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1、关于流式细胞仪的原理与应用PPT第1页，讲稿共38张，创作于星期二一一 简简 介介 流式细胞仪(Flow Cytometer):是集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术、细胞荧光化学技术以及单克隆抗体技术为一体的高科技细胞分析仪。流式细胞术(Flow Cytometry，FCM):利用流式细胞仪对处于快速直线流动状态中的细胞或亚细胞结构进行多参数、快速的定量分析和分选的技术。第2页，讲稿共38张，创作于星期二流式细胞仪的特点流式细胞仪的特点单个细胞或微粒分析同时多参数分析速度快：10000个细胞(微粒)/秒统计学意义：提供细胞群体的均值和分布情况分选感兴趣的细胞或微粒第3页，讲稿共
2、38张，创作于星期二举例：细胞周期分布检测第4页，讲稿共38张，创作于星期二流路 (液流系统）流动室 鞘液SHEATH 样本流SAMPLE 单细胞悬液5*1051*106个/ml光路（光学系统）光源滤片电路（检测系统）光电倍增管PMT放大电路HV及GAIN 增益A/D转换统计（分析系统）计算机二二 构造及工作原理构造及工作原理第5页，讲稿共38张，创作于星期二 流动室是仪器核心部件，被测样品在此与激光相交。流动室是仪器核心部件，被测样品在此与激光相交。流动室由石英玻璃钢制成，并在石英玻璃中央开一个孔流动室由石英玻璃钢制成，并在石英玻璃中央开一个孔径为径为430m180m的长方形孔，供细胞单个流
3、过，检测的长方形孔，供细胞单个流过，检测区在该孔的中心，这种流动室的光学特性良好，流速较区在该孔的中心，这种流动室的光学特性良好，流速较慢，因而细胞受照时间长，可收集的细胞信号光通量大，慢，因而细胞受照时间长，可收集的细胞信号光通量大，配上广角收集透镜，可获得很高的检测灵敏度和测量精配上广角收集透镜，可获得很高的检测灵敏度和测量精度。度。液流系统第6页，讲稿共38张，创作于星期二流动室流动室Injector TipFluorescencesignalsFocused laserbeamSheath fluid液流系统第7页，讲稿共38张，创作于星期二 激光光源：目前台式机激光光源：目前台式机F
4、CM，大多采用氩离子，大多采用氩离子气体激光器。激光气体激光器。激光(laser)是是种相干光源，种相干光源，它它能提供单波长、高强度及稳定性高的光照，能提供单波长、高强度及稳定性高的光照，是细胞微弱荧光快速分析的理想光源。由于是细胞微弱荧光快速分析的理想光源。由于细胞快速流动，每个细胞经过光照区的时间细胞快速流动，每个细胞经过光照区的时间仅为仅为1s左右，每个细胞所携带荧光物质被左右，每个细胞所携带荧光物质被激发出的荧光信号强弱，与被照射的时间和激发出的荧光信号强弱，与被照射的时间和激发光的强度有关，因此细胞需要足够的光激发光的强度有关，因此细胞需要足够的光照强度。照强度。光学系统第8页，讲
5、稿共38张，创作于星期二信信 号号散射光信号 FS 细胞大小 SS 细胞颗粒性荧光信号 FL1 FITCFL1 FITC FL2 PEFL2 PE FL3 ECDFL3 ECD FL4 PC5FL4 PC5光学系统第9页，讲稿共38张，创作于星期二散射光信号 细胞大小及颗粒性FSSS光学系统第10页，讲稿共38张，创作于星期二光路 （滤片特性）光学系统第11页，讲稿共38张，创作于星期二流式细胞仪光路图流式细胞仪光路图Air-cooled Argon Ion LaserBeam Shaping LensesHigh SensitivityQuartz Flow CellForward Scat
6、terDetectorSide ScatterDetector525BP FL1(FITC)575BP FL2(PE)620BP FL3(ECD)675BP FL4(PC5)488DL488BK550DL600DL645DL光学系统第12页，讲稿共38张，创作于星期二电路 电压调节光电倍增管光电倍增管电压电压 volts volts增益增益 Gain Gain信号放大方式信号放大方式检测系统第13页，讲稿共38张，创作于星期二电信号输入到放大器放大，放大器分两类：线性放大和对数放大。细胞DNA含量、RNA含量等的测量一般选用线性放大测量。在细胞膜表面抗原等的检测时，细胞膜表面抗原的分布有时要相
