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1、关于流式细胞仪的应用(2)第1页，讲稿共99张，创作于星期二流式细胞术在流式细胞术在基础研究中的应用基础研究中的应用细胞活力的检测细胞活力的检测细胞周期分析细胞周期分析细胞凋亡分析细胞凋亡分析多药耐药基因研究（多药耐药基因研究（MDRMDR）RNARNA测定、测定、DNADNA测定测定细胞内离子的测定及细胞内离子的测定及pHpH值测定值测定第2页，讲稿共99张，创作于星期二流式细胞术的临床应用流式细胞术的临床应用n n白血病免疫分型白血病免疫分型n nHLA-B27:强直性脊柱炎强直性脊柱炎n n淋巴细胞亚群淋巴细胞亚群n n造血干细胞计数：造血干细胞移植造血干细胞计数：造血干细胞移植n n网
2、织红细胞网织红细胞n nPNH诊断（诊断（CD55、CD59）n n血小板活化试验血小板活化试验第3页，讲稿共99张，创作于星期二 guavaeasyCyte8HTguavaeasyCyte8HT微毛细管细胞微毛细管细胞分析仪分析仪厂家厂家厂家厂家：MilliporeMillipore获奖理由获奖理由获奖理由获奖理由：突破性的微毛细管技术，无需突破性的微毛细管技术，无需鞘液，样品体积少，废液更少，让细胞分鞘液，样品体积少，废液更少，让细胞分析变得更简单、快捷、易于操控析变得更简单、快捷、易于操控 4第4页，讲稿共99张，创作于星期二Guava多种分析多种分析GuavaViaCount活细胞绝对
3、计数活细胞绝对计数GuavaCellCycle细胞周期分析细胞周期分析GuavaExpressCellSurfaceAntigenDetection细胞表面蛋白检测细胞表面蛋白检测GuavaRapidQuant小鼠及人的小鼠及人的IgG定量定量细胞凋亡细胞凋亡GuavaNexinAnnexinV结合结合GuavaCaspase3/7GuavaCaspase8GuavaMultiCaspaseGuavaTUNELGuavaMitoPotential线粒体膜电位线粒体膜电位细胞示踪细胞示踪GuavaCellToxicity细胞毒性：细胞毒性：NK，CMC，ADCCGuavaCellPaint靶细胞
4、监测靶细胞监测GuavaCellGrowth细胞增殖：原代细胞细胞增殖：原代细胞第5页，讲稿共99张，创作于星期二第6页，讲稿共99张，创作于星期二细胞活力的检测细胞活力的检测在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力。第7页，讲稿共99张，创作于星期二第8页，讲稿共99张，创作于星期二第9页，讲稿共99张，创作于星期二Dead Cell Discrimination Cells should not be fixed/permeabilized prior to running on the flowcytometer.Cellsareincubate
5、donicefor1-5minutesinPIatafinalconcentrationof2ug/ml.第10页，讲稿共99张，创作于星期二细胞周期分析第11页，讲稿共99张，创作于星期二第12页，讲稿共99张，创作于星期二在在在在细细细细胞胞胞胞周周周周期期期期内内内内DNADNADNADNA含含含含量量量量各各各各时时时时期期期期发发发发生生生生周周周周期期期期性性性性变变变变化化化化，通通通通过过过过荧荧荧荧光光光光探探探探针针针针对对对对细细细细胞胞胞胞进进进进行行行行相相相相对对对对DNADNADNADNA含含含含量量量量测测测测定定定定，可可可可分分分分析析析析细细细细胞胞胞胞周
6、周周周期期期期各各各各时时时时期期期期相相相相对对对对的的的的百百百百分分分分比比比比，了了了了解解解解细细细细胞胞胞胞群群群群体体体体的的的的倍倍倍倍体体体体性性性性和和和和增增增增殖殖殖殖能能能能力力力力。DNADNA含含含含量量量量常常常常和和和和某某某某种种种种细细细细胞胞胞胞周周周周期期期期相相相相关关关关蛋蛋蛋蛋白白白白同同同同时时时时检检检检测测测测，来分析细胞处于某一特定周期阶段。来分析细胞处于某一特定周期阶段。来分析细胞处于某一特定周期阶段。来分析细胞处于某一特定周期阶段。恶变肿瘤细胞一般多出现异倍体，恶变肿瘤细胞一般多出现异倍体，恶变肿瘤细胞一般多出现异倍体，恶变肿瘤细胞一
