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1、关于抗体工程制药第1页，讲稿共104张，创作于星期二第一节第一节 概概 述述第2页，讲稿共104张，创作于星期二一、基本概念一、基本概念1、抗体（、抗体（antibody，Ab）n指机体的免疫细胞被抗原激活后，由指机体的免疫细胞被抗原激活后，由B淋巴细胞增殖分化成淋巴细胞增殖分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。白。n主要分布在血清中，也分布于组织液及外分泌液中。主要分布在血清中，也分布于组织液及外分泌液中。即能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球即能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。蛋白。第3页，讲稿
2、共104张，创作于星期二2、免疫球蛋白（、免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）n具有抗体活性或化学结构上与抗体相似的球蛋白。具有抗体活性或化学结构上与抗体相似的球蛋白。n因结构不同可分为因结构不同可分为IgG、IgA、IgM、IgD和和IgE 5种种。免疫球蛋白是结构及化学的概念，而抗体是生物学及功能的概念。免疫球蛋白是结构及化学的概念，而抗体是生物学及功能的概念。第4页，讲稿共104张，创作于星期二3、抗原（、抗原（antigen，Ag）n一类能刺激机体免疫系统使之产生特异性免疫应答，一类能刺激机体免疫系统使之产生特异性免疫应答，并能与相应免疫应答产物并能与相应免疫应答产物(抗体
3、抗体)在体内外发生特异性在体内外发生特异性结合的物质结合的物质。l抗原的基本特性有两种，一是诱导免疫应答的能力，也就抗原的基本特性有两种，一是诱导免疫应答的能力，也就是是免疫原性免疫原性，二是与免疫应答的产物发生反应，也就，二是与免疫应答的产物发生反应，也就是是反应原性反应原性。第5页，讲稿共104张，创作于星期二抗原的分类抗原的分类 n完全抗原（完全抗原（complete antigen）简称抗原。是一类既有免疫原性，又有简称抗原。是一类既有免疫原性，又有反应性反应性性性的物质。如大多数的物质。如大多数蛋白质蛋白质、细菌、病毒、细菌、病毒、细细菌外毒素菌外毒素等都是完全抗原。等都是完全抗原。
4、n不完全抗原不完全抗原 即半抗原，是只具有免疫反应性，而无免疫原即半抗原，是只具有免疫反应性，而无免疫原性的物质。如：多糖、青霉素、磺胺剂和花粉性的物质。如：多糖、青霉素、磺胺剂和花粉等。半抗原与蛋白质等。半抗原与蛋白质载体载体结合后，就获得了免结合后，就获得了免疫原性。疫原性。第6页，讲稿共104张，创作于星期二4、抗原表位（、抗原表位（epitope）n指抗原分子中决定抗原特异性的特殊指抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团化学基团。l 又称为又称为抗原决定簇抗原决定簇。第7页，讲稿共104张，创作于星期二抗体工程制药抗体工程制药（antibody engineering pharmace
5、utics）l是指利用基因工程、细胞工程和转基因动植物是指利用基因工程、细胞工程和转基因动植物技术技术生产抗体药物生产抗体药物的过程。的过程。第8页，讲稿共104张，创作于星期二抗体药物的应用抗体药物的应用 n治疗肿瘤治疗肿瘤 目前在临床中使用的肿瘤治疗药物多数存在目前在临床中使用的肿瘤治疗药物多数存在“敌我敌我不分不分”的问题，即在杀死肿瘤细胞的同时，也破坏了人的问题，即在杀死肿瘤细胞的同时，也破坏了人体正常细胞。体正常细胞。“生物导弹生物导弹”为解决这个难题提供了一个理想的思路。为解决这个难题提供了一个理想的思路。“生物导弹生物导弹”，即将各种毒素、放射性同位素、化疗药，即将各种毒素、放射
6、性同位素、化疗药物与识别肿瘤特异抗原或肿瘤相关抗原的抗体偶联后，物与识别肿瘤特异抗原或肿瘤相关抗原的抗体偶联后，能够特异杀伤肿瘤细胞的一类药物。这种药物经由静脉能够特异杀伤肿瘤细胞的一类药物。这种药物经由静脉注入人体内，药效分子集中作用于肿瘤细胞，既增强疗注入人体内，药效分子集中作用于肿瘤细胞，既增强疗效又减少对机体的毒副作用。放射性同位素与抗体的偶效又减少对机体的毒副作用。放射性同位素与抗体的偶联物在体内能将前者运至药靶部位，并通过其放射性活联物在体内能将前者运至药靶部位，并通过其放射性活性杀伤靶细胞。性杀伤靶细胞。第9页，讲稿共104张，创作于星期二n逆转器官移植排斥逆转器官移植排斥 进行
