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1、19.1 概述概述19.2 鼠源单克隆抗体的制备鼠源单克隆抗体的制备19.3 基因工程抗体基因工程抗体第十九章抗体药物制备工艺第十九章抗体药物制备工艺19.1 概概 述述19.1.1 抗体与抗原抗体与抗原抗体（抗体（antibody，Ab）：）：指能与相应抗原特指能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。异性结合的具有免疫功能的球蛋白。免疫球蛋白（免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）:具有抗具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白IgAb化学结构上的概念化学结构上的概念生物学功能上的概念生物学功能上的概念抗体的发现抗体的发现v德国学者德国学者B
2、ehringBehring和日本学者北里于和日本学者北里于18901890年在年在KochKoch研研究所应用白喉外毒素给动物免疫，发现在其血清中究所应用白喉外毒素给动物免疫，发现在其血清中有一种能中和外毒素的物质，称为抗毒素。有一种能中和外毒素的物质，称为抗毒素。v将这种免疫血清转移给正常动物也有中和外毒素的将这种免疫血清转移给正常动物也有中和外毒素的作用。这种被动免疫法很快应用于临床治疗。作用。这种被动免疫法很快应用于临床治疗。vBehringBehring于于18911891年应用来自动物的免疫血清成功地治年应用来自动物的免疫血清成功地治疗了一个白喉患者，这是第一个被动免疫治疗的病疗了一
3、个白喉患者，这是第一个被动免疫治疗的病例。例。诺贝尔奖得主：德国科学家贝林诺贝尔奖得主：德国科学家贝林 v德国的细菌学家埃米尔德国的细菌学家埃米尔冯冯贝林贝林(Emil von(Emil von Behring 1854-1917)Behring 1854-1917)。19011901年因其研究抗毒年因其研究抗毒素血清，尤其在运用血素血清，尤其在运用血清治疗防治白喉和破伤清治疗防治白喉和破伤风等病症方面的贡献被风等病症方面的贡献被授予诺贝尔医学奖。授予诺贝尔医学奖。抗原決定基 一个抗原分子上可能一个抗原分子上可能有数个抗原決定基有数个抗原決定基 每個每個 抗原決定基抗原決定基 至少誘生一種至少
4、誘生一種專一性抗体專一性抗体 蛋白质性蛋白质性 抗原決定基抗原決定基 含有含有六个以上氨基酸六个以上氨基酸19.1.2 抗体分子的结构与功能抗体分子的结构与功能v免疫球蛋白的基本结构免疫球蛋白的基本结构重链（重链（heavy chain，H）v由由450550个氨基酸残基组成，个氨基酸残基组成，分子量分子量5075 kDa根据其重链根据其重链稳定区的分子结构和抗原特异稳定区的分子结构和抗原特异性的不同，分为五类：性的不同，分为五类：IgG、IgA、IgM、IgD、IgE，其重，其重链分别为：链分别为：、v免疫球蛋白的基本结构免疫球蛋白的基本结构轻链（轻链（light chain，L）v由由21
5、4个氨基酸残基构成，分个氨基酸残基构成，分子量约子量约25 kDav轻链有轻链有 链和链和 链两种，一个链两种，一个天然天然Ig分子上两条轻链的型别分子上两条轻链的型别总是相同的，但同一个体内可总是相同的，但同一个体内可存在分别带有存在分别带有 链和链和 链的抗链的抗体分子，其比例具有种属特异体分子，其比例具有种属特异性性可变区（可变区（variable region，V区）区）v轻链和重链中靠近轻链和重链中靠近N-端氨基酸序列端氨基酸序列变化较大的区域变化较大的区域v重链和轻链的重链和轻链的V区分别称为区分别称为VH和和VLv分别占重链和轻链的分别占重链和轻链的1/4和和1/2vVH和和VL
6、各有各有3个区域的氨基酸组成个区域的氨基酸组成和排列顺序高度可变，称为高变区和排列顺序高度可变，称为高变区（HVR）或互补决定区（）或互补决定区（CDR），），共同组成共同组成Ig的抗原结合部位的抗原结合部位v在在V区中区中CDR之外的区域氨基酸组之外的区域氨基酸组成和序列相对不变，称为骨架区成和序列相对不变，称为骨架区（FR）恒定区（恒定区（constant regionconstant region，C C区）区）v靠近靠近C C-端氨基酸序列相对稳定的区端氨基酸序列相对稳定的区域域v重链和轻链的重链和轻链的C C区分别称为区分别称为C CH H和和C CL Lv分别占重链和轻链的分别占重