7、般多出现异倍体，DNADNA含量分析对肿瘤的诊含量分析对肿瘤的诊含量分析对肿瘤的诊含量分析对肿瘤的诊断预后有很高的价值断预后有很高的价值断预后有很高的价值断预后有很高的价值,尤其对细胞毒性药物的研究很有价值。尤其对细胞毒性药物的研究很有价值。尤其对细胞毒性药物的研究很有价值。尤其对细胞毒性药物的研究很有价值。第13页，讲稿共99张，创作于星期二G2MGG0 0GG1 1s02004006008001000G0G1sG2MDNAcontentCount2N2N4N4NG0期细胞被认为是不参与增殖周期循环的一群细胞，即为静止细胞，其细胞DNA含量为较恒定的2N值，G1期细胞与G0期细胞DNA值相同
8、，均为二倍体DNA含量，当细胞进入S期后，DNA含量逐渐增加，当细胞DNA倍增结束，进入G2期，最终进入M期，在M期分裂为两个子细胞之前，G2和M期细胞的DNA含量均为恒定的4N值，即为四倍体细胞群。第14页，讲稿共99张，创作于星期二G0-G1SG2-MFluorescence Intensity#of EventsA typical DNA Histogram of cell proliferation第15页，讲稿共99张，创作于星期二样品制备 1000rpm 51000rpm 5分钟分钟收集收集2X102X106 6个细胞个细胞PBSPBS漂洗漂洗 两次两次 70%70%酒精酒精4 4
9、度固定过夜度固定过夜收集固定的细胞收集固定的细胞PBSPBS漂漂洗洗0.5ml PBS0.5ml PBS悬浮细胞悬浮细胞2.5l2.5l 10g/l 10g/l RNase A RNase A3737度消化度消化1 1小时小时过过300300目细胞筛目细胞筛50l 0.1mg/ml 50l 0.1mg/ml PIPI（含（含1%Triton)1%Triton)1000rpm 51000rpm 5分钟分钟 离心离心两次两次混匀，室温混匀，室温静止静止5 5分钟分钟上机第16页，讲稿共99张，创作于星期二经经RNA酶处理前后的比较酶处理前后的比较RNA也是核酸，也会被PI染色，为避免干扰,染色前需
10、用RNAse降解RNA。这样PI只染DNA，能精确以荧光强度反映DNA的含量。第17页，讲稿共99张，创作于星期二n n结果解读结果解读n nG0/G1G0/G1期期细细胞胞占占总总的的61.2%61.2%，峰峰位位于横座标的于横座标的45.7645.76n nG2/MG2/M期期占占13.0713.07，峰峰位位于于横横座座标标的的91.4391.43n nS S期期占占25.7325.73n nG2/G1G2/G1为为2.02.0（即即G2G2期期为为4 4倍倍体体细细胞胞，而而G1G1期为期为2 2倍体细胞，比值为倍体细胞，比值为2 2）n n峰的变异系数为峰的变异系数为4.54%4.5
11、4%（好）（好）n n细细胞胞碎碎片片为为0.48%0.48%，细细 胞胞 聚聚 集集 体体 有有0.06%0.06%。n n总总 的的 细细 胞胞 数数（仪仪 器器 检检 测测 到到 的的）为为1752517525个，个，n n在在 细细 胞胞 周周 期期 中中 分分 析析 的的 细细 胞胞 数数 为为1743117431个个（即即排排除除了了碎碎片片及及聚聚集集体后）体后）n nCVCV是是变变异异系系数数。一一般般CVCV越越小小，峰峰形形越越好好，越越尖尖锐锐。能能控控制制在在5%5%左左右右是是比比较较好好的的结结果果，一一般般小小于于10%10%就就可可以以认认可可了了。第18页，
12、讲稿共99张，创作于星期二应用应用DNA含量测定鉴定细胞凋亡含量测定鉴定细胞凋亡如果有凋亡，在G0/G1期前面有个凋亡峰(也称sub-G0期)在凋亡细胞中，用在凋亡细胞中，用PIPI染色，通过流式检测染色，通过流式检测DNADNA含量，含量，可以发现一种亚群的细胞，其染色荧光强度下降。这可以发现一种亚群的细胞，其染色荧光强度下降。这是由于随着调亡的进行，核酸内切酶活化，随后一部是由于随着调亡的进行，核酸内切酶活化，随后一部分分DNADNA泄漏出去，造成细胞内泄漏出去，造成细胞内DNADNA含量下降造成的。含量下降造成的。第19页，讲稿共99张，创作于星期二Flow Cytometry of A