7、器官移植时，可以采用某些抗体类药物来进行器官移植时，可以采用某些抗体类药物来逆转器官移植引起的排斥反应。如最早批准逆转器官移植引起的排斥反应。如最早批准（1986年）进入美国市场的治疗性抗体类药物年）进入美国市场的治疗性抗体类药物抗抗CD3单抗即被用于肾、心脏、肝脏移植单抗即被用于肾、心脏、肝脏移植排斥的逆转。排斥的逆转。第10页，讲稿共104张，创作于星期二n目前正在进行开发和已经投入市场的抗体药物主要有以目前正在进行开发和已经投入市场的抗体药物主要有以下几种用途：下几种用途：1器官移植排斥反应的逆转；器官移植排斥反应的逆转；2肿瘤免疫诊断；肿瘤免疫诊断；3肿瘤免疫显像；肿瘤免疫显像；4肿瘤
8、导向治疗；肿瘤导向治疗；5哮喘、牛皮癣、类哮喘、牛皮癣、类风湿性关节炎风湿性关节炎、红斑狼疮红斑狼疮、急性心梗、急性心梗、脓毒症、多发性硬化症及其他脓毒症、多发性硬化症及其他自身免疫自身免疫性疾病；性疾病；6抗独特型抗体作为分子瘤苗治疗肿瘤；抗独特型抗体作为分子瘤苗治疗肿瘤；第11页，讲稿共104张，创作于星期二抗体工程的发展抗体工程的发展19371937年用电泳法将血清分为白蛋白、甲种、乙种、丙种球蛋年用电泳法将血清分为白蛋白、甲种、乙种、丙种球蛋白，并证明抗体活性主要存在于白，并证明抗体活性主要存在于丙种球蛋白丙种球蛋白组分。组分。1975年，年，kohler和和milstein首次利用首
9、次利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备淋巴细胞杂交瘤技术制备出出 单克隆抗体单克隆抗体，得以规模化制备特异性、均质性抗体。，得以规模化制备特异性、均质性抗体。通过通过基因工程技术基因工程技术制备人制备人-鼠嵌合抗体、人源化抗体等。鼠嵌合抗体、人源化抗体等。第12页，讲稿共104张，创作于星期二抗体技术发展经历的三个阶段：抗体技术发展经历的三个阶段：l第一代：抗血清多克隆抗体第一代：抗血清多克隆抗体l第二代：第二代：70年代中期，利用年代中期，利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备的淋巴细胞杂交瘤技术制备的杂交瘤单克隆抗体（杂交瘤单克隆抗体（McAb）l第三代：基因工程抗体。第三代：基因工程抗体。第13页，讲稿共
10、104张，创作于星期二多克隆抗体多克隆抗体(polyclonal antibody,pAb)n天然抗原分子中常含有天然抗原分子中常含有多多种抗原决定簇种抗原决定簇，以该物质，以该物质刺激机体，体内刺激机体，体内多个多个B淋淋巴细胞被激活巴细胞被激活，产生的抗，产生的抗体实际上含有针对多种体实际上含有针对多种不同抗原表位的抗体，不同抗原表位的抗体，是多克隆抗体；是多克隆抗体；1、抗血清、抗血清第14页，讲稿共104张，创作于星期二l动物脾脏有上百万种不同的动物脾脏有上百万种不同的B淋淋巴细胞系巴细胞系，不同的，不同的B淋巴细胞合淋巴细胞合成不同的抗体。成不同的抗体。多克隆抗体的产生过程多克隆抗体
11、的产生过程n当机体受当机体受抗原抗原刺激时，抗原分子刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别上的许多决定簇分别激活各个激活各个B细胞细胞。n被激活的被激活的B细胞分裂增殖形成细胞分裂增殖形成浆细浆细胞胞，大量的浆细胞合成和分泌大量，大量的浆细胞合成和分泌大量的抗体分子分布到血液、体液中。的抗体分子分布到血液、体液中。第15页，讲稿共104张，创作于星期二获得多抗的途径：获得多抗的途径：n动物免疫血清动物免疫血清n恢复期患者血清恢复期患者血清n免疫接种人群血清免疫接种人群血清第16页，讲稿共104张，创作于星期二动物抗血清的优缺点动物抗血清的优缺点n从动物血清提取抗体主要克服了人血浆来源有从动物血清提
12、取抗体主要克服了人血浆来源有限造成的制约。限造成的制约。n然而，动物来源产品均存在潜在的危险，如然而，动物来源产品均存在潜在的危险，如过敏过敏和和传播感染性病原体传播感染性病原体等。等。n多抗多抗体异性不高体异性不高，易发生交叉反应。，易发生交叉反应。第17页，讲稿共104张，创作于星期二 解决单抗特异性不高的理想方法是针对单一表解决单抗特异性不高的理想方法是针对单一表位的特异性抗体位的特异性抗体-单克隆抗体单克隆抗体。第18页，讲稿共104张，创作于星期二2、单克隆抗体（、单克隆抗体（monoclonal antibody，mAb）第19页，讲稿共104张，创作于星期二n如果能选出一个浆细胞