7、差几十倍，甚至几万倍，通常使用对数放大器。检测系统第14页，讲稿共38张，创作于星期二常用荧光染料介绍FITC：绿色 525nmPE：橙黄色 575nmECD：橙红色 610nmPECY5：深红色 675nmPerCP：深红色 675nmPECY7：深红色 755nm7AAD：深红色 675nmPI(碘化丙啶）：橙红色 620nm488nm波长的氩离子激光激发第15页，讲稿共38张，创作于星期二光路补偿光路补偿FITCFITC/PEPE/ECDECD/PC5PC5第16页，讲稿共38张，创作于星期二三三 FCM的数据分析的数据分析1.单参数一维直方图 纵坐标表示细胞数，横坐标表示相对荧光信号或
8、散色光信号值，单位是道数。第17页，讲稿共38张，创作于星期二2.双参数二维点图显示来自同一细胞的两个参数与细胞数量间的关系。横、纵坐标分别表示两个参数的相对含量。通过分别计算两坐标所表示参数的阳性率来得到实验结果。第18页，讲稿共38张，创作于星期二3.等高线图 4.密度图第19页，讲稿共38张，创作于星期二白血病免疫分型白血病免疫分型HLA-B27:强直性脊柱炎强直性脊柱炎淋巴细胞亚群淋巴细胞亚群造血干细胞计数：造血干细胞移植造血干细胞计数：造血干细胞移植网织红细胞网织红细胞PNH诊断（诊断（CD55、CD59）血小板活化试验血小板活化试验1 流式细胞术的临床应用流式细胞术的临床应用四四
9、FCM的应用的应用第20页，讲稿共38张，创作于星期二细胞大小细胞大小细胞的颗粒度细胞的颗粒度细胞表面分子：细胞表面分子：CD 系列系列细胞浆内分子：胞内细胞因子细胞浆内分子：胞内细胞因子细胞核内分子：细胞核内分子：P53细胞功能检测：细胞周期、凋亡细胞功能检测：细胞周期、凋亡2 流式细胞术的科研应用流式细胞术的科研应用第21页，讲稿共38张，创作于星期二 荧光信号的定量可以用 平均荧光强度（mean值），荧光信号面积（Area，A）来表示。1）蛋白表达的检测第22页，讲稿共38张，创作于星期二2 2）DNA AnalysisDNA AnalysisPIEthidium BromideAcri
10、dine OrangeDAPI(UV excitable)Hoechst 33342(viable,UV excitable)不能主动进入细胞，需要固定打孔488nm激发为脂溶性，主动进入细胞UV激发常用的常用的DNA 染料染料第23页，讲稿共38张，创作于星期二0 200 400 600 8001000G0G1sG2MDNA AnalysisDNA AnalysisCount2 2N N4 4N NG2MG0G1s第24页，讲稿共38张，创作于星期二0 200 400 600 8001000PI Fluorescence2N4NDNA AnalysisDNA Analysis第25页，讲稿共
11、38张，创作于星期二3）Apoptosis 检测检测第26页，讲稿共38张，创作于星期二A）DNA片断化检测片断化检测细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩,染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂,形成50300kbp长的DNA大片段,或180200bp整数倍的寡核苷酸片段 第27页，讲稿共38张，创作于星期二B）Caspase-3活性的检测活性的检测 Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。第28页，讲稿共38张，创作于星期二C）Annexin V Assay磷脂酰丝氨酸（Phosphat
12、idylserine,PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中,Annexin-V是一种分子量为3536KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合 第29页，讲稿共38张，创作于星期二Annexin V Assay能够区分死亡与凋亡能够区分死亡与凋亡第30页，讲稿共38张，创作于星期二D）TUNEL 细胞凋亡中,染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3-末端，从
13、而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling,TUNEL）第31页，讲稿共38张，创作于星期二五 实例第32页，讲稿共38张，创作于星期二细胞周期检测第33页，讲稿共38张，创作于星期二第34页，讲稿共38张，创作于星期二ABCDGFP融合基因的细胞周期检测第35页，讲稿共38张，创作于星期二蛋白表达的检测第36页，讲稿共38张，创作于星期二凋亡检测(Annexin V/PI双染）第37页，讲稿共38张，创作于星期二感谢大家观看第38页，讲稿共38张，创作于星期二