13、poptotic CellsPI-Fluorescence#EventsApoptotic cellsNormal G0/G1 cells第20页，讲稿共99张，创作于星期二缺乏缺乏IL-3诱导的细胞凋亡诱导的细胞凋亡第21页，讲稿共99张，创作于星期二第22页，讲稿共99张，创作于星期二在在DNA直方图上区分凋亡峰和细胞碎片峰直方图上区分凋亡峰和细胞碎片峰上图为细胞碎片峰，在二倍体G0/1峰之前呈左高右低的抛物线（蓝色）上图为细胞凋亡峰，在二倍体G0/1峰之前呈对称分布的抛物线（蓝色）第23页，讲稿共99张，创作于星期二流式细胞术在生殖医学中的应用流式细胞术在生殖医学中的应用精子细胞和精子为
14、单倍体细胞1C;次级精母细胞为二倍体细胞2C;初级精母细胞和处于G2M期的精原细胞4C第24页，讲稿共99张，创作于星期二细胞凋亡分析第25页，讲稿共99张，创作于星期二细胞凋亡细胞凋亡n特点：染色质的浓缩特点：染色质的浓缩,核膜及细胞膜的内陷核膜及细胞膜的内陷,接着核碎接着核碎裂成分离的片段裂成分离的片段,凋亡小体凋亡小体(apoptosis body)(apoptosis body)的出现。的出现。n在流式细胞仪上，对于光散射特性观察凋亡细胞的改变：在流式细胞仪上，对于光散射特性观察凋亡细胞的改变：由于细胞的固缩，体积变小，由于细胞的固缩，体积变小，FSCFSC会变小，而细胞碎片及会变小，
15、而细胞碎片及颗粒增多，颗粒增多，SSCSSC也会改变。也会改变。第26页，讲稿共99张，创作于星期二在细胞凋亡过程中细胞形态学的变化在细胞凋亡过程中细胞形态学的变化第27页，讲稿共99张，创作于星期二n早早期凋亡的检测-capase3n早期凋亡Annexin-V-FITC/PI双染法n早期凋亡线粒体细胞膜电位的检测n晚期凋亡-“TUNEL”法n晚晚期凋亡-DNA含量分析法第28页，讲稿共99张，创作于星期二第29页，讲稿共99张，创作于星期二caspase-3Caspase家家族族在在介介导导细细胞胞凋凋亡亡的的过过程程中中起起着着非非常常重重要要的的作作用用，其其中中caspase-3为为关
16、关键键的的执执行行分分子子，它它在在凋凋亡亡信信号号传传导导的的许许多多途途径径中中发发挥挥功功能能。Caspase-3正正常常以以酶酶原原（32KD）的的形形式式存存在在于于胞胞浆浆中中，在在凋凋亡亡的的早早期期阶阶段段，它它被被激激活活，活活化化的的Caspase-3由由两两个个大大亚亚基基（17KD）和和两两个个小小亚亚基基（12KD）组组成成，裂裂解解相相应应的的胞胞浆浆胞胞核核底底物物，最最终终导导致致细细胞胞凋凋亡亡。但但在在细细胞胞凋凋亡亡的的晚晚期期和和死死亡细胞，亡细胞，caspase-3的活性明显下降。的活性明显下降。第30页，讲稿共99张，创作于星期二Massivesub
17、stratecleavageApoptosisSignalingReceptorCamptothecinFasLFADDPro-caspase8MitochondrialActivecaspase8?StaurosporineDNAdamageActiveBid+Pro-caspase9+Apaf-1+CytcActivecaspase9Activecaspase3(6,7)ZVADZVADMitochondriaFasPro-caspase3(6,7)ZVADDEATH第31页，讲稿共99张，创作于星期二FlowCytometricAnalysisofApoptosisFlowCytomet
18、ricAnalysisofApoptosisinJurkatTCellsinJurkatTCellsRelativeCellNumberRelativeCellNumberActiveCaspase-3FITC00.5124IncubationwithCamptothecin喜树碱喜树碱(hr)第32页，讲稿共99张，创作于星期二n早早期凋亡的检测capase3 n早期凋亡Annexin-V-FITC/PI双染法n早期凋亡线粒体细胞膜电位的检测n晚期凋亡-“TUNEL”法n晚晚期凋亡-DNA含量分析法第33页，讲稿共99张，创作于星期二Annexin-V-FITC/PI双染法双染法l正正常常细
19、细胞胞膜膜磷磷脂脂的的分分布布是是不不对对称称的的，膜膜内内表表面面含含有有带带负负电电的的磷磷脂脂（如如磷磷脂脂酰酰丝丝氨氨酸酸，PS），而而膜膜外外表表面面含有占绝大多数的中性磷脂。含有占绝大多数的中性磷脂。l在在细细胞胞凋凋亡亡早早期期，细细胞胞表表面面发发生生变变化化，细细胞胞膜膜内内部部的的PS迁迁移移到到细细胞胞外外层层表表面面。AnnexinV是是一一种种对对Ca2+依依赖赖，对对PS有有高高度度亲亲和和力力的的磷磷脂脂结结合合蛋蛋白白，可可作作为为探探针识别细胞膜表面是否有针识别细胞膜表面是否有PS，从而识别凋亡细胞。，从而识别凋亡细胞。第34页，讲稿共99张，创作于星期二An