13、进行培养，就可得到由单细胞经如果能选出一个浆细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即分裂增殖而形成细胞群，即单克隆单克隆。单克隆细胞将合成针。单克隆细胞将合成针对一种抗原决定簇的抗体，称为对一种抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体单克隆抗体（mAb）。单克隆抗体的概念单克隆抗体的概念第20页，讲稿共104张，创作于星期二问题：n浆细胞在体外寿命短，难以培养和扩增，怎么浆细胞在体外寿命短，难以培养和扩增，怎么办？办？第21页，讲稿共104张，创作于星期二解决办法解决办法 1975年，年，kohler和和milstein将以下两种细胞将以下两种细胞融合：融合：lB细胞细胞：能产生抗体，
14、但寿命短：能产生抗体，但寿命短l骨髓瘤细胞：寿命长骨髓瘤细胞：寿命长杂交瘤细胞杂交瘤细胞第22页，讲稿共104张，创作于星期二mAb制备过程制备过程第23页，讲稿共104张，创作于星期二l每个杂交瘤细胞由一每个杂交瘤细胞由一个个B细胞与一个骨髓瘤细胞细胞与一个骨髓瘤细胞融合融合，仅合成和分泌抗单一抗原表位的特异性抗体，仅合成和分泌抗单一抗原表位的特异性抗体，即单克隆抗体。即单克隆抗体。l优点：结构单一，特异性强，交叉反应少。优点：结构单一，特异性强，交叉反应少。第24页，讲稿共104张，创作于星期二问题n从从动物动物脾脏脾脏B细胞获得的单克隆抗体（即细胞获得的单克隆抗体（即鼠源鼠源性抗体性抗体
15、）对人具有较强的免疫原性，会产生人）对人具有较强的免疫原性，会产生人抗鼠抗体抗鼠抗体（HAMA)。n对单克隆抗体进行改造，产生了对单克隆抗体进行改造，产生了基因工程抗体基因工程抗体。第25页，讲稿共104张，创作于星期二3、基因工程抗体、基因工程抗体（genetically engineered antibodies，gAb）n是通过基因工程技术获得抗体，即通过是通过基因工程技术获得抗体，即通过PCR技术获得抗体基技术获得抗体基因，与载体重组后，引入表达系统后，表达产生的抗体。因，与载体重组后，引入表达系统后，表达产生的抗体。n优点：即保持了单抗的优点：即保持了单抗的均一性、特异性强均一性、特
16、异性强的优点，又能的优点，又能克克服其作为鼠源性抗体的不足服其作为鼠源性抗体的不足。第26页，讲稿共104张，创作于星期二n简言之，基因工程抗体就是将人源抗体的编码简言之，基因工程抗体就是将人源抗体的编码基因克隆到真核或原核表达系统中，体外表达基因克隆到真核或原核表达系统中，体外表达人源化抗体人源化抗体n其根本出发点是其根本出发点是解决抗体的鼠源性问题解决抗体的鼠源性问题。第27页，讲稿共104张，创作于星期二第二节第二节 抗体分子的结构和功能抗体分子的结构和功能第28页，讲稿共104张，创作于星期二二、抗体的结构二、抗体的结构第29页，讲稿共104张，创作于星期二（一）基本结构（一）基本结构
17、第30页，讲稿共104张，创作于星期二1.轻链（轻链（light chain，L链）链）l由由214个氨基酸残基组成，相对分子量个氨基酸残基组成，相对分子量25kD，同一抗体分，同一抗体分子上子上2条条L链总是相同。链总是相同。第31页，讲稿共104张，创作于星期二2.重链（重链（heavy chain，H链）链）l由由450570个氨基酸组成，相对分子量约个氨基酸组成，相对分子量约5070kD。l每条每条H链含有链含有45个链内二硫键所组成的环肽，为球形。个链内二硫键所组成的环肽，为球形。第32页，讲稿共104张，创作于星期二3.可变区（可变区（V区）和恒定区（区）和恒定区（C区）区）nV区
18、区：近：近N-端轻链的端轻链的1/2区段、重链的区段、重链的1/4或或1/5区段的氨基区段的氨基酸组成及排列顺序多变，分为酸组成及排列顺序多变，分为VL和和VH。lC区区：近：近C-端轻链的端轻链的1/2区段、重链的区段、重链的3/4或或4/5区段的氨基酸组成区段的氨基酸组成较恒定较恒定,分为分为CH1、CH2、CH3。第33页，讲稿共104张，创作于星期二n可变区可变区是指此区域内的氨基酸序列在不同的抗是指此区域内的氨基酸序列在不同的抗体中不同。体中不同。n恒定区恒定区是指此区域内的氨基酸序列在不同的抗是指此区域内的氨基酸序列在不同的抗体中相同。体中相同。第34页，讲稿共104张，创作于星期