7、链和轻链的3/43/4和和1/21/2v不同型不同型IgIg的的C CL L长度基本一致，但不长度基本一致，但不同类同类Ig CIg CH H的长度不一的长度不一Ig的结构域的结构域v两条重链和轻链均可折叠成两条重链和轻链均可折叠成数个球形结构域，每个结构数个球形结构域，每个结构域约由域约由110个氨基酸残基构个氨基酸残基构成成v二级结构由反向平行的两个二级结构由反向平行的两个-片层（片层（-sheet）组成，）组成，两个两个-片中心的两个片中心的两个Cys由由一个链内二硫键垂直连接，一个链内二硫键垂直连接，形成形成“-桶状（桶状（-barrel）”结构，这种折叠结构，这种折叠方式称为方式称为
8、“免疫球蛋白折叠免疫球蛋白折叠（immuno-globulin folding）”铰链区（铰链区（hinge region）v位于位于CH1与与CH2之间之间v含有丰富的含有丰富的Prov易伸展、弯曲，能改变两个易伸展、弯曲，能改变两个结合抗原的结合抗原的Y形臂之间的距形臂之间的距离，有利于两臂同时结合两离，有利于两臂同时结合两个不同的抗原表位个不同的抗原表位v易被木瓜蛋白酶、胃蛋白酶易被木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等水解，产生不同的水解片等水解，产生不同的水解片段段抗体制备发展历程抗体制备发展历程（1 1）多克隆抗体）多克隆抗体1890年，年，Behring和北里柴三郎发现白喉抗毒素和北里柴三郎发现
9、白喉抗毒素1937年，年，Tiselius等人用电泳法将血清蛋白分为白蛋白、甲等人用电泳法将血清蛋白分为白蛋白、甲种（种（）球蛋白、乙种（）球蛋白、乙种（）球蛋白、丙种（）球蛋白、丙种（）球蛋白，并）球蛋白，并证明抗体活性主要存在于丙种球蛋白组分。证明抗体活性主要存在于丙种球蛋白组分。获取多抗的主要途径是动物免疫血清、恢复期病人血清获取多抗的主要途径是动物免疫血清、恢复期病人血清或免疫接种人群或免疫接种人群优点：作用全面，具有抗体的各种功能；来源广泛，制优点：作用全面，具有抗体的各种功能；来源广泛，制备容易备容易缺点：特异性不高，易发生交叉反应，从而限制了其应缺点：特异性不高，易发生交叉反应，
10、从而限制了其应用用（2）单克隆抗体）单克隆抗体v McAb是将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨是将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤髓瘤细胞融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而产生的。由于这种细胞成为纯一的单克隆细胞系而产生的。由于这种抗体是针对一个抗原决定族的抗体，又是单一的抗体是针对一个抗原决定族的抗体，又是单一的B淋巴细胞克隆产生的，故称为单克隆抗体。淋巴细胞克隆产生的，故称为单克隆抗体。1975年，年，Khler and Milstein等首次利用等首次利用B淋巴细胞淋巴细胞杂交瘤技术制备出杂交瘤技术制备出 Mc
11、Ab.在临床上主要用于诊断和在临床上主要用于诊断和治疗。治疗。v木瓜蛋白酶水解片段木瓜蛋白酶水解片段水解部位是水解部位是IgIg铰链区二硫键连接的两铰链区二硫键连接的两条重链在近条重链在近N N-端，可将端，可将IgIg裂解为两个裂解为两个完全相同的完全相同的FabFab片段和一个片段和一个FcFc片段片段FabFab片段即抗原结合片段（片段即抗原结合片段（fragment fragment antigen bindingantigen binding），由一条完整的），由一条完整的轻链和重链的轻链和重链的V VH H和和C CH H1 1结构域组成，为结构域组成，为单价抗体片段，可与抗体结合
12、，但不单价抗体片段，可与抗体结合，但不凝集凝集FcFc片段即可结晶片段（片段即可结晶片段（fragment fragment cry-stallizablecry-stallizable），相当于），相当于IgGIgG的的C CH H2 2和和C CH H3 3结构域，无抗原结合活性，结构域，无抗原结合活性，是是IgIg与效应分子或细胞相互作用的部与效应分子或细胞相互作用的部位位v胃蛋白酶水解片段胃蛋白酶水解片段作用于铰链区二硫键所连接的作用于铰链区二硫键所连接的两条重链的近两条重链的近C-端，水解后可端，水解后可获得一个获得一个F(ab)2片段和一些小片片段和一些小片段段pFcF(ab)2片