20、nexinVAssay第35页，讲稿共99张，创作于星期二细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻染色体局部凝聚第36页，讲稿共99张，创作于星期二Annexin-V-FITC/PI双染法双染法n由由于于坏坏死死细细胞胞也也可可能能在在细细胞胞膜膜表表面面出出现现磷磷脂脂酰酰丝丝氨氨酸酸，又又在在细细胞胞凋凋亡亡的的初初始始阶阶段段细细胞胞膜膜是是完完好好的的，而而细细胞胞坏坏死死在在其其初初期期。细细胞胞膜膜有有损损伤伤的的细细胞胞DNA可可被被PI着着染染而而产产生生红红色色荧荧光光，而而细细胞胞膜膜保保持持完完好好的的细细胞胞则则不不会会有有红红色色荧荧光光产产生生。因因此此，在在细细胞胞凋凋亡亡的的早早
21、期期PI不不会着染而没有红色荧光信号，正常活细胞与此相似。会着染而没有红色荧光信号，正常活细胞与此相似。n在在流流式式细细胞胞术术双双参参数数散散点点图图上上左左下下象象限限显显示示活活细细胞胞，为为（AnnexinV-/PI-）；右右上上象象限限是是非非活活细细胞胞，即即坏坏死死细细胞胞，为为AnnexinV+/PI+；而而右右下下象象限限为为凋凋亡亡细细胞胞，显显现现AnnexinV+/PI-。第37页，讲稿共99张，创作于星期二第38页，讲稿共99张，创作于星期二AnnexinVAssay区分死亡与凋亡区分死亡与凋亡第39页，讲稿共99张，创作于星期二AnnexinV-PIAnalysi
22、sCamptothecin:喜树碱，抗肿瘤药物第40页，讲稿共99张，创作于星期二第41页，讲稿共99张，创作于星期二实验步骤实验步骤n n1.1.离离离离心心心心收收收收集集集集悬悬悬悬浮浮浮浮细细细细胞胞胞胞，微微微微量量量量离离离离心心心心机机机机转转转转速速速速2000RPM2000RPM，离离离离心心心心时时时时间间间间5min5min，弃弃弃弃培培培培养基。养基。养基。养基。n n2.2.用冷用冷用冷用冷PBSPBS洗涤细胞两次。洗涤细胞两次。洗涤细胞两次。洗涤细胞两次。n n3.3.用用用用 400ul400ul 1X1X BindingBinding BufferBuffer悬
23、悬悬悬 浮浮浮浮 细细细细 胞胞胞胞，浓浓浓浓 度度度度 大大大大 约约约约 为为为为 11 XX 10106 6 cells/mlcells/ml。n n4.4.在在在在细细细细胞胞胞胞悬悬悬悬浮浮浮浮液液液液中中中中加加加加入入入入5ul5ulAnnexinAnnexinV-FITCV-FITC，轻轻轻轻轻轻轻轻混混混混匀匀匀匀后后后后于于于于2-8C2-8C避避避避光光光光条条条条件件件件下孵育下孵育下孵育下孵育1515分钟。分钟。分钟。分钟。n n5.5.加入加入加入加入10ulPI10ulPI后轻轻混匀，于后轻轻混匀，于后轻轻混匀，于后轻轻混匀，于2-8C2-8C避光条件下孵育避光条
24、件下孵育避光条件下孵育避光条件下孵育5 5分钟。分钟。分钟。分钟。n n6.6.在在在在1 1小时内用流式细胞仪或荧光显微镜检测。小时内用流式细胞仪或荧光显微镜检测。小时内用流式细胞仪或荧光显微镜检测。小时内用流式细胞仪或荧光显微镜检测。第42页，讲稿共99张，创作于星期二n早早期凋亡的检测capase3 n早期凋亡Annexin-V-FITC/PI双染法n早期凋亡线粒体细胞膜电位的检测n晚期凋亡-“TUNEL”法n晚晚期凋亡-DNA含量分析法第43页，讲稿共99张，创作于星期二原原理理n n细胞凋亡与坏死在形态特征上有明显的区别，根据细胞凋亡和坏死的形态特点，一般认为在细胞坏死早期就会出现细
25、胞膜通透性及线粒体跨膜电位的改变，而在细胞凋亡时这些改变的发生则要晚。一旦线粒体跨膜电位崩溃，则细胞凋亡不可逆转。第44页，讲稿共99张，创作于星期二凯基细胞凋亡线粒体膜电位检测试剂盒（凯基细胞凋亡线粒体膜电位检测试剂盒（凯基细胞凋亡线粒体膜电位检测试剂盒（凯基细胞凋亡线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1JC-1）（JC-1ApoptosisDetectionKitJC-1ApoptosisDetectionKit）n n采用一种阳离子脂质荧光染料采用一种阳离子脂质荧光染料采用一种阳离子脂质荧光染料采用一种阳离子脂质荧光染料JC-1JC-1JC-1JC-1作为检测线粒体跨膜电位指示剂。作为检测线粒