19、二4.超变区（超变区（HVR区）和骨架区（区）和骨架区（FR）nHVR：可变区中，某些特定位置的氨基酸残基显示更大的变异性：可变区中，某些特定位置的氨基酸残基显示更大的变异性。n它们共同组成抗原结合部位，该部位在空间结构上可与抗原决定簇形成精密它们共同组成抗原结合部位，该部位在空间结构上可与抗原决定簇形成精密的互补。的互补。n也称为也称为互补决定区互补决定区（complementary-determining region，CDR），分别），分别称为称为CDR1，CDR2，CDR3。nFR：可变区中氨基酸残基变化小的部分，维持空间结构：可变区中氨基酸残基变化小的部分，维持空间结构。第35页，讲
20、稿共104张，创作于星期二5.铰链区（铰链区（hinge region）nCH1和和CH2之间的区域。之间的区域。n含大量脯氨酸，具有弹性，易发生伸展及一定程度扭曲，有利含大量脯氨酸，具有弹性，易发生伸展及一定程度扭曲，有利于与抗原表位间的互补性结合。于与抗原表位间的互补性结合。第36页，讲稿共104张，创作于星期二（二）功能区（二）功能区 1.抗体的功能区抗体的功能区n由一条多肽链折叠而成的球形结构域称为功能区。由一条多肽链折叠而成的球形结构域称为功能区。n每个功能区约由每个功能区约由110 个氨基酸组成，具有不同生物学功能。个氨基酸组成，具有不同生物学功能。第37页，讲稿共104张，创作于
21、星期二 2.各功能区的功能各功能区的功能nVH和和VL共同构成抗原特异性结合部位。共同构成抗原特异性结合部位。补体结合位点补体结合位点借助借助CH2通过胎盘屏障通过胎盘屏障第38页，讲稿共104张，创作于星期二（三）水解片段（三）水解片段lIg分子中有些部位在一定条件下，容易被蛋白酶水解为各分子中有些部位在一定条件下，容易被蛋白酶水解为各种片段。常用的蛋白酶有种片段。常用的蛋白酶有木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶和和胃蛋白酶胃蛋白酶。lIg酶解的片段获得，大大促进了酶解的片段获得，大大促进了Ig分子结构和功能的研究，分子结构和功能的研究，同时也为各种同时也为各种基因工程抗体基因工程抗体的构建打下了基础。如
22、的构建打下了基础。如DNA操作操作和抗体改型技术的发展，使得人们可根据抗体水解片段的和抗体改型技术的发展，使得人们可根据抗体水解片段的结构和功能关系，产生更多有功能的结构和功能关系，产生更多有功能的Ig改型分子片段改型分子片段 第39页，讲稿共104张，创作于星期二 1.木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶n木瓜蛋白酶水解木瓜蛋白酶水解Ig分子可产生分子可产生2个个抗原结合片段（抗原结合片段（fragment of antigen-binding，Fab）、）、一个一个可结晶片段（可结晶片段（fragment crystalizable，Fc）。lFc片段相当于两条重链的片段相当于两条重链的CH2和和CH3功
23、功能区，由二硫键连接，可能区，由二硫键连接，可形成结晶形成结晶，其其无抗原结合活性无抗原结合活性，但具有固定补体、，但具有固定补体、结合结合Fc受体等功能受体等功能。nFab片段包括完整的轻链和部分重链（片段包括完整的轻链和部分重链（VH和和CH1），能与一），能与一个抗原特异性结合，具有个抗原特异性结合，具有单价单价抗体活性。抗体活性。可通过基因工程获得可通过基因工程获得Fab片段。片段。第40页，讲稿共104张，创作于星期二 2.胃蛋白酶胃蛋白酶n水解水解Ig分子可产生分子可产生1个个F（ab）2、若干个若干个裂解的小分子片裂解的小分子片段（段（pFc）。n F（ab）2含有两条含有两条L
24、链和略大于链和略大于Fab段的段的H链，由二硫键链，由二硫键连接，具有连接，具有双价双价抗体活性。抗体活性。第41页，讲稿共104张，创作于星期二四、抗体的功能四、抗体的功能（一）（一）V区的功能区的功能n识别并结合抗原识别并结合抗原（二）（二）C区的功能区的功能n激活补体系统激活补体系统n介导免疫细胞活性介导免疫细胞活性n穿过胎盘和粘膜穿过胎盘和粘膜第42页，讲稿共104张，创作于星期二第三节第三节 单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备第43页，讲稿共104张，创作于星期二主要分为以下几个步骤：主要分为以下几个步骤：l抗原的制备抗原的制备l动物的免疫动物的免疫l抗体产生细胞与骨髓瘤细胞融合，形成
25、杂交瘤抗体产生细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞细胞l杂交瘤细胞的选择性培养与筛选杂交瘤细胞的选择性培养与筛选l大量制备单克隆抗体大量制备单克隆抗体第44页，讲稿共104张，创作于星期二一、单克隆抗体技术的基本原理一、单克隆抗体技术的基本原理lB淋巴细胞淋巴细胞能够产生抗体，能够产生抗体，但在体外不能进行无限分裂但在体外不能进行无限分裂;l而瘤细胞虽然可以在体外进行无限传代，而瘤细胞虽然可以在体外进行无限传代，但不能产生抗体。但不能产生抗体。l将这两种细胞融合后得到的杂交瘤细胞具有两种亲本细将这两种细胞融合后得到的杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性。胞的特性。第45页，讲稿共104张，创作于星
