于星期三（一）、肽和肽键的结构（一）、肽和肽键的结构肽键的特点是：肽键的特点是：NN上孤对电子与羰基有明显的共轭作用上孤对
18、电子与羰基有明显的共轭作用。第32页，讲稿共111张，创作于星期三肽键中肽键中C-NC-N键有部分键有部分 双键性质双键性质 不能自由旋转不能自由旋转组成肽键原子处于组成肽键原子处于 同一平面（肽平面）同一平面（肽平面）键长及键角一定键长及键角一定大多数情况以大多数情况以反式反式 结构存在结构存在第33页，讲稿共111张，创作于星期三共价主链共价主链 第34页，讲稿共111张，创作于星期三（二）、肽的物理化学性质（二）、肽的物理化学性质离子晶格，在水溶液中以偶极离子存在。离子晶格，在水溶液中以偶极离子存在。肽末端肽末端-羧基羧基pKa值比游离值比游离AA中的大。中的大。肽末端肽末端-氨基氨基p
19、Ka值比游离值比游离AA中的小。中的小。酸碱性质取决于：酸碱性质取决于：-羧基、羧基、-氨基、侧链基团的解离氨基、侧链基团的解离等电点，静电荷为零时溶液的等电点，静电荷为零时溶液的pH值。值。肽的化学反应也和肽的化学反应也和AA一样，游离的一样，游离的-羧基、羧基、-氨基、侧链基氨基、侧链基团可以发生类似团可以发生类似AA的反应，如茚三酮反应。的反应，如茚三酮反应。具有双缩脲反应具有双缩脲反应肽特有的反应。肽特有的反应。（紫红色或蓝紫色）（紫红色或蓝紫色）第35页，讲稿共111张，创作于星期三（三）、（三）、天然存在的活性肽天然存在的活性肽生物体中多肽最重要的存在形式是作为生物体中多肽最重要的
20、存在形式是作为蛋蛋白质的亚单位白质的亚单位；有许多分子量比较小的寡（多）肽以有许多分子量比较小的寡（多）肽以游离游离状态状态存在，这类肽通常都具有特殊的生理存在，这类肽通常都具有特殊的生理功能，常称为功能，常称为活性肽活性肽。如：脑啡肽、激素类多肽、抗生素类多肽、如：脑啡肽、激素类多肽、抗生素类多肽、谷胱甘肽谷胱甘肽、蛇毒多肽等、蛇毒多肽等第36页，讲稿共111张，创作于星期三 +H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO-+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO-Met-脑啡肽 Leu-脑啡肽第37页，讲稿共111张，创作于星期三L-Leu-D-Phe-L-Pro
21、-L-ValL-OrnL-OrnL-Val-L-Pro-D-Phe-L-Leu短杆菌肽短杆菌肽S(S(环十肽环十肽)由由细细菌菌分分泌泌，含含有有D-AAD-AA和和一一些些不不常常见见AAAA，如鸟氨酸（如鸟氨酸（Ornithine,Orn）。）。第38页，讲稿共111张，创作于星期三鹅膏覃碱是一种环状八肽，真核生物鹅膏覃碱是一种环状八肽，真核生物RNA聚合酶聚合酶II的抑的抑制剂（能与制剂（能与RNA聚合酶紧紧结合）聚合酶紧紧结合）第39页，讲稿共111张，创作于星期三第40页，讲稿共111张，创作于星期三三、蛋白质一级结构的测定三、蛋白质一级结构的测定l蛋白质蛋白质AAAA顺序测定是蛋白