26、体跨膜电位指示剂。作为检测线粒体跨膜电位指示剂。作为检测线粒体跨膜电位指示剂。n nJC-1JC-1JC-1JC-1有有有有单单单单体体体体和和和和多多多多聚聚聚聚体体体体两两两两种种种种存存存存在在在在状状状状态态态态，在在在在低低低低浓浓浓浓度度度度时时时时以以以以单单单单体体体体的的的的形形形形式式式式存存存存在在在在，高高高高浓浓浓浓度度度度时时时时以以以以多多多多聚聚聚聚体体体体形形形形式式式式存存存存在在在在，两两两两者者者者的的的的发发发发射射射射光光光光谱谱谱谱不不不不同同同同，单单单单体体体体在在在在流流流流式式式式细细细细胞胞胞胞仪仪仪仪绿绿绿绿色色色色（FL-1FL-1F
27、L-1FL-1）通通通通道道道道检检检检测测测测出出出出绿绿绿绿色色色色荧荧荧荧光光光光，多多多多聚聚聚聚体体体体在在在在流流流流式式式式细细细细胞胞胞胞仪仪仪仪红红红红色色色色（FL-2FL-2FL-2FL-2）通道检测出红色荧光。通道检测出红色荧光。通道检测出红色荧光。通道检测出红色荧光。n nJC-1JC-1JC-1JC-1可可可可透透透透过过过过正正正正常常常常细细细细胞胞胞胞膜膜膜膜以以以以单单单单体体体体状状状状态态态态聚聚聚聚集集集集胞胞胞胞内内内内，正正正正常常常常健健健健康康康康线线线线粒粒粒粒体体体体的的的的膜膜膜膜电电电电位位位位（y y y y）具具具具有有有有极极极极
28、性性性性，JC-1JC-1JC-1JC-1依依依依赖赖赖赖于于于于y y y y的的的的极极极极性性性性被被被被迅迅迅迅速速速速摄摄摄摄入入入入线线线线粒粒粒粒体体体体内内内内，并并并并因因因因浓浓浓浓度度度度增增增增高高高高而而而而在在在在线线线线粒粒粒粒体体体体内内内内形形形形成成成成多多多多聚聚聚聚体体体体，发发发发射射射射红红红红色色色色荧荧荧荧光光光光。而而而而细细细细胞胞胞胞发发发发生生生生凋凋凋凋亡亡亡亡时时时时，线线线线粒粒粒粒体体体体跨跨跨跨膜膜膜膜电电电电位位位位被被被被去去去去极极极极化化化化，JC-1JC-1JC-1JC-1从从从从线线线线粒粒粒粒体体体体内内内内释释释
29、释放放放放，红红红红光光光光强强强强度度度度减减减减弱弱弱弱，以以以以单单单单体体体体的的的的形形形形式式式式存存存存在在在在于于于于胞胞胞胞质内发绿色荧光。根椐这一特征检测线粒体膜电位的变化。质内发绿色荧光。根椐这一特征检测线粒体膜电位的变化。质内发绿色荧光。根椐这一特征检测线粒体膜电位的变化。质内发绿色荧光。根椐这一特征检测线粒体膜电位的变化。第45页，讲稿共99张，创作于星期二凋亡诱导剂诱导P388细胞凋亡，利用凯基细胞凋亡线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）进行检测，通过流式细胞仪分析分析结果。正常细胞FL-1亮,FL-2亮;R1，凋亡细胞FL-1亮,FL-2暗;R2R1R2R3R4R1
30、R2R3R4第46页，讲稿共99张，创作于星期二n早早期凋亡的检测capase3 n早期凋亡Annexin-V-FITC/PI双染法n早期凋亡线粒体细胞膜电位的检测n晚期凋亡-“TUNEL”法n晚晚期凋亡-DNA含量分析法第47页，讲稿共99张，创作于星期二原原理理n n细胞凋亡时，核酸内切酶活化，双链DNA会出现许多不对称的断裂点，即产生一系列3-OH的末端。外源性荧光标记的脱氧核苷酸末端转移酶（terminaldeoxynucleotidyltranferase,TdT）能够催化外源性荧光素或酶标记的dUTP连接到DNA的3-OH末端，用流式细胞术检测。第48页，讲稿共99张，创作于星期二
31、BrdUrdIncorporationBrdU作作为为一一种种胸胸腺腺嘧嘧啶啶核核苷苷的的类类似似物物像像胸胸腺腺嘧嘧啶啶核核苷苷一一样样可可掺掺入入到到细细胞胞合合成成的的DNA中中。当当细细胞胞处处于于DNA合合成成期期而而同同时时又又有有BrdU存存在在时时,就就会会有有BrdU掺掺入入新新合合成成的的DNA中中，只只要要细细胞胞不不消消亡亡，这这种种BrdU就就在在胞胞核核的的DNA中中长长期期存存留留。掺掺入入到到DNA的的BrdU可通过抗可通过抗BrdU单克隆抗体显示。单克隆抗体显示。该该方方法法能能对对细细胞胞周周期期进进行行迅迅速速而而稳稳定定的的测测量量,而而且且标标记记Br