26、期二两类细胞融合物中存在以下细胞：两类细胞融合物中存在以下细胞：l未融合的单核亲本细胞（脾、瘤细胞）未融合的单核亲本细胞（脾、瘤细胞）n同型融合多核细胞（脾同型融合多核细胞（脾-脾、瘤脾、瘤-瘤融合细胞）瘤融合细胞）n异型融合双核细胞（脾异型融合双核细胞（脾-瘤融合细胞）瘤融合细胞）第46页，讲稿共104张，创作于星期二杂交瘤细胞的筛选杂交瘤细胞的筛选l使用使用HAT（H为次黄嘌呤、为次黄嘌呤、A为氨基蝶呤、为氨基蝶呤、T为为胸腺嘧啶核苷）培养基胸腺嘧啶核苷）培养基。第47页，讲稿共104张，创作于星期二HAT筛选杂交瘤细胞的原理筛选杂交瘤细胞的原理l哺乳动物细胞中，哺乳动物细胞中，DNA前体
27、物的合成有两种不同的途径：前体物的合成有两种不同的途径：从头合成途径从头合成途径：可被氨基蝶呤阻断：可被氨基蝶呤阻断 补救合成途径补救合成途径：需要次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（：需要次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT)或胸腺嘧啶或胸腺嘧啶核苷激酶（核苷激酶（TK)存在。存在。n骨髓瘤细胞株：从头合成途径被骨髓瘤细胞株：从头合成途径被A阻断；是阻断；是HGPRT缺陷（缺陷（HGPRT-)和和TK缺陷（缺陷（TK-),不能利用培养基中的不能利用培养基中的H和和T完成完成DNA的合成而死亡。的合成而死亡。第48页，讲稿共104张，创作于星期二二、抗原和免疫二、抗原和免疫（一）抗原的制备（一）
28、抗原的制备1.提取纯化天然抗原提取纯化天然抗原n运用蛋白质等分离纯化技术分离蛋白质分子运用蛋白质等分离纯化技术分离蛋白质分子作为抗原。作为抗原。n对于含量低的蛋白分离纯化成本高，目前已少用。对于含量低的蛋白分离纯化成本高，目前已少用。第49页，讲稿共104张，创作于星期二2.用基因工程技术制备重组蛋白抗原用基因工程技术制备重组蛋白抗原n可获得足够数量蛋白抗原。可获得足够数量蛋白抗原。n原核原核系统只能提供连续氨基酸表位的抗原。系统只能提供连续氨基酸表位的抗原。n真核真核及哺乳动物细胞系统及哺乳动物细胞系统可解决抗原构象表位可解决抗原构象表位，但产量低，成本过高。但产量低，成本过高。第50页，讲
29、稿共104张，创作于星期二3.合成多肽半抗原合成多肽半抗原n根据抗原蛋白的氨基酸序列，经人工根据抗原蛋白的氨基酸序列，经人工合成抗原表合成抗原表位的多肽片段位的多肽片段，即多肽半抗原。，即多肽半抗原。n该方法效率高、成本低，已成为抗原制备的主该方法效率高、成本低，已成为抗原制备的主要来源。要来源。半抗原半抗原：只有反应原性而无免疫原性的物质。其可与抗体或致敏淋巴细胞特异性：只有反应原性而无免疫原性的物质。其可与抗体或致敏淋巴细胞特异性结合，但不能单独诱发免疫应答。结合，但不能单独诱发免疫应答。第51页，讲稿共104张，创作于星期二n小分子半抗原小分子半抗原 抗生素（青霉素等）、农药、重金属等属
30、于小抗生素（青霉素等）、农药、重金属等属于小分子半抗原。分子半抗原。n多肽半抗原及小分子半抗原与载体偶联多肽半抗原及小分子半抗原与载体偶联 载体如牛血清清蛋白（载体如牛血清清蛋白（BSA)等。等。第52页，讲稿共104张，创作于星期二（二）动物及免疫（二）动物及免疫n免疫接种的目的是使免疫接种的目的是使B细胞在特异性抗原刺激下细胞在特异性抗原刺激下分化、增殖、分泌特异性抗体。分化、增殖、分泌特异性抗体。1.动物的选择动物的选择n一般采用与骨髓瘤供体同一品系的动物进行免疫。一般采用与骨髓瘤供体同一品系的动物进行免疫。n常用的骨髓瘤品系来自常用的骨髓瘤品系来自Balb/c小鼠和小鼠和Lou大鼠，免
31、疫大鼠，免疫动物也采用相应品系。动物也采用相应品系。Balb/c小鼠小鼠第53页，讲稿共104张，创作于星期二2.免疫免疫方法方法n有有体内、体外体内、体外和和脾内免疫脾内免疫法。法。n体内体内免疫法适用于免疫原性强、抗原量较多。免疫法适用于免疫原性强、抗原量较多。第54页，讲稿共104张，创作于星期二n体外体外免疫免疫 体外免疫是指在一定条件下，在体外将正常脾细胞与抗体外免疫是指在一定条件下，在体外将正常脾细胞与抗原共同培养，然后再与骨髓瘤细胞进行融合。原共同培养，然后再与骨髓瘤细胞进行融合。第55页，讲稿共104张，创作于星期二体外免疫方法体外免疫方法n分离小鼠脾细胞或淋巴细胞，分离小鼠脾