13、段由两个片段由两个Fab及铰链区及铰链区组成，是双价抗体片段，可同时组成，是双价抗体片段，可同时结合两个抗原表位，可发生凝集结合两个抗原表位，可发生凝集反应和沉淀反应反应和沉淀反应F(ab)2片段保留了结合相应抗片段保留了结合相应抗原的生物学活性，又避免了原的生物学活性，又避免了Fc片片段免疫原性可能引起的副作用，段免疫原性可能引起的副作用，广泛用作生物制品广泛用作生物制品（3 3）基因工程抗体）基因工程抗体v利用基因工程方法对鼠源全抗体的基因进行重组缺失利用基因工程方法对鼠源全抗体的基因进行重组缺失修饰改型等，在原核微生物昆虫细胞和哺乳动物细胞修饰改型等，在原核微生物昆虫细胞和哺乳动物细胞中
14、表达，获得抗体。中表达，获得抗体。v包括鼠源抗体的人源化，人鼠嵌合抗体，改型抗体，包括鼠源抗体的人源化，人鼠嵌合抗体，改型抗体，小分子抗体和完全人源抗体。小分子抗体和完全人源抗体。19.2 单克隆抗体制备过程单克隆抗体制备过程杂交瘤细胞的制备杂交瘤细胞的制备 骨髓瘤细胞的选择骨髓瘤细胞的选择v在杂交瘤细胞技术中，主要使用在杂交瘤细胞技术中，主要使用多发性骨髓瘤细胞作为亲本细胞，多发性骨髓瘤细胞作为亲本细胞，这种细胞是由抗体合成细胞克隆这种细胞是由抗体合成细胞克隆衰变而成的肿瘤细胞衰变而成的肿瘤细胞v尽可能选择自身不合成或至少不尽可能选择自身不合成或至少不分泌任何免疫球蛋白分子或片段分泌任何免疫
15、球蛋白分子或片段的骨髓瘤细胞作为亲本细胞的骨髓瘤细胞作为亲本细胞v细胞必须处于良好的生长状态，细胞必须处于良好的生长状态，对数生长期最好对数生长期最好v融合时，活细胞数应至少大于融合时，活细胞数应至少大于90%90%常用骨髓瘤细胞系全名 简称 来源 耐受 表达自身 Ig 分子 P3-X63-Ag8 X63 BALB/c 小鼠 8-Ag Ig-1 MOPC11-X45-6TG X45 BALB/c 小鼠6-TG Ig-2 b P3-NS1-Ag4.1 NS-1 BALB/c 小鼠8-Ag (非分泌型)P3-X63-Ag8.653 P3.653 BALB/c 小鼠8-Ag SP2/0-Ag14 S
16、P2/0 BALB/c 小鼠8-Ag Fast-Zero FO BALB/c 小鼠8-Ag Y3-Ag1,2,3 Y3 Lou 大鼠 8-Ag 链 YB2-3.0-Ag20 YB2(LouAO)F1 8-Ag 8-Ag：8-氮杂鸟嘌呤；6-TG：6-巯基嘌呤杂交瘤细胞的制备杂交瘤细胞的制备 免疫脾细胞悬液的制备免疫脾细胞悬液的制备v取经免疫的小鼠，摘除眼球放血，将小鼠处死，无菌取经免疫的小鼠，摘除眼球放血，将小鼠处死，无菌摘取脾脏，研磨制取脾淋巴细胞悬液，用摘取脾脏，研磨制取脾淋巴细胞悬液，用NHNH4 4ClCl破碎红破碎红细胞，洗涤，调整细胞至所需浓度，备用细胞，洗涤，调整细胞至所需浓度，
17、备用杂交瘤细胞的制备杂交瘤细胞的制备 骨髓瘤细胞悬液制备骨髓瘤细胞悬液制备v收集经传代生长收集经传代生长24 h24 h的骨髓瘤细胞，洗涤后，计数，的骨髓瘤细胞，洗涤后，计数，备用备用杂交瘤细胞的制备杂交瘤细胞的制备 细胞融合细胞融合v脾细胞（脾细胞（1101108 8）与骨髓瘤细胞（）与骨髓瘤细胞（2 23103107 7）混合）混合v加入加入PEGPEG诱导融合，时间控制在诱导融合，时间控制在2 min2 min以内以内v用培养液将用培养液将PEGPEG融合液缓慢稀释融合液缓慢稀释细胞融合的注意点细胞融合的注意点v脾脾B B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的比例一般为淋巴细胞与骨髓瘤细胞的比例一般为(
18、5(510)10)：1 1vPEGPEG的分子量：一般选择的分子量：一般选择4000400060006000，浓度，浓度404050%50%v在在PEGPEG溶液中加入溶液中加入DMSODMSO，可以提高细胞接触的紧密性，可以提高细胞接触的紧密性，提高融合率提高融合率v应严格限制应严格限制PEGPEG、DMSODMSO和细胞接触的时间和细胞接触的时间杂交瘤细胞的筛选杂交瘤细胞的筛选v筛选之前的细胞混合液中含有多种细胞筛选之前的细胞混合液中含有多种细胞未融合的细胞：脾细胞、瘤细胞未融合的细胞：脾细胞、瘤细胞融合的细胞：脾融合的细胞：脾脾、瘤脾、瘤瘤、脾瘤、脾瘤瘤v筛选：筛选：HATHAT选择性培