22、质化学研究的基础顺序测定是蛋白质化学研究的基础l19531953年年F.SangerF.Sanger测定了胰岛素的一级结构测定了胰岛素的一级结构l现已有成千上万种不同蛋白质的一级结构被测定。现已有成千上万种不同蛋白质的一级结构被测定。什么是什么是PrPr的一级结构？的一级结构？蛋白质中氨基酸的排列顺序。第41页，讲稿共111张，创作于星期三第42页，讲稿共111张，创作于星期三1.1.样品必需纯（样品必需纯（97%97%以上）以上）2.2.知道蛋白质的分子量知道蛋白质的分子量3.3.知道蛋白质由几个亚基组成知道蛋白质由几个亚基组成4.4.测定蛋白质的测定蛋白质的AAAA组成并根据分子量组成并根
23、据分子量 计算每种计算每种AAAA的个数的个数5.5.测定水解液中的氨量计算酰胺的含量测定水解液中的氨量计算酰胺的含量蛋白质测序前提蛋白质测序前提第43页，讲稿共111张，创作于星期三（一）、蛋白质测序策略（一）、蛋白质测序策略(1)测定蛋白质分子中多肽链的数目测定蛋白质分子中多肽链的数目通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。链的数目。蛋蛋白白质质一一级级结结构构的的测测定定第44页，讲稿共111张，创作于星期三（一）、蛋白质测序策略（一）、蛋白质测序策略(2)(2)多肽链的拆分多肽链的
24、拆分蛋蛋白白质质一一级级结结构构的的测测定定第45页，讲稿共111张，创作于星期三（一）、蛋白质测序策略（一）、蛋白质测序策略几条多肽链借助几条多肽链借助非共价键非共价键连接在一起，连接在一起，称为寡聚蛋白质，血红蛋白为四聚体，称为寡聚蛋白质，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体。烯醇化酶为二聚体。可用可用8mol/L8mol/L尿素或尿素或6mol/L6mol/L盐酸胍处理，盐酸胍处理，即可分开多肽链即可分开多肽链(亚基亚基)。蛋蛋白白质质一一级级结结构构的的测测定定第46页，讲稿共111张，创作于星期三（一）、蛋白质测序策略（一）、蛋白质测序策略(3)(3)断开二硫键断开二硫键在在8mol/
25、L8mol/L尿素或尿素或6mol/L6mol/L盐酸胍存在下，盐酸胍存在下，用过量的用过量的-巯基乙醇巯基乙醇处理，使二硫键还处理，使二硫键还原为巯基，然后用原为巯基，然后用烷基化试剂保护烷基化试剂保护生成生成的巯基，防止重新被氧化。的巯基，防止重新被氧化。蛋蛋白白质质一一级级结结构构的的测测定定第47页，讲稿共111张，创作于星期三第48页，讲稿共111张，创作于星期三巯巯基基（-S SH H）的的保保护护第49页，讲稿共111张，创作于星期三（一）、蛋白质测序策略（一）、蛋白质测序策略蛋蛋白白质质一一级级结结构构的的测测定定(4)(4)测定每条多肽链的测定每条多肽链的AAAA组成，并计算
26、出组成，并计算出AAAA成分的分子比成分的分子比部分样品进行完全水解，测定氨基酸组成部分样品进行完全水解，测定氨基酸组成第50页，讲稿共111张，创作于星期三第51页，讲稿共111张，创作于星期三（一）、蛋白质测序策略（一）、蛋白质测序策略(5)(5)分析多肽链的分析多肽链的N-N-末端和末端和C-C-末端末端(6)(6)多肽链断裂成多个肽段多肽链断裂成多个肽段采用两采用两/多种多种不同的断裂方法不同的断裂方法将多肽将多肽 断裂成两套或多套肽段，并将其分离。断裂成两套或多套肽段，并将其分离。蛋蛋白白质质一一级级结结构构的的测测定定第52页，讲稿共111张，创作于星期三（一）、蛋白质测序策略（一