32、细胞或淋巴细胞，RPMI1640培养液中，加适量滋培养液中，加适量滋养细胞与抗原，养细胞与抗原，37度度 5CO2培养培养3天。天。n体外免疫方案免疫效果不如其它方案，仅用于抗原量极少，抗体外免疫方案免疫效果不如其它方案，仅用于抗原量极少，抗原免疫原性弱的抗原。原免疫原性弱的抗原。用于不能采用体内免疫法的情况。用于不能采用体内免疫法的情况。第56页，讲稿共104张，创作于星期二n脾内脾内免疫免疫 小鼠麻醉后，打开腹腔，沿脾脏长轴方向缓慢小鼠麻醉后，打开腹腔，沿脾脏长轴方向缓慢注入注入0.1-0.2ml可溶性抗原，免疫后可溶性抗原，免疫后34d即可取脾细即可取脾细胞进行融合。胞进行融合。目前最常
33、用的是体内免疫法。目前最常用的是体内免疫法。第57页，讲稿共104张，创作于星期二3.乳化乳化n为增强免疫原性，常加入佐剂（弗氏佐剂）。为增强免疫原性，常加入佐剂（弗氏佐剂）。n初次免疫时，抗原需要与一定量弗氏完全佐剂混合，经初次免疫时，抗原需要与一定量弗氏完全佐剂混合，经乳化后应用。乳化后应用。n加强免疫时，可以用不完全佐剂，或不用佐剂。加强免疫时，可以用不完全佐剂，或不用佐剂。第58页，讲稿共104张，创作于星期二弗氏完全佐剂弗氏完全佐剂 n由油剂（石蜡油或植物油）由油剂（石蜡油或植物油）、n乳化剂（羊毛脂或吐温（乳化剂（羊毛脂或吐温（Tween）80）n灭活的分枝杆菌（卡介苗）组成。灭活
34、的分枝杆菌（卡介苗）组成。有比较强烈的刺激免疫系统，被免疫系统认为有比较强烈的刺激免疫系统，被免疫系统认为是外界物质的作用。能刺激免疫系统产生应答。是外界物质的作用。能刺激免疫系统产生应答。第59页，讲稿共104张，创作于星期二弗氏不完全佐剂弗氏不完全佐剂 n只有石蜡油和羊毛脂，缺少灭活的结核菌的弗只有石蜡油和羊毛脂，缺少灭活的结核菌的弗氏佐剂。氏佐剂。弗氏完全佐剂用于初次免疫刺激。弗氏不完全弗氏完全佐剂用于初次免疫刺激。弗氏不完全佐剂用于加强免疫。佐剂用于加强免疫。第60页，讲稿共104张，创作于星期二乳化乳化n用佐剂将抗原包裹使之形成油包水乳剂。用佐剂将抗原包裹使之形成油包水乳剂。n乳化方
35、法有：乳钵研磨、机械搅拌等。乳化方法有：乳钵研磨、机械搅拌等。第61页，讲稿共104张，创作于星期二4.体内免疫途径体内免疫途径n皮下、腹腔和静脉注射等（抗原量多）。皮下、腹腔和静脉注射等（抗原量多）。n皮下、皮内和足掌等多点注射（抗原量少）。皮下、皮内和足掌等多点注射（抗原量少）。体内免疫后药物吸收进入血液。体内免疫后药物吸收进入血液。第62页，讲稿共104张，创作于星期二5.免疫程序免疫程序初次免疫初次免疫（Ag100-500ug加弗氏完全佐剂注射）加弗氏完全佐剂注射）第二次免疫第二次免疫（剂量同上，加弗氏不完全佐剂注射）（剂量同上，加弗氏不完全佐剂注射）加强免疫（融合前免疫）加强免疫（融
36、合前免疫）无菌取脾，制备脾细胞无菌取脾，制备脾细胞第三次免疫第三次免疫（剂量同上，加弗氏不完全佐剂注射）（剂量同上，加弗氏不完全佐剂注射）4周后周后4周后周后5-7天采血，检测抗体效价，天采血，检测抗体效价，2周后周后3天后天后第63页，讲稿共104张，创作于星期二三、细胞融合和杂交瘤细胞的选择三、细胞融合和杂交瘤细胞的选择l细胞融合细胞融合（cell fusion）是）是2个或个或2个以上个以上的细的细胞合并成一个细胞的过程。胞合并成一个细胞的过程。n免疫动物的脾细胞免疫动物的脾细胞+骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞=杂交瘤细胞。杂交瘤细胞。n所需要的细胞：免疫动物的脾细胞、骨髓瘤细胞、所需要的细胞：免
37、疫动物的脾细胞、骨髓瘤细胞、饲养细胞。饲养细胞。第64页，讲稿共104张，创作于星期二（一）细胞的准备（一）细胞的准备1.免疫脾细胞免疫脾细胞n指处于免疫状态脾脏中的指处于免疫状态脾脏中的B淋巴母细胞。淋巴母细胞。n取取加强免疫以后加强免疫以后3天天的脾脏制备的脾脏制备B淋巴母细胞。此淋巴母细胞。此时，脾脏体积是正常鼠脾脏体积的时，脾脏体积是正常鼠脾脏体积的2倍，倍，B淋巴母淋巴母细胞比例较大，融合成功率较高细胞比例较大，融合成功率较高。第65页，讲稿共104张，创作于星期二免疫脾细胞制备操作步骤免疫脾细胞制备操作步骤小鼠最后一次加强免疫小鼠最后一次加强免疫3天后，摘除眼球取血天后，摘除眼球取