19、养基选择性培养基含次黄嘌呤（含次黄嘌呤（H H）、氨基喋呤（）、氨基喋呤（A A）和胸腺嘧啶（）和胸腺嘧啶（T T）氨基喋呤阻断氨基喋呤阻断DNADNA合成途径，瘤合成途径，瘤瘤细胞不能合成瘤细胞不能合成DNADNA而死亡而死亡脾细胞在一般条件下不能连续培养，亦很快死亡脾细胞在一般条件下不能连续培养，亦很快死亡骨髓瘤细胞是骨髓瘤细胞是HGPRTHGPRT（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）缺（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）缺乏细胞株，而脾细胞内含有乏细胞株，而脾细胞内含有HGPRTHGPRT，因此杂交瘤细胞可利用，因此杂交瘤细胞可利用H H、A A和和T T合成合成DNADNA而得以生长而得以生长
20、 用于细胞融和的骨髓瘤细胞应具备融和率高，自用于细胞融和的骨髓瘤细胞应具备融和率高，自身不分泌抗体，所产生的杂交瘤细胞分泌抗体的能身不分泌抗体，所产生的杂交瘤细胞分泌抗体的能力强且长期稳定等特点。力强且长期稳定等特点。PEG PEG的相对分子质量和浓度越大，其促融和率越的相对分子质量和浓度越大，其促融和率越高。但其黏度和对细胞的毒性也随之增大。常用浓高。但其黏度和对细胞的毒性也随之增大。常用浓度为度为40%50%40%50%，相对分子质量，相对分子质量40004000为佳。相对分子质为佳。相对分子质量在量在40060004006000，浓度在，浓度在10%60%10%60%范围内的范围内的PE
21、GPEG都能使都能使细胞发生融合。为了提高融合率，在细胞发生融合。为了提高融合率，在PEG PEG 溶液中加溶液中加入入DMSODMSO，以提高细胞接触的紧密性，增加融合率。，以提高细胞接触的紧密性，增加融合率。但必须严格限制接触时间。但必须严格限制接触时间。杂交瘤细胞的筛选杂交瘤细胞的筛选 选择性培养方法选择性培养方法v将融合细胞悬浮于将融合细胞悬浮于HAT 培养液中，加入到含有饲养细培养液中，加入到含有饲养细胞（如小鼠腹腔巨噬细胞）的胞（如小鼠腹腔巨噬细胞）的96孔板内，每孔板内，每23天换天换液一次液一次v换液时取出换液时取出1/22/3培养液，加入等量的新鲜培养液培养液，加入等量的新鲜
22、培养液v细胞融合后一周内用细胞融合后一周内用HAT 培养液，杀死杂细胞后，第培养液，杀死杂细胞后，第二周改用二周改用HT 培养液（不含培养液（不含A）v从第三周起改用普通的从第三周起改用普通的RPMI1640完全培养液完全培养液v从细胞融合后从细胞融合后89天起可对上清进行抗体检测，筛选天起可对上清进行抗体检测，筛选阳性克隆阳性克隆杂交瘤细胞的筛选杂交瘤细胞的筛选 筛选阳性克隆筛选阳性克隆v筛选要求：筛选要求：微量、快速、特异、敏感、简便，可一次微量、快速、特异、敏感、简便，可一次性检测大批标本性检测大批标本v常用方法：常用方法：免疫分析法，如免疫分析法，如ELISAELISA 将抗原固定在微
23、孔板上，细将抗原固定在微孔板上，细胞培养上清培育一定时间后，用胞培养上清培育一定时间后，用酶标的抗鼠二抗，通过酶促反应酶标的抗鼠二抗，通过酶促反应底物颜色变化，了解是否含有针底物颜色变化，了解是否含有针对该抗原的抗体存在。对该抗原的抗体存在。杂交瘤细胞的克隆化杂交瘤细胞的克隆化v克隆化：克隆化：使单个细胞通过无性繁殖而获得该细胞群体使单个细胞通过无性繁殖而获得该细胞群体的整个培养过程，这种群体细胞的生物学特性和功能的整个培养过程，这种群体细胞的生物学特性和功能完全相同完全相同v原因：原因：筛选出的阳性克隆中，大多数情况下产生抗体筛选出的阳性克隆中，大多数情况下产生抗体的杂交瘤集落不是来自单个细
24、胞，其中可能混有不分的杂交瘤集落不是来自单个细胞，其中可能混有不分泌抗体的细胞，这种细胞比分泌抗体的细胞生长快，泌抗体的细胞，这种细胞比分泌抗体的细胞生长快，容易占据优势；此外，刚融合的杂交瘤细胞不稳定，容易占据优势；此外，刚融合的杂交瘤细胞不稳定，染色体易丢失染色体易丢失v一般融合后的杂交瘤细胞要经过三次左右的的克隆化，一般融合后的杂交瘤细胞要经过三次左右的的克隆化，才能达到才能达到100%100%孔内均为抗体阳性细胞克隆孔内均为抗体阳性细胞克隆克隆化方法克隆化方法 有限稀释法有限稀释法v将杂交瘤细胞悬液稀释至一定浓度，加入到将杂交瘤细胞悬液稀释至一定浓度，加入到9696孔培养孔培养板中，使
25、每个孔中的细胞尽可能为单细胞，经过一段板中，使每个孔中的细胞尽可能为单细胞，经过一段时间培养最终形成细胞克隆时间培养最终形成细胞克隆v可在光学显微镜下观察到细胞分裂，直至细胞集落形可在光学显微镜下观察到细胞分裂，直至细胞集落形成成克隆化方法克隆化方法 软琼脂培养法软琼脂培养法v将一定浓度的待克隆细胞与将一定浓度的待克隆细胞与2%2%琼脂糖培养液混合，铺琼脂糖培养液混合，铺于底部含有于底部含有1%1%琼脂糖培养液平皿的上部，待单细胞集琼脂糖培养液平皿的上部，待单细胞集落生长至落生长至1 12 mm2 mm时，用毛细管吸取单集落，转移到细时，用毛细管吸取单集落，转移到细胞培养板中培养胞培养板中培养