32、dU的的细细胞胞只要不受到紫外线照射，对细胞本身没有功能损害。只要不受到紫外线照射，对细胞本身没有功能损害。该技术可应用到跟踪检测移植细胞的存活、分化和功能状态。该技术可应用到跟踪检测移植细胞的存活、分化和功能状态。（5-Bromo-2-deoxyUridine,5-溴脱氧尿嘧啶核苷溴脱氧尿嘧啶核苷)第49页，讲稿共99张，创作于星期二Br-dUTPn nBr-dUTP比生物素/荧光素标记的脱氧核苷酸磷酸盐复合物、地高辛更容易掺入到凋亡细胞的DNA中。因为Br-dUTP有很强的掺入能力，所以在用荧光素标记的抗BrdU单克隆抗体来检测时，会得到更好的流式细胞信号。n n未凋亡的细胞因为没有暴露的
33、3未端，所以不会被检测。第50页，讲稿共99张，创作于星期二TUNELAssay第51页，讲稿共99张，创作于星期二TUNELAssay第52页，讲稿共99张，创作于星期二n早早期凋亡的检测capase3 n早期凋亡Annexin-V-FITC/PI双染法n早期凋亡线粒体细胞膜电位的检测n晚期凋亡-“TUNEL”法n晚晚期凋亡-DNA含量分析法第53页，讲稿共99张，创作于星期二n n细细细细胞胞胞胞凋凋凋凋亡亡亡亡时时时时，细细细细胞胞胞胞核核核核，细细细细胞胞胞胞器器器器及及及及细细细细胞胞胞胞膜膜膜膜成成成成分分分分，细细细细胞胞胞胞形形形形态态态态均均均均发发发发生生生生了了了了改改改
34、改变变变变。由由由由于于于于核核核核的的的的改改改改变变变变造造造造成成成成各各各各种种种种荧荧荧荧光光光光染染染染料料料料对对对对凋凋凋凋亡亡亡亡细细细细胞胞胞胞的的的的DNADNADNADNA可可可可染染染染性性性性发发发发生生生生改改改改变变变变。其其其其原原原原理理理理为为为为在在在在凋凋凋凋亡亡亡亡过过过过程程程程中中中中，细细细细胞胞胞胞内内内内核核核核酸酸酸酸酶酶酶酶的的的的释释释释放放放放，将将将将DNADNADNADNA降降降降解解解解，分分分分解解解解成成成成小小小小的的的的片片片片段段段段，在在在在标标标标本本本本制制制制备备备备中中中中的的的的固固固固定定定定处处处处理
35、理理理时时时时，细细细细胞胞胞胞膜膜膜膜的的的的完完完完整整整整性性性性被被被被破破破破坏坏坏坏，使使使使细细细细胞胞胞胞内内内内降降降降解解解解的的的的DNADNADNADNA片片片片段段段段从从从从细细细细胞胞胞胞内内内内流流流流出出出出，造造造造成成成成总总总总体体体体DNADNADNADNA含含含含量减少，成为亚量减少，成为亚量减少，成为亚量减少，成为亚2 2 2 2倍体。倍体。倍体。倍体。第54页，讲稿共99张，创作于星期二第55页，讲稿共99张，创作于星期二细胞凋亡相关基因蛋白的流式细胞术检测细胞凋亡相关基因蛋白的流式细胞术检测（1 1）Fas/FasL(FasFas/FasL(F
36、as配配配配体体体体)：FasFas抗抗抗抗原原原原与与与与FasFas配配配配体体体体的的的的交交交交联联联联是是是是淋淋淋淋巴巴巴巴细细细细胞胞胞胞诱诱诱诱导导导导靶靶靶靶细细细细胞胞胞胞凋凋凋凋亡亡亡亡的的的的必必必必需需需需途途途途径径径径，它它它它们们们们的的的的异异异异常常常常与与与与免免免免疫疫疫疫相相相相关关关关疾疾疾疾病病病病、肿肿肿肿瘤瘤瘤瘤、移移移移植植植植排排排排斥斥斥斥、病病病病毒毒毒毒性性性性肝肝肝肝炎炎炎炎、肾肾肾肾小小小小球球球球肾肾肾肾炎炎炎炎等等等等多多多多种种种种疾疾疾疾病病病病高高高高度相关。度相关。度相关。度相关。（2 2）p53p53：p53p53是
37、是是是细细细细胞胞胞胞周周周周期期期期中中中中的的的的 检检检检查查查查点点点点 分分分分子子子子，其其其其控控控控制制制制着着着着细细细细胞胞胞胞在在在在DNADNA损损损损伤伤伤伤无无无无法法法法修修修修复复复复时时时时启启启启动动动动细细细细胞胞胞胞的的的的 自自自自杀杀杀杀 进进进进程程程程。p53p53的的的的缺缺缺缺失失失失或或或或突突突突变变变变已已已已被被被被证证证证明明明明是是是是多多多多种种种种肿肿肿肿瘤瘤瘤瘤（如如如如：乳乳乳乳腺腺腺腺癌癌癌癌、胃胃胃胃肠肠肠肠道道道道肿肿肿肿瘤瘤瘤瘤及及及及肝肝肝肝细细细细胞胞胞胞癌癌癌癌等等等等）发发发发生生生生的的的的重重重重要要要