38、血断颈处死，浸泡于断颈处死，浸泡于75%酒精消毒酒精消毒无菌剪刀分离脾脏无菌剪刀分离脾脏脾脏用脾脏用RPMI培养液洗涤一次，制成细胞悬液培养液洗涤一次，制成细胞悬液晒网过滤，细胞计数晒网过滤，细胞计数离心，弃上清离心，弃上清培养液重悬，冰水浴中备用培养液重悬，冰水浴中备用第66页，讲稿共104张，创作于星期二2.骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞n融合前两周开始复苏。融合前两周开始复苏。n培养基培养基RPMI1640、DMEM均可作为其培养基，均可作为其培养基，小牛血清的浓度一般在小牛血清的浓度一般在1020%,1:10传代稀释。传代稀释。n活细胞计数高于活细胞计数高于95%，以保证骨髓瘤细胞处于对数生，以
39、保证骨髓瘤细胞处于对数生长期。长期。第67页，讲稿共104张，创作于星期二3.饲养细胞（饲养细胞（feeder cell）n加入的目的在于促进细胞生长繁殖。加入的目的在于促进细胞生长繁殖。n能满足杂交瘤细胞对细胞能满足杂交瘤细胞对细胞密度的依赖性密度的依赖性，能释放某，能释放某些生长刺激因子。些生长刺激因子。n常用的饲养细胞有小鼠腹腔巨噬细胞、脾细胞和胸腺常用的饲养细胞有小鼠腹腔巨噬细胞、脾细胞和胸腺细胞等。细胞等。第68页，讲稿共104张，创作于星期二小鼠腹腔巨噬细胞制备操作步骤（融合前小鼠腹腔巨噬细胞制备操作步骤（融合前2-3天制备）天制备）Balb/c小鼠小鼠断颈处死，浸泡于断颈处死，浸
40、泡于75%酒精消毒酒精消毒无菌剪刀剪开腹腔，暴露腹膜无菌剪刀剪开腹腔，暴露腹膜无菌注射器注入腹腔培养液无菌注射器注入腹腔培养液8-12ml反复冲洗，吸出冲洗液反复冲洗，吸出冲洗液离心，弃上清离心，弃上清培养液重悬，加入培养液重悬，加入96孔板，孔板，37度，度，CO2孵箱培养备用孵箱培养备用第69页，讲稿共104张，创作于星期二（二）脾细胞和骨髓瘤细胞的融合（二）脾细胞和骨髓瘤细胞的融合n取适量取适量脾细胞和骨髓瘤细胞（脾细胞和骨髓瘤细胞（3:15:1）进行混合，）进行混合，在聚乙二醇作用下诱导融合，在聚乙二醇作用下诱导融合，2min左右左右。nPEG浓度越高，促融率越大，但毒性也越大。常浓度
41、越高，促融率越大，但毒性也越大。常用浓度用浓度4050%，分子量，分子量4kD。n常用方法有转动法和离心法。常用方法有转动法和离心法。第70页，讲稿共104张，创作于星期二l细胞融合流程图细胞融合流程图将脾细胞和骨髓瘤细胞在离心管中混合将脾细胞和骨髓瘤细胞在离心管中混合培养液洗培养液洗1次，离心，弃上清次，离心，弃上清吸尽残留液体，吸尽残留液体，37水浴，水浴，加入细胞融合剂加入细胞融合剂加入不完全培养液，终止融合剂的作用加入不完全培养液，终止融合剂的作用离心，弃上清离心，弃上清用含用含20小牛血清小牛血清RPMI1640（含（含HAT）融合后细胞悬液加入融合后细胞悬液加入96孔板，孵箱培养孔
42、板，孵箱培养第71页，讲稿共104张，创作于星期二（三）（三）HAT选择杂交瘤细胞选择杂交瘤细胞n在在HAT培养基中，次日即可观察到骨髓瘤细胞相继培养基中，次日即可观察到骨髓瘤细胞相继死亡。死亡。n融合后融合后3-4天可在镜下观察到细胞克隆的形成。天可在镜下观察到细胞克隆的形成。第72页，讲稿共104张，创作于星期二四、筛选阳性克隆及克隆化四、筛选阳性克隆及克隆化n筛选阳性克隆筛选阳性克隆（screening）：即筛选能分泌特异性：即筛选能分泌特异性单抗的杂交瘤细胞。单抗的杂交瘤细胞。n方法：是用抗原分别检测杂交瘤细胞中分泌的方法：是用抗原分别检测杂交瘤细胞中分泌的抗体，常用的方法有酶联免疫吸
43、附试验抗体，常用的方法有酶联免疫吸附试验（ELISA)、放射免疫测定（、放射免疫测定（radioimmunoassay，RIA）等）等。第73页，讲稿共104张，创作于星期二ELISA法的原理法的原理n其基本方法是将已知的抗体或抗原吸附在固相载体表面。其基本方法是将已知的抗体或抗原吸附在固相载体表面。n加入酶标记的抗原或抗体，通过反应也结合在固相载体上。加加入酶标记的抗原或抗体，通过反应也结合在固相载体上。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，根据呈色的深浅进行定性或定标本中受检物质的量直接相关
44、，根据呈色的深浅进行定性或定量分析。量分析。第74页，讲稿共104张，创作于星期二ELISA 实验流程示图实验流程示图 第75页，讲稿共104张，创作于星期二l酶的催化效率很高，间接地酶的催化效率很高，间接地放大放大了免疫反应的了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的结果，使测定方法达到很高的敏感度敏感度。n免疫敏感度可提高数千倍，达免疫敏感度可提高数千倍，达ng/ml水平。水平。例如：例如：用酶免疫测定法测定口蹄疫抗体，其敏感度可用酶免疫测定法测定口蹄疫抗体，其敏感度可达达0.1ng/ml。第76页，讲稿共104张，创作于星期二操作程序 加抗体包被加抗体包被 4过夜，洗涤三次、抛干过夜，洗涤三