26、v工作效率高，一次克隆化即可获得稳定分泌抗体的杂工作效率高，一次克隆化即可获得稳定分泌抗体的杂交瘤细胞，但对操作熟练程度要求高交瘤细胞，但对操作熟练程度要求高杂交瘤细胞库的建立杂交瘤细胞库的建立v第一次融合的细胞在每次克隆过程中，均应对检测阳第一次融合的细胞在每次克隆过程中，均应对检测阳性的细胞扩大培养，冻存一定量的细胞性的细胞扩大培养，冻存一定量的细胞v经经3 34 4次克隆，次克隆，100%100%杂交瘤细胞孔为分泌抗体阳性细杂交瘤细胞孔为分泌抗体阳性细胞时，扩大培养，冻存较大量的细胞，建立较完整的胞时，扩大培养，冻存较大量的细胞，建立较完整的原始细胞库原始细胞库v原始细胞库中的细胞应包括
27、原始融合细胞、每次克隆原始细胞库中的细胞应包括原始融合细胞、每次克隆的细胞及建株的细胞，且建株细胞的溯源应明确的细胞及建株的细胞，且建株细胞的溯源应明确v原始细胞库中的建株细胞经扩大培养，再建立一个工原始细胞库中的建株细胞经扩大培养，再建立一个工作细胞库，用于日常研究和生产作细胞库，用于日常研究和生产可获得可获得10g/ml的抗体。多采用的抗体。多采用RPMI 1640培养液，培养液，添加添加10%20%胎牛或小牛血清。但由于培养液中含有胎牛或小牛血清。但由于培养液中含有血清成分，总蛋白量可达血清成分，总蛋白量可达100g/ml以上，给纯化带来以上，给纯化带来困难。加入小牛血清又是发生支原体污
28、染的原因，而困难。加入小牛血清又是发生支原体污染的原因，而且批间质量差异太大，直接且批间质量差异太大，直接影响杂交瘤细胞的生长。影响杂交瘤细胞的生长。改良的方法有：改良的方法有：无血清无血清培养法、悬浮培养法、微载体培养法、悬浮培养法、微载体悬浮悬浮培养法。培养法。无血清培养法无血清培养法：利用白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、乙利用白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺等混合物代替小牛血清。此法虽可减少污染，但醇胺等混合物代替小牛血清。此法虽可减少污染，但产量不高。产量不高。悬浮培养法悬浮培养法：连续悬浮培养的细胞密度可连续悬浮培养的细胞密度可2*107/ml,收收集的单克隆抗体可达集的单克隆抗体可达40
29、0 g/ml。如在培养液中加入微。如在培养液中加入微载体，细胞密度可达载体，细胞密度可达108。杂交瘤细胞的培养工艺杂交瘤细胞的培养工艺（1）体外培养法：）体外培养法：基本程序：基本程序：接种前接种前12周，小鼠腹腔注射周，小鼠腹腔注射0.5ml Pristane（降植烷）或用液体石蜡，然后注射（降植烷）或用液体石蜡，然后注射1*106杂杂交瘤细胞，交瘤细胞，712d便有腹水生成，待生成腹水后再提便有腹水生成，待生成腹水后再提取，离心去细胞沉淀，取上清液冻存。取，离心去细胞沉淀，取上清液冻存。优点：优点：操作简便，比较经济，所得单克隆抗体量多操作简便，比较经济，所得单克隆抗体量多且效价高，还可
30、有效地保存杂交瘤细胞株和分离已污且效价高，还可有效地保存杂交瘤细胞株和分离已污染杂菌的杂交瘤细胞株。染杂菌的杂交瘤细胞株。缺点：缺点：小鼠腹水中混有来自小鼠的多种杂蛋白，给小鼠腹水中混有来自小鼠的多种杂蛋白，给纯化带来难度。纯化带来难度。（2）动物体内诱生法）动物体内诱生法可获得可获得10m/ml的抗体。常用方法的抗体。常用方法。腹腔注射法腹腔注射法19.2.3 19.2.3 单克隆抗体的纯化工艺单克隆抗体的纯化工艺v凝胶过滤凝胶过滤用于用于IgGIgG和和IgMIgM类类McAbMcAb的分离纯化，常用的分离纯化，常用Sephadex G 200Sephadex G 200为分为分离介质离介
31、质抗体回收率抗体回收率505080%80%，纯度可达，纯度可达95%95%以上，能去除微量杂蛋白以上，能去除微量杂蛋白v阴离子交换层析阴离子交换层析用于用于IgGIgG类类McAbMcAb的纯化，常用的纯化，常用DEAEDEAE型弱阴离子交换剂型弱阴离子交换剂时上柱，抗体与介质结合，除去较多杂蛋白时上柱，抗体与介质结合，除去较多杂蛋白时时IgG1IgG1和和IgG2IgG2能结合在能结合在DEAEDEAE基团上基团上IgG2aIgG2a可在低离子强度下洗脱，纯度较高可在低离子强度下洗脱，纯度较高IgG2bIgG2b和和IgG3IgG3在提高离子强度时洗脱在提高离子强度时洗脱v亲和层析亲和层析P