27、）、蛋白质测序策略(7)(7)测定每个肽段的氨基酸顺序测定每个肽段的氨基酸顺序蛋蛋白白质质一一级级结结构构的的测测定定(8)(8)确定肽段在多肽链中的次序确定肽段在多肽链中的次序 利用两利用两/多套肽段的多套肽段的AAAA顺序彼此间的交错顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的重叠，拼凑出整条多肽链的AAAA顺序。顺序。第53页，讲稿共111张，创作于星期三(9)(9)确定原多肽链中二硫键的位置。确定原多肽链中二硫键的位置。（一）、蛋白质测序策略（一）、蛋白质测序策略蛋蛋白白质质一一级级结结构构的的测测定定胃蛋白酶水解胃蛋白酶水解第54页，讲稿共111张，创作于星期三两类多肽链末端氨基酸残基：
28、两类多肽链末端氨基酸残基：N-N-端氨基酸端氨基酸 C-C-端氨基酸端氨基酸在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-N-端氨基酸分析法。端氨基酸分析法。（二）、末端氨基酸残基测定（二）、末端氨基酸残基测定第55页，讲稿共111张，创作于星期三Sanger法法1 1、末末端端分分析析 二硝基氟苯（二硝基氟苯（DNFBDNFB）法）法O2NFNO2+H2NCHCROHNCHCROO2NNO2H+H2OO2NNO2HNCHCROOH+氨基酸氨基酸DNFBN-端氨基酸端氨基酸DNP衍生物衍生物DNP-氨基酸氨基酸（二）、末端氨基酸残基的鉴定（二）、末端氨基酸残基的鉴定N
29、碱性条件碱性条件二硝基苯衍生物二硝基苯衍生物黄色黄色第56页，讲稿共111张，创作于星期三二甲氨基萘磺酰二甲氨基萘磺酰-AA-AA有强荧光，检测灵敏度高有强荧光，检测灵敏度高 丹磺酰氯（丹磺酰氯（DNSDNS）法）法（二）、末端氨基酸残基的鉴定（二）、末端氨基酸残基的鉴定、末末端端分分析析1N碱性条件碱性条件(DNS-aa)第57页，讲稿共111张，创作于星期三苯异硫氰酸酯（苯异硫氰酸酯（PITC)PITC)法法（二）、末端氨基酸残基的鉴定（二）、末端氨基酸残基的鉴定、末末端端分分析析1N第58页，讲稿共111张，创作于星期三N=C=S +NCH CONHCHHR1PITCNCNCHCONHC
30、HHRSPTC-多肽NCHRSNCCOPTH-氨基酸pH8.3无水HF苯异硫氰酸酯苯异硫氰酸酯PITCR2多肽多肽+NCH CONHCHHR2R3少一个氨基酸的多肽少一个氨基酸的多肽第59页，讲稿共111张，创作于星期三肽链外切酶肽链外切酶:从多肽链从多肽链N-N-端逐个向里水解端逐个向里水解根据不同反应时间测出释放的根据不同反应时间测出释放的AAAA种类和数量，种类和数量，按反应时间和按反应时间和AAAA残基释放量作动力学曲线残基释放量作动力学曲线 蛋白质蛋白质N-N-末端残基顺序。末端残基顺序。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶 水解以水解以LeuLeu残基为残基为N
31、-N-末端的肽键速度最大。末端的肽键速度最大。氨肽酶法氨肽酶法（二）、末端氨基酸残基的鉴定（二）、末端氨基酸残基的鉴定、末末端端分分析析1N第60页，讲稿共111张，创作于星期三氨基酸酰肼可与苯甲醛缩合成不溶于水的物质。氨基酸酰肼可与苯甲醛缩合成不溶于水的物质。上清中的氨基酸可通过其他方法鉴定上清中的氨基酸可通过其他方法鉴定 肼解法肼解法（二）、末端氨基酸残基的鉴定（二）、末端氨基酸残基的鉴定、末末端端分分析析2C1n-1第61页，讲稿共111张，创作于星期三（二）、末端氨基酸残基的鉴定（二）、末端氨基酸残基的鉴定、末末端端分分析析2C C末端末端AA AA 氨基醇氨基醇 水解肽链，鉴定水解肽