45、次、抛干 加待检抗原加待检抗原 37 30分钟，洗涤三次、抛干分钟，洗涤三次、抛干 加酶标抗体加酶标抗体 37 30分钟，洗涤三次、抛干分钟，洗涤三次、抛干 加底物液加底物液 37 15分钟，加终止液分钟，加终止液 用用ELISA检测仪测定检测仪测定OD值。值。第77页，讲稿共104张，创作于星期二酶标板酶标板 n酶标板酶标板(ELISA PLATE):在酶联免疫吸附试验在酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)中中,作为载体的作为载体的固相聚苯乙烯固相聚苯乙烯(Polystyrene)表面对抗原、抗体或抗原抗体复合物的吸附也起着表面对
46、抗原、抗体或抗原抗体复合物的吸附也起着重要作用。重要作用。n酶标板根据其孔数可以分为酶标板根据其孔数可以分为48孔，孔，96孔。一般常用的为孔。一般常用的为96孔。孔。酶标仪酶标仪n即酶联免疫检测仪即酶联免疫检测仪,是酶联免疫吸附试验的专用仪器是酶联免疫吸附试验的专用仪器.其工作原理其工作原理基本上都是一致的基本上都是一致的,其核心都是一个比色计其核心都是一个比色计,即用比色法来分析抗即用比色法来分析抗原或抗体的含量原或抗体的含量.酶标仪酶标仪第78页，讲稿共104张，创作于星期二（二）杂交瘤细胞的克隆（二）杂交瘤细胞的克隆（cloning）n是指将阳性孔中分泌抗体的单个细胞分离出来。是指将阳
47、性孔中分泌抗体的单个细胞分离出来。n方法：方法：n克隆化的原则：对于检测阳性的杂交瘤细胞应克隆化的原则：对于检测阳性的杂交瘤细胞应尽早克隆化。尽早克隆化。有限稀释法：把杂交瘤细胞悬液稀释后，加入有限稀释法：把杂交瘤细胞悬液稀释后，加入到到96孔板，每孔一个细胞。孔板，每孔一个细胞。第79页，讲稿共104张，创作于星期二（三）杂交瘤细胞的冻存（三）杂交瘤细胞的冻存n及时冻存原始孔的杂交瘤细胞是很有必要的。及时冻存原始孔的杂交瘤细胞是很有必要的。n细胞冻存液：细胞冻存液：50%小牛血清，小牛血清，40%不完全培养液不完全培养液和和10%DMSO。n方法：室温降到方法：室温降到0，再降到，再降到-7
48、0，转入液氮中。，转入液氮中。第80页，讲稿共104张，创作于星期二六、单克隆抗体的大量制备六、单克隆抗体的大量制备l体内培养法体内培养法 利用活体动物作为生物反应器，将杂交瘤细利用活体动物作为生物反应器，将杂交瘤细胞注射到小鼠或大鼠的腹腔内生长并分泌单抗。胞注射到小鼠或大鼠的腹腔内生长并分泌单抗。方法是：腹腔注射杂交瘤细胞，方法是：腹腔注射杂交瘤细胞，710天后抽取天后抽取腹水，离心，得上清液。腹水，离心，得上清液。第81页，讲稿共104张，创作于星期二降植烷降植烷 n降植烷是一种降植烷是一种免疫抑制剂免疫抑制剂。n所以，提前一周注射降植烷、液体石蜡等免疫所以，提前一周注射降植烷、液体石蜡等
49、免疫抑制剂，总的来说是为了提高单克隆抗体产生抑制剂，总的来说是为了提高单克隆抗体产生的效率。的效率。第82页，讲稿共104张，创作于星期二l体外培养法体外培养法 体外使用旋转培养容器培养杂交瘤细胞，从细胞培养上体外使用旋转培养容器培养杂交瘤细胞，从细胞培养上清液中获得抗体。清液中获得抗体。该方法获得的抗体产量较体内培养法低。该方法获得的抗体产量较体内培养法低。第83页，讲稿共104张，创作于星期二七、单克隆抗体的纯化七、单克隆抗体的纯化n澄清和沉淀处理：离心沉淀，过滤，蛋白沉淀。澄清和沉淀处理：离心沉淀，过滤，蛋白沉淀。n分离纯化：层析技术。分离纯化：层析技术。第84页，讲稿共104张，创作于
50、星期二第四节第四节 基因工程抗体基因工程抗体第85页，讲稿共104张，创作于星期二单克隆抗体的缺点单克隆抗体的缺点n绝大多数来源于小鼠或大鼠。绝大多数来源于小鼠或大鼠。n人体使用鼠抗体会产生人抗鼠抗体，产生超敏反应。人体使用鼠抗体会产生人抗鼠抗体，产生超敏反应。解决办法解决办法n制备人源性抗体，但人制备人源性抗体，但人-人杂交瘤技术未实现突破。人杂交瘤技术未实现突破。第86页，讲稿共104张，创作于星期二基因工程抗体基因工程抗体n制备抗体基因，与载体连接后导入受体细胞，表达抗体。制备抗体基因，与载体连接后导入受体细胞，表达抗体。第87页，讲稿共104张，创作于星期二基因工程抗体包括基因工程抗体