32、rotein AProtein A层析法为最常用，特别适用于层析法为最常用，特别适用于IgGIgG类单类单抗的纯化抗的纯化pHpH值决定值决定IgGIgG与与Protein AProtein A的结合程度，采用不同的结合程度，采用不同pHpH值的缓冲液可以选择性洗脱不同亚类的值的缓冲液可以选择性洗脱不同亚类的IgGIgG收获抗体的纯度很高收获抗体的纯度很高Protein AProtein A亲和介质价格较昂贵亲和介质价格较昂贵v疏水性电荷诱导层析（疏水性电荷诱导层析（HCICHCIC）HCICHCIC介质配基中的硫原子对介质配基中的硫原子对TrpTrp和和PhePhe等氨基酸有特殊的亲和力，因
33、此等氨基酸有特殊的亲和力，因此HCICHCIC配基配基能与抗体的能与抗体的FcFc片段特异性结片段特异性结合合吡啶和咪唑等杂环在吡啶和咪唑等杂环在pH 4pH 41010范围范围内不带电荷，减少了静电对杂质的吸内不带电荷，减少了静电对杂质的吸附；当附；当pHpH值降到小于配基的值降到小于配基的p pK Ka a时，时，杂环质子化，此时抗体也带有正电荷，杂环质子化，此时抗体也带有正电荷，产生静电排斥产生静电排斥A、McAb均是鼠源性抗体，应用于人体内可产均是鼠源性抗体，应用于人体内可产生人抗鼠抗体（生人抗鼠抗体（HAMA），加速了排斥反应，在），加速了排斥反应，在人体内的半衰期只有人体内的半衰期
34、只有56h，维持有效药物作用，维持有效药物作用靶组织时间；靶组织时间；B、完整的抗体分子的相对分子质量过大，难以、完整的抗体分子的相对分子质量过大，难以穿透实体肿瘤组织，达不到有效的治疗浓度。穿透实体肿瘤组织，达不到有效的治疗浓度。McAb 在免疫导向疗法中存在的问题（障碍）：在免疫导向疗法中存在的问题（障碍）：A、降低、降低McAb的免疫源性；的免疫源性；B、降低、降低McAb的相对分子质量的相对分子质量需要解决的问题：需要解决的问题：解决问题的方法或途径解决问题的方法或途径基因工程技术基因工程技术 1984年报道了人年报道了人鼠嵌合抗体，之后制备鼠嵌合抗体，之后制备出了改型抗体、单链抗体、
35、单域抗体、最小出了改型抗体、单链抗体、单域抗体、最小识别单位等多种类型，基本上消除了抗体的识别单位等多种类型，基本上消除了抗体的鼠源性（免疫源性），相对分子质量只有完鼠源性（免疫源性），相对分子质量只有完整抗体分子的整抗体分子的1/801/3。19.3 基因工程抗体基因工程抗体基因工程抗体基因工程抗体(Genetic engineering antibody)指用基因工程方法，对抗体的基因进行重组、指用基因工程方法，对抗体的基因进行重组、缺失、修饰改型等，构建载体，在受体细胞中表缺失、修饰改型等，构建载体，在受体细胞中表达，获得抗体。达，获得抗体。将小鼠将小鼠IgIg基因敲除，转染人基因敲除，
36、转染人IgIg基因，在基因，在小鼠体内产生人小鼠体内产生人AbAb，再经杂交瘤技术，产生，再经杂交瘤技术，产生大量完全人源化抗体大量完全人源化抗体人源化抗体人源化抗体鼠源性单克隆抗体的改造目的和原理鼠源性单克隆抗体的改造目的和原理目的：一是降低免疫源性；目的：一是降低免疫源性；二是降低相对分子量，增加组织通透性二是降低相对分子量，增加组织通透性 原理：抗体同抗原结合的功能决定于抗体分子原理：抗体同抗原结合的功能决定于抗体分子的可变区（的可变区（V V），同种性免疫源性则决定于抗体），同种性免疫源性则决定于抗体分子的稳定区（分子的稳定区（C C）。在基因水平上把鼠源性单）。在基因水平上把鼠源性单
37、克隆抗体的克隆抗体的H H和和L L链的链的V V区基因分离出来，分别与区基因分离出来，分别与人人IgIg的的H H链和链和L L链的链的C C区基因连接，即成为人区基因连接，即成为人鼠鼠嵌合抗体的嵌合抗体的H H和和L L链基因，再共转染骨髓瘤细胞，链基因，再共转染骨髓瘤细胞，就能表达出完整的嵌合抗体就能表达出完整的嵌合抗体.人一鼠嵌合抗体是将鼠源单抗的可变区与人抗体的人一鼠嵌合抗体是将鼠源单抗的可变区与人抗体的恒定区融合而得到的抗体。恒定区融合而得到的抗体。方法：方法：将鼠源单抗的可变区基因克隆出来，连到包含有人将鼠源单抗的可变区基因克隆出来，连到包含有人抗体恒定区基因及表达所需的其它元件