32、链，鉴定氨基醇氨基醇 还原法还原法硼氢化锂硼氢化锂第62页，讲稿共111张，创作于星期三肽链外切酶肽链外切酶:从多肽链从多肽链C-C-端逐个水解端逐个水解根据不同反应时间释放出的根据不同反应时间释放出的AAAA种类和数量种类和数量 蛋白质蛋白质C-C-末端残基顺序。末端残基顺序。四种羧肽酶：四种羧肽酶：A,B,CA,B,C和和Y Y；A A和和B(B(胰脏胰脏)、C(C(柑桔叶柑桔叶)、Y(Y(面包酵母面包酵母)A:A:除除Pro/Arg/Lys/Pro/Arg/Lys/外所有外所有C-C-末端末端AAAA残基残基 B:B:只水解只水解ArgArg和和LysLys为为C-C-末端残基的肽键末端
33、残基的肽键 Y Y：可作用于任何一个：可作用于任何一个C-C-末端残基的肽键末端残基的肽键羧肽酶法羧肽酶法（二）、末端氨基酸残基的鉴定（二）、末端氨基酸残基的鉴定、末末端端分分析析2C第63页，讲稿共111张，创作于星期三（三）、二硫键的断裂（三）、二硫键的断裂盐酸胍/尿素解离多肽链间的非共价力。应用过甲酸氧化法或巯基还原法拆分多肽链间的二硫键。第64页，讲稿共111张，创作于星期三1 1、酸水解、酸水解常用常用6 6M盐酸或盐酸或4 4M硫酸硫酸优点：水解产物不消旋优点：水解产物不消旋缺点：缺点：Trp被沸酸完全破坏被沸酸完全破坏 含羟基含羟基SerSer、ThrThr、TyrTyr部分分解
34、部分分解 AsnAsn、GlnGln酰胺基被水解酰胺基被水解（四）、氨基酸组成的分析（四）、氨基酸组成的分析第65页，讲稿共111张，创作于星期三2 2、碱水解、碱水解一般用一般用5 5M氢氧化钠氢氧化钠缺点：许多缺点：许多AAAA受到不同程度的破坏受到不同程度的破坏 部分水解产物发生部分水解产物发生消旋化消旋化优点：优点：TrpTrp不受破坏不受破坏（四）、氨基酸组成的分析（四）、氨基酸组成的分析第66页，讲稿共111张，创作于星期三1 1、酶解法酶解法:内切酶：内切酶：胰蛋白酶胰蛋白酶、糜蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶外切酶：羧肽酶和氨肽酶外切酶：羧肽酶和氨
35、肽酶多多肽肽链链的的选选择择性性降降解解 （五）、多肽链的部分裂解和（五）、多肽链的部分裂解和 肽段混合物的分离纯化肽段混合物的分离纯化目前序列分析方法最长只能几十个残基，因此需要裂解多肽，然后分目前序列分析方法最长只能几十个残基，因此需要裂解多肽，然后分离纯化。离纯化。第67页，讲稿共111张，创作于星期三R1=Lys（K）或）或Arg（R）专一性较强，水解速度快专一性较强，水解速度快R2=Pro（抑制）（抑制）肽链肽链水解位点水解位点胰蛋白酶胰蛋白酶trypsin减少断裂点：减少断裂点：保护保护LysLys侧链侧链-NH-NH2 2或修饰或修饰ArgArg胍基胍基增加断裂点：增加断裂点：将
36、将CysCys变为类似变为类似LysLys的结构的结构第68页，讲稿共111张，创作于星期三R1=Phe（F）、）、Trp（W）Tyr（Y）等疏水）等疏水性性AALeu、Met和和His稍慢稍慢R2=Pro（抑制）（抑制）pH8-9肽链肽链水解位点水解位点糜蛋白酶糜蛋白酶/胰凝乳蛋白酶（胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）水解速度与相邻水解速度与相邻AAAA性质有关性质有关:酸性：酸性：-/-/碱性：碱性：+第69页，讲稿共111张，创作于星期三R2=Phe（F）、）、Trp（W）、）、Tyr（Y）、）、Leu（L）、）、Ile（I）、）、Met（M）、）、Val（V）及其它疏水性强）及其