38、要原原原原因因因因。其其其其表表表表达达达达高高高高低低低低是是是是肿肿肿肿瘤瘤瘤瘤诊诊诊诊断和预后的重要指标。断和预后的重要指标。断和预后的重要指标。断和预后的重要指标。（3 3）Bcl-2Bcl-2：Bcl-2Bcl-2是是是是细细细细胞胞胞胞凋凋凋凋亡亡亡亡的的的的抑抑抑抑制制制制蛋蛋蛋蛋白白白白，其其其其与与与与肿肿肿肿瘤瘤瘤瘤的的的的发发发发生生生生、发发发发展展展展和和和和治治治治疗疗疗疗等等等等有有有有着着着着密密密密切切切切关关关关系系系系。其其其其表表表表达达达达上上上上调调调调是是是是肿肿肿肿瘤瘤瘤瘤诊诊诊诊断断断断的指标和预后的参考。的指标和预后的参考。的指标和预后的参考
39、。的指标和预后的参考。第56页，讲稿共99张，创作于星期二第57页，讲稿共99张，创作于星期二n n多药耐药(multidrugresistance,MDR)是由一种药物诱发而同时对其它多种结构和作用机制完全不同的抗癌药物产生的交叉耐药，既对广泛的结构和功能不相同的抗肿瘤药物产生的耐药，导致某些联合化疗方案失败。肿瘤多药耐药性肿瘤多药耐药性(multidrugresistanceMDR)检测检测第58页，讲稿共99张，创作于星期二P170糖蛋白n nMDRMDR基基因因编编码码的的产产物物P P糖糖蛋蛋白白是是分分子子量量约约为为170Kda170Kda的的胞膜蛋白。胞膜蛋白。n nP P糖糖
40、蛋蛋白白具具有有一一种种能能量量依依耐耐的的跨跨膜膜药药物物外外输输泵泵功功能能，当当肿肿瘤瘤细细胞胞与与抗抗癌癌药药物物接接触触时时，脂脂溶溶性性药药物物浓浓度度梯梯度度进进入入细细胞胞，而而P P糖糖蛋蛋白白则则结结合合药药物物分分子子，同同时时其其ATPATP结结合合位位点点连连上上ATPATP，ATPATP水水解解后后释释放放能能量量将将药药物物从从胞胞内内泵泵出出胞胞外外，药药物物在在胞胞内内浓浓度度不不断断下下降降，其其细细胞胞毒毒作作用因而减弱甚至丧失，出现耐药现象。用因而减弱甚至丧失，出现耐药现象。第59页，讲稿共99张，创作于星期二肿瘤细胞肿瘤细胞ATPP170糖蛋白抗癌药物
41、抗癌药物第60页，讲稿共99张，创作于星期二用流式细胞术检测人肿瘤组织细胞多药耐药基因用流式细胞术检测人肿瘤组织细胞多药耐药基因表达产物表达产物P170n n【摘摘要要】：为为研研究究检检测测人人肿肿瘤瘤组组织织细细胞胞多多药药耐耐药药基基因因表表达达产产物物，采采 用用间间接接标标记记法法，用用鼠鼠抗抗人人单单克克隆隆抗抗体体，二二抗抗为为标标记记兔兔抗抗鼠鼠，应应用用流流式式细细胞胞仪仪检检测测了了例例新新鲜鲜实实体体肿肿瘤瘤组组织织和和一一株株多多药药耐耐药药的的细细胞胞 株株。结结果果显显示示：例例肿肿瘤瘤细细胞胞表表达达，其其阳阳性性率率为为.，例例未未检检出出表表达达，其其阴阴性性
42、率率为为；细细胞胞表表达达。在在 例例阳阳性性表表达达的的样样本本中中，有有例例阳阳性性表表达达百百分分比比低低于于；只只有有例例高高于于。提提示示大大多多数数肿肿瘤瘤组组织织细细胞胞表表达达阳阳性性率率高高，但但表表达达 肿肿瘤瘤细细胞胞表表达达百百分分比比低低。检检测测肿肿瘤瘤组组织织的的表表达达能能为为临临床床治治疗疗提提供供一一个个可可靠靠的的参参考考指标。指标。第61页，讲稿共99张，创作于星期二 Fluo-3-AmFluo-3-Am为为为为一一一一新新新新型型型型的的的的高高高高度度度度特特特特异异异异性性性性Ca2+Ca2+荧荧荧荧光光光光指指指指示示示示剂剂剂剂，可可可可以以以
43、以灵灵灵灵敏敏敏敏地地地地反反反反映映映映细细细细胞胞胞胞内内内内游游游游离离离离钙钙钙钙离离离离子子子子浓浓浓浓度度度度的的的的变变变变化化化化，Fluo-3-AmFluo-3-Am进进进进入入入入细细细细胞胞胞胞后后后后经经经经非非非非特特特特异异异异性性性性酯酯酯酯酶酶酶酶脱脱脱脱去去去去AmAm酯酯酯酯，成成成成为为为为脂脂脂脂溶溶溶溶的的的的Fluo-3Fluo-3留留留留在在在在细细细细胞胞胞胞内内内内，当当当当Fluo-3Fluo-3与与与与细细细细胞胞胞胞内内内内游游游游离离离离钙钙钙钙结结结结合合合合后后后后，其其其其荧荧荧荧光光光光强强强强度度度度是是是是Fluo-3Flu
44、o-3本本本本身身身身的的的的4040倍倍倍倍以以以以上上上上，当当当当用用用用480nm480nm波波波波长长长长激激激激发发发发时时时时，其其其其荧荧荧荧光光光光强强强强度度度度与与与与游游游游离离离离钙钙钙钙离离离离子子子子浓浓浓浓度度度度成正比。成正比。成正比。成正比。细胞内细胞内Ca2+浓度测定浓度测定第62页，讲稿共99张，创作于星期二检测淋巴细胞引起的细胞毒作用检测淋巴细胞引起的细胞毒作用细胞毒性淋巴细胞（包括细胞毒性细胞毒性淋巴细胞（包括细胞毒性T T细胞细胞CTLCTL和自然杀伤细胞和自然杀伤细胞NKCNKC）能释）能释放包含穿孔素蛋白和颗粒酶的颗粒或通过放包含穿孔素蛋白和颗