38、抗体恒定区基因及表达所需的其它元件(如启动子、增如启动子、增强子、选择标记等强子、选择标记等)的表达载体上，在哺乳动物细胞的表达载体上，在哺乳动物细胞(如骨髓瘤细胞、如骨髓瘤细胞、CHOCHO细胞细胞)中表达。中表达。特点：特点：减少了鼠源性抗体的免疫原性减少了鼠源性抗体的免疫原性 保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力（1 1）嵌合抗体）嵌合抗体 尽管嵌合抗体的免疫原性已降低很多，但有时尽管嵌合抗体的免疫原性已降低很多，但有时它仍可能引发较强的免疫反应。为了进一步降低抗它仍可能引发较强的免疫反应。为了进一步降低抗体的鼠源成分，发展出体的鼠源成分，发展出CDRCD
39、R移植技术。移植技术。CDR CDR移植即把鼠抗体的移植即把鼠抗体的CDRCDR序列移植到人抗体的序列移植到人抗体的可变区内，所得到的抗体称可变区内，所得到的抗体称CDRCDR移植抗体或改型抗移植抗体或改型抗体，也就是人源化抗体。体，也就是人源化抗体。（2 2）改型抗体）改型抗体 经过经过CDRCDR移植，抗移植，抗体的免疫原性极低，而体的免疫原性极低，而其抗原结合能力保持不其抗原结合能力保持不变变 结合半抗原及全抗原结合半抗原及全抗原(如细胞表面受体、病毒如细胞表面受体、病毒等等)的改形抗体都已有报的改形抗体都已有报道，到现在已有数百种人道，到现在已有数百种人源化抗体。（美国正式上源化抗体。
40、（美国正式上市的市的11种治疗性单抗中多种治疗性单抗中多数是改型抗体）数是改型抗体）人源化抗体的构建可用人源化抗体的构建可用人源化抗体的构建可用人源化抗体的构建可用全合成法全合成法全合成法全合成法或或或或定点突定点突定点突定点突变法变法变法变法。全合成法全合成法全合成法全合成法是以人抗体序列为骨架，以鼠抗是以人抗体序列为骨架，以鼠抗是以人抗体序列为骨架，以鼠抗是以人抗体序列为骨架，以鼠抗体的体的体的体的CDRCDRCDRCDR置换人抗体的置换人抗体的置换人抗体的置换人抗体的CDRCDRCDRCDR，将整个可变区序列，将整个可变区序列，将整个可变区序列，将整个可变区序列的两条链分解成若干片段，并
41、使相邻的片段具的两条链分解成若干片段，并使相邻的片段具的两条链分解成若干片段，并使相邻的片段具的两条链分解成若干片段，并使相邻的片段具有彼此互补的粘性末端。合成所有有彼此互补的粘性末端。合成所有有彼此互补的粘性末端。合成所有有彼此互补的粘性末端。合成所有DNADNADNADNA片段，每片段，每片段，每片段，每组片段分别退火，然后逐组连接成完整的可变组片段分别退火，然后逐组连接成完整的可变组片段分别退火，然后逐组连接成完整的可变组片段分别退火，然后逐组连接成完整的可变区基因，插入质粒中，进一步即可用于构建和区基因，插入质粒中，进一步即可用于构建和区基因，插入质粒中，进一步即可用于构建和区基因，插
42、入质粒中，进一步即可用于构建和表达改形抗体。表达改形抗体。表达改形抗体。表达改形抗体。定点突变法定点突变法定点突变法定点突变法是将人的可变区基因克隆，根是将人的可变区基因克隆，根是将人的可变区基因克隆，根是将人的可变区基因克隆，根据鼠抗体的据鼠抗体的据鼠抗体的据鼠抗体的CDR CDR CDR CDR 序列合成几种突变引物，用定序列合成几种突变引物，用定序列合成几种突变引物，用定序列合成几种突变引物，用定点突变的方法将人的可变区基因的点突变的方法将人的可变区基因的点突变的方法将人的可变区基因的点突变的方法将人的可变区基因的CDRCDRCDRCDR序列变为序列变为序列变为序列变为鼠抗体的鼠抗体的鼠
43、抗体的鼠抗体的CDRCDRCDRCDR序列，然后表达出改型抗体。序列，然后表达出改型抗体。序列，然后表达出改型抗体。序列，然后表达出改型抗体。研究表明，在构建改形抗体时，简单地进行研究表明，在构建改形抗体时，简单地进行研究表明，在构建改形抗体时，简单地进行研究表明，在构建改形抗体时，简单地进行CDRCDRCDRCDR替换并不能保证抗体具有好的亲和力，因此替换并不能保证抗体具有好的亲和力，因此替换并不能保证抗体具有好的亲和力，因此替换并不能保证抗体具有好的亲和力，因此在构建时还必需包括在构建时还必需包括在构建时还必需包括在构建时还必需包括对影响抗原结合位点的空对影响抗原结合位点的空对影响抗原结合
44、位点的空对影响抗原结合位点的空间结构的框架序列间结构的框架序列间结构的框架序列间结构的框架序列进行操作。进行操作。进行操作。进行操作。FabFab：抗原结合片断抗原结合片断FvFv：可变区片段可变区片段ScFvScFv：单链可变区片段单链可变区片段单域抗体单域抗体最小识别单位最小识别单位小分子抗体小分子抗体分子量较小但具有抗原结合功能的分子片段。分子量较小但具有抗原结合功能的分子片段。基基因工程小分子抗体仅表达鼠源性单克隆抗体的因工程小分子抗体仅表达鼠源性单克隆抗体的V V区片段，其相对分子质量仅为原抗体区片段，其相对分子质量仅为原抗体1/80-1/31/80-1/3。FvFvScFvScFv