37、它疏水性强的的AA水解速度较快水解速度较快肽链肽链水解位点水解位点R2=Pro或或Gly，不水解，不水解R1或或R3=Pro，抑制水解，抑制水解嗜热菌蛋白酶嗜热菌蛋白酶（thermolysin)第70页，讲稿共111张，创作于星期三R1和和/或或R2Phe（F）、）、Trp（W）、）、Tyr（Y）、）、Leu（L）及其它疏水性）及其它疏水性AA水解水解速度较快速度较快 R1=Pro（抑制）（抑制）pH2肽链肽链水解位点水解位点胃蛋白酶胃蛋白酶Pepsin第71页，讲稿共111张，创作于星期三肽链肽链水解位点水解位点羧肽酶和氨肽酶羧肽酶和氨肽酶第72页，讲稿共111张，创作于星期三2 2、化学裂
38、解法、化学裂解法 溴化氰水解法溴化氰水解法(Cyanogen bromide)选择性地切割由选择性地切割由MetMet羧基形成的肽键。羧基形成的肽键。（五）、多肽链的部分裂解和（五）、多肽链的部分裂解和 肽段混合物的分离纯化肽段混合物的分离纯化多多肽肽链链的的选选择择性性降降解解第73页，讲稿共111张，创作于星期三 NH2OH断裂：断裂：较专一性断裂较专一性断裂Asn-Gly之间的肽键之间的肽键 Asn-Leu及及Asn-Ala键也能部分断裂键也能部分断裂第74页，讲稿共111张，创作于星期三3 3、肽段的分离纯化：、肽段的分离纯化：凝胶过滤、凝胶电泳和凝胶过滤、凝胶电泳和HPLCHPLC法
39、法第75页，讲稿共111张，创作于星期三N-N-端分析法端分析法特点：能够不断重复循环，将肽链特点：能够不断重复循环，将肽链N-N-端氨端氨基酸残基逐一进行标记和解离。基酸残基逐一进行标记和解离。1 1、Edman法法（六）、肽段氨基酸序列的测定（六）、肽段氨基酸序列的测定（苯异硫氰酸酯法）苯异硫氰酸酯法）Edman于于1950年首先提出。年首先提出。第76页，讲稿共111张，创作于星期三无水无水氨基非质子化氨基非质子化PITCPTC-肽肽第77页，讲稿共111张，创作于星期三第78页，讲稿共111张，创作于星期三第79页，讲稿共111张，创作于星期三2 2、氨肽酶法或羧肽酶法、氨肽酶法或羧肽
40、酶法3 3、质谱法（、质谱法（MSMS）灵敏度高、所需样品少、测定速度快灵敏度高、所需样品少、测定速度快第80页，讲稿共111张，创作于星期三第81页，讲稿共111张，创作于星期三第82页，讲稿共111张，创作于星期三第83页，讲稿共111张，创作于星期三第84页，讲稿共111张，创作于星期三核糖体核糖体蛋白质链蛋白质链4.4.根据核苷酸序列的推定法根据核苷酸序列的推定法第85页，讲稿共111张，创作于星期三根据核苷酸序列的推定法：根据核苷酸序列的推定法：（1 1）用待测的蛋白质作抗原免疫动物）用待测的蛋白质作抗原免疫动物 抗体抗体（2 2）分离多核糖体）分离多核糖体（3 3）抗体沉淀此种蛋白