45、粒酶的颗粒或通过Fas-FasFas-Fas连接作用于靶细胞，连接作用于靶细胞，引起靶细胞内引起靶细胞内CaspaseCaspase酶激增，导致细胞死亡包括凋亡。具有重大研究和酶激增，导致细胞死亡包括凋亡。具有重大研究和应用价值。应用价值。流式细胞术测定细胞毒作用流式细胞术测定细胞毒作用(FCC)(FCC)，利用，利用CaspaseCaspase专一性荧光底物专一性荧光底物测定受害细胞的细胞毒作用强度。准确简便迅速。测定受害细胞的细胞毒作用强度。准确简便迅速。第63页，讲稿共99张，创作于星期二DNA、RNA的测定第64页，讲稿共99张，创作于星期二临床研究淋巴细胞亚群测定造血干细胞研究肿瘤相
46、关基因表达研究血小板分析白血病和淋巴瘤免疫分型HLA-B27分析PNH诊断第65页，讲稿共99张，创作于星期二淋巴细胞亚群测定淋巴细胞亚群测定n n淋巴细胞担负着免疫的主要功能。淋巴细胞亚群的测定有助于了解机体免疫状况及一些疾病的监测。n n临床经常测定的淋巴细胞亚群包括T淋巴细胞(CD3+),T辅助细胞(CD3+CD4+),T抑制细胞(CD3+CD8+),B 淋 巴 细 胞(CD19+或CD20+)，NK细胞(CD3-CD56+)等。第66页，讲稿共99张，创作于星期二(1)首先用CD3来区分全部T细胞。CD3/CD4双阳性的细胞为真正的辅助/诱导性T细胞。这些细胞主要是HIV病毒感染对象。
47、在HIV感染后，随着疾病的发展出现免疫抑制后，这群细胞会明显减少；在临床中，对HIV的监测主要依靠检测这群细胞的数量.(2)CD3-/CD4+细胞群体是由单核细胞组成的。这些细胞相对于CD4+和T细胞来说弱表达CD4，在光散射参数的位置分布也较广。CD3/CD4抗体组合能完全将CD4阳性辅助/诱导性T细胞与CD4阳性的单核细胞区分开来。因为CD4+T细胞能与单核细胞完全分离，故在光散射坐标上设淋巴细胞“门”时，“门”可设得大一些，即使包含了单核细胞或其他细胞都不会影响检测值。第67页，讲稿共99张，创作于星期二细胞表型的检测细胞表型的检测淋巴淋巴20-25%:20-25%:T:70%,B:T:
48、70%,B:20%,NK:10%;20%,NK:10%;单核单核2-6%2-6%粒细胞粒细胞:40-60%:40-60%第68页，讲稿共99张，创作于星期二淋巴细胞亚群分析淋巴细胞亚群分析n n淋淋巴巴细细胞胞是是免免疫疫系系统统中中执执行行免免疫疫功功能能的的重重要要细细胞胞，各各种种白白细细胞胞分分化化抗抗原原（CDCD）分分子子广广泛泛分分布布在在T T细细胞胞、B B细细胞胞、自自然然杀杀伤伤细细胞胞等等免免疫疫细细胞胞。免免疫疫细细胞胞表表面面标标志志改改变变与与细细胞胞的的活活化化和和功功能能的的改改变变有有着着密密切切关关系系，不不同同类类型型免免疫疫细细胞胞间间的的比比例例也也
49、对对机机体体免免疫疫功功能能具具有有重重要要的的影影响响，而而这这些些变化与临床疾病的病理变化密切相关。变化与临床疾病的病理变化密切相关。第69页，讲稿共99张，创作于星期二PeripheralWhiteBloodCellsPeripheralWhiteBloodCellsCD45+CD45+GranulocytesGranulocytesMonocytesMonocytesEosinophilsEosinophilsBasophilsBasophilsNeutrophilsNeutrophilsLymphocytesLymphocytesT TB BNKNKTTHelperHelperT T
50、CytotoxicCytotoxicCD3CD3+CD4CD4+CD3CD3+CD8CD8+CD3CD3+CD3CD3-CD19CD19+HLA-DRHLA-DR+CD3CD3-CD16CD16+CD56CD56+MonocytesMonocytes第70页，讲稿共99张，创作于星期二AdhesionMetabolic第71页，讲稿共99张，创作于星期二第72页，讲稿共99张，创作于星期二第73页，讲稿共99张，创作于星期二 T淋巴细胞T淋巴细胞检测淋巴细胞检测淋巴细胞第74页，讲稿共99张，创作于星期二1、Th 细胞细胞：CD3+CD4+CD8-T细胞，能辅助细胞，能辅助B细细胞分化成熟胞分