45、单区抗体单区抗体最小识别单位最小识别单位FabFab 由完整的由完整的由完整的由完整的轻链和轻链和轻链和轻链和FdFdFdFd组成，大小为完整分子的组成，大小为完整分子的组成，大小为完整分子的组成，大小为完整分子的1/31/31/31/3。把把把把FabFabFabFab与细菌的前导肽相连，在前导肽的作用下与细菌的前导肽相连，在前导肽的作用下与细菌的前导肽相连，在前导肽的作用下与细菌的前导肽相连，在前导肽的作用下FabFabFabFab进入质周腔，装配折叠后，它具有结合抗原的活进入质周腔，装配折叠后，它具有结合抗原的活进入质周腔，装配折叠后，它具有结合抗原的活进入质周腔，装配折叠后，它具有结合
46、抗原的活性。性。性。性。(1)Fab(1)Fab(1)Fab(1)Fab FvFvFvFv、ScFvScFvScFvScFv的大小约为全分子的的大小约为全分子的的大小约为全分子的的大小约为全分子的1/61/61/61/6。(2)Fv(2)Fv(2)Fv(2)Fv 或或或或 ScFv ScFv ScFv ScFv FvScFv连接肽连接肽连接肽连接肽FvFvFvFv由由由由VHVHVHVH与与与与VLVLVLVL构成，由于其结合是非共价结合，构成，由于其结合是非共价结合，构成，由于其结合是非共价结合，构成，由于其结合是非共价结合，故故故故FvFvFvFv不稳定。在不稳定。在不稳定。在不稳定。在V
47、HVHVHVH与与与与VLVLVLVL之间加上一段连接肽，把之间加上一段连接肽，把之间加上一段连接肽，把之间加上一段连接肽，把VHVHVHVH与与与与VLVLVLVL连成一条单链，得到连成一条单链，得到连成一条单链，得到连成一条单链，得到ScFvScFvScFvScFv，即单链抗体即单链抗体即单链抗体即单链抗体。连接肽连接肽连接肽连接肽的长度在的长度在的长度在的长度在10-1510-1510-1510-15个氨基酸左右，不宜太长个氨基酸左右，不宜太长个氨基酸左右，不宜太长个氨基酸左右，不宜太长或太短，它应具有柔软性，侧链少，抗原性弱等或太短，它应具有柔软性，侧链少，抗原性弱等或太短，它应具有柔
48、软性，侧链少，抗原性弱等或太短，它应具有柔软性，侧链少，抗原性弱等特点。常用的连接肽是特点。常用的连接肽是特点。常用的连接肽是特点。常用的连接肽是(GGGGS)(GGGGS)(GGGGS)(GGGGS)3 3 3 3。单链抗体单链抗体单链抗体单链抗体的构建在已知亲本的构建在已知亲本的构建在已知亲本的构建在已知亲本DNADNADNADNA序列时可用完序列时可用完序列时可用完序列时可用完全全全全人工合成法人工合成法人工合成法人工合成法单链抗体最常用的表达体系是单链抗体最常用的表达体系是单链抗体最常用的表达体系是单链抗体最常用的表达体系是大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌 即为即为即为即为VHVHVH
49、VH，约为完整分子的，约为完整分子的，约为完整分子的，约为完整分子的1/121/121/121/12。它只由一个。它只由一个。它只由一个。它只由一个结构域构成，故称结构域构成，故称结构域构成，故称结构域构成，故称单域抗体。单域抗体。单域抗体。单域抗体。单域抗体尽管亲单域抗体尽管亲单域抗体尽管亲单域抗体尽管亲和力有所降低，但仍保持着原单抗的特异性。和力有所降低，但仍保持着原单抗的特异性。和力有所降低，但仍保持着原单抗的特异性。和力有所降低，但仍保持着原单抗的特异性。(3)(3)单域抗体单域抗体VH 约为完整分子的约为完整分子的约为完整分子的约为完整分子的1/80-1/701/80-1/701/8
50、0-1/701/80-1/70大小，一般由一大小，一般由一大小，一般由一大小，一般由一个个个个CDRCDRCDRCDR构成，它也保持着抗体的特异性。构成，它也保持着抗体的特异性。构成，它也保持着抗体的特异性。构成，它也保持着抗体的特异性。(4)(4)最小识别单位最小识别单位CDR可以用细菌发酵生产，成本低可以用细菌发酵生产，成本低;分子小，穿透力强分子小，穿透力强;不含不含Fc，没有，没有Fc带来的效应带来的效应;在体内循环的半衰期短，易清除，利于解毒排出在体内循环的半衰期短，易清除，利于解毒排出;易于与毒素或酶基因连接，便于直接获得免疫毒易于与毒素或酶基因连接，便于直接获得免疫毒素或酶标抗体