41、质多核糖体）抗体沉淀此种蛋白质多核糖体（4 4）分离该蛋白质的模板）分离该蛋白质的模板mRNAmRNA，（5 5）反转录成）反转录成cDNAcDNA（6 6）根据测定）根据测定cDNAcDNA序列推测蛋白质的序列推测蛋白质的AAAA序列。序列。注意：必须知道蛋白质注意：必须知道蛋白质N-N-末端和末端和C-C-末端氨基酸残基末端氨基酸残基第86页，讲稿共111张，创作于星期三（七）、肽段在多肽链中次序的决定重叠肽（重叠肽（overlaping peptide）第87页，讲稿共111张，创作于星期三胃蛋白酶胃蛋白酶处理没有断开二硫键的多肽链处理没有断开二硫键的多肽链经电泳分离各肽段经电泳分离各肽
42、段用过甲酸用过甲酸断开二硫键断开二硫键，含有，含有-S-S-的肽段的肽段带电性质发生变化，转向带电性质发生变化，转向90二次电泳，二次电泳，曾含二硫键的肽段迁移率发生变化曾含二硫键的肽段迁移率发生变化然后同其它方法分析的肽段进行比较，确然后同其它方法分析的肽段进行比较，确定二硫键的位置定二硫键的位置（八）、二硫键位置的确定（八）、二硫键位置的确定第88页，讲稿共111张，创作于星期三胃蛋白酶胃蛋白酶最适最适pHpH约约2 2，此时二硫键不断开，此时二硫键不断开专一性低、肽段短专一性低、肽段短第89页，讲稿共111张，创作于星期三（九）、蛋白质测序举例第90页，讲稿共111张，创作于星期三（十）
43、蛋白质序列数据库（十）蛋白质序列数据库 www.ncbi.nlm.nih.gov第91页，讲稿共111张，创作于星期三 同源蛋白质：同源蛋白质：来自来自不同不同生物体、生物体、执行同一执行同一/相似功能的蛋白质相似功能的蛋白质 同种蛋白质：同种蛋白质：来自来自相同相同生物体、生物体、执行同一功能的蛋白质执行同一功能的蛋白质 同源蛋白质的同源蛋白质的AA序列具有明显的相似性序列具有明显的相似性 序列同源性（序列同源性（sequence homology）不变残基不变残基/可变残基可变残基1 1、同源蛋白质、同源蛋白质四、蛋白质的四、蛋白质的AAAA序列与生物功能序列与生物功能（一）同源蛋白质的物
44、种差异与生物进化（一）同源蛋白质的物种差异与生物进化第92页，讲稿共111张，创作于星期三 一百多个一百多个AA残基残基 MW约约12.5103 2 8个不变残基个不变残基 序列间序列间AA差异数与物种间系统发生差异成比例；差异数与物种间系统发生差异成比例；进化位置上相差愈远，进化位置上相差愈远，AA序列之间的差别愈大。序列之间的差别愈大。细胞色素细胞色素C的的AA序列差异可用于核对各物种间的分序列差异可用于核对各物种间的分类学关系以及绘制系统树类学关系以及绘制系统树/进化树。进化树。2 2、细胞色素、细胞色素C C与系统树与系统树第93页，讲稿共111张，创作于星期三invariant re
45、sidues(yellow)conservative substitutions(blue)nonconservative or variable residues(unshaded)Conservation and variation of cytochrome c sequences第94页，讲稿共111张，创作于星期三第95页，讲稿共111张，创作于星期三第96页，讲稿共111张，创作于星期三 序列同源关系表明随机突变导致一级序列同源关系表明随机突变导致一级 结构方面结构方面AA取代取代/趋异事件的进化顺序。趋异事件的进化顺序。1、氧合血红蛋白、氧合血红蛋白（二）同源蛋白质具有共同的进化
46、起源（二）同源蛋白质具有共同的进化起源第97页，讲稿共111张，创作于星期三该酶类活性中心的该酶类活性中心的Ser残基残基起关键作用起关键作用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、凝血酶和纤溶酶凝血酶和纤溶酶有有序列同源性序列同源性对对底物偏爱不同底物偏爱不同2、丝氨酸蛋白酶类、丝氨酸蛋白酶类第98页，讲稿共111张，创作于星期三卵清中的溶菌酶（卵清中的溶菌酶（lysozymelysozyme）-乳清蛋白（乳清蛋白（lactalbuminlactalbumin）三级结构很相似三级结构很相似 也可能具有共同的祖先。也可能具有共同的祖先。3、一些功能差异很大的蛋白
47、质、一些功能差异很大的蛋白质第99页，讲稿共111张，创作于星期三（三）血液凝固与（三）血液凝固与AA序列的局部断裂序列的局部断裂 凝血酶原凝血酶原血液凝固：在凝血因子的作用下，可溶性的血纤血液凝固：在凝血因子的作用下，可溶性的血纤蛋白原转变为不溶性的血纤蛋白网。蛋白原转变为不溶性的血纤蛋白网。可溶性的可溶性的血纤蛋白原血纤蛋白原酶酶有活性的凝血酶有活性的凝血酶不溶性的不溶性的血纤蛋白网血纤蛋白网第100页，讲稿共111张，创作于星期三第101页，讲稿共111张，创作于星期三（一）肽的人工合成（一）肽的人工合成 保护（保护（氨基、羧基、侧链活性基团氨基、羧基、侧链活性基团）活化（活化（氨基、羧
48、基氨基、羧基）缩合剂缩合剂（二）胰岛素的人工合成（二）胰岛素的人工合成（三）固相肽合成（三）固相肽合成五、肽与蛋白质的人工合成五、肽与蛋白质的人工合成第102页，讲稿共111张，创作于星期三树脂树脂挂接挂接第103页，讲稿共111张，创作于星期三1.1.有一多肽经酸水解后产生等摩尔的有一多肽经酸水解后产生等摩尔的LysLys，GlyGly和和A1a.A1a.如用胰蛋白如用胰蛋白酶水解该肽，仅发现有游离的酶水解该肽，仅发现有游离的GlyGly和一种二肽。下列多肽的一级结构和一种二肽。下列多肽的一级结构中，哪一个符合该肽的结构中，哪一个符合该肽的结构?A.Gly-Lys-Ala-Lys-Gly-A
49、la A.Gly-Lys-Ala-Lys-Gly-Ala B.Ala-Lys-Gly B.Ala-Lys-Gly C.Lys-Gly-Ala C.Lys-Gly-Ala D.Gly-Lys-Ala D.Gly-Lys-Ala E.Ala-Gly-Lys E.Ala-Gly-Lys2.2.测定小肽氨基酸顺序的最好方法是测定小肽氨基酸顺序的最好方法是 A.2A.2，4-4-二硝基氟苯法二硝基氟苯法(FDNB(FDNB法法)B.B.二甲氨基萘磺酰氯法二甲氨基萘磺酰氯法(DNS-Cl(DNS-Cl法法)C.C.氨肽酶法氨肽酶法 D.D.苯异硫氰酸法苯异硫氰酸法(PITC(PITC法法)E.E.羧肽酶法
50、羧肽酶法选择题选择题 第104页，讲稿共111张，创作于星期三3.3.用下列方法测定蛋白质含量，哪一种方法需要完整的肽键用下列方法测定蛋白质含量，哪一种方法需要完整的肽键?A.A.双缩脲反应双缩脲反应 B.B.克氏定氮克氏定氮 C.C.紫外吸收紫外吸收 D.D.茚三酮反应茚三酮反应 E.E.奈氏试剂奈氏试剂4.4.下列关于蛋白质中下列关于蛋白质中L-L-氨基酸之间形成的肽键的叙述，哪些是氨基酸之间形成的肽键的叙述，哪些是正确的正确的?(1).(1).具有部分双键的性质具有部分双键的性质 (2).(2).比通常的比通常的C-NC-N单键短单键短 (3).(3).通常有一个反式构型通常有一个反式构