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1、关于细胞工程与作物育种第1页，讲稿共52张，创作于星期二第2页，讲稿共52张，创作于星期二第3页，讲稿共52张，创作于星期二第4页，讲稿共52张，创作于星期二一、细胞工程概述一、细胞工程概述（一）细胞工程的定义：（一）细胞工程的定义：以细胞为基本单位，在以细胞为基本单位，在离体条件下进行培养、繁殖离体条件下进行培养、繁殖或或按照人们的意愿改造细胞按照人们的意愿改造细胞的某些生物学特性，以的某些生物学特性，以改良作物品种和创造新种质，改良作物品种和创造新种质，或或加速繁育植物群体或获得其它加速繁育植物群体或获得其它有经济价值的生物产品有经济价值的生物产品的过程的过程。第5页，讲稿共52张，创作于
2、星期二（二）主要内容：二）主要内容：是现代生物技术的重要组成部分。包是现代生物技术的重要组成部分。包括：括：n植物组织培养植物组织培养n植物细胞培养植物细胞培养n花药及花粉培养花药及花粉培养n离体胚培养离体胚培养n原生质体培养原生质体培养n细胞器移植细胞器移植 等等。等等。每一种都还可以继续细分为不同小类。每一种都还可以继续细分为不同小类。第6页，讲稿共52张，创作于星期二 以上内容可归为两部分以上内容可归为两部分n上游工程：上游工程：细胞培养、细胞遗传转化体系建立。细胞培养、细胞遗传转化体系建立。n下游工程：下游工程：细胞工程实践应用。细胞工程实践应用。（三）理论基础（三）理论基础 植物细胞
3、全能性（植物细胞全能性（cell Totipotency）:每个植物细胞每个植物细胞具有发育成为完整植株的潜能。具有发育成为完整植株的潜能。第7页，讲稿共52张，创作于星期二（四）育种应用（四）育种应用1、微体快繁微体快繁n植植物物组组织织（块块）人人工工培培养养再生成苗再生成苗 大量繁殖。大量繁殖。n营营养养植植物物、经经济济作作物物，如如花花卉卉、香蕉、咖啡、香蕉、咖啡、中药材品种快繁。中药材品种快繁。荷兰、以色列荷兰、以色列 ：花卉：花卉第8页，讲稿共52张，创作于星期二第9页，讲稿共52张，创作于星期二第10页，讲稿共52张，创作于星期二2、脱毒、脱毒n染染病病毒毒植植物物中中，茎茎尖
4、尖分分生生组组织织病病毒毒的分布最少或没有。的分布最少或没有。n草草莓莓 、香香蕉蕉、甘甘薯薯、马马铃铃薯薯等等6060多种作物。多种作物。脱毒草莓脱毒草莓第11页，讲稿共52张，创作于星期二3、细胞融合（体细胞杂交）、细胞融合（体细胞杂交）n克服不同物种有性杂交困难克服不同物种有性杂交困难n马马铃铃薯薯与与番番茄茄的的细细胞胞融融合合成成功功获得植株获得植株.n2个个 抗抗 病病 毒毒 马马 铃铃 薯薯 野野 生生 种种（2n=2x=24)，不不能能有有性性杂杂交交，通通过过细细胞胞融融合合，获获得得抗抗病病毒毒马马铃铃薯薯（2n=4x=48)。第12页，讲稿共52张，创作于星期二第13页，
5、讲稿共52张，创作于星期二4、体细胞无性系变异筛选、体细胞无性系变异筛选基础：基础：生物个体生长发育过程中，体细胞基因突变和生物个体生长发育过程中，体细胞基因突变和 染色体重组产生体细胞变异染色体重组产生体细胞变异方法：方法：有利的体细胞变异有利的体细胞变异（定向）筛选（定向）筛选 培养成苗培养成苗培育优良品种培育优良品种应用：应用：日本粳稻品种日本粳稻品种胚培养胚培养早熟、早熟、优质、高优质、高 产的产的 粳稻品种在东北大积推广应用。粳稻品种在东北大积推广应用。水稻幼胚水稻幼胚毒素培养基（含病原菌的粗毒素）毒素培养基（含病原菌的粗毒素）愈伤组织化成苗愈伤组织化成苗经过抗性鉴定经过抗性鉴定 抗
6、稻瘟病品系抗稻瘟病品系 第14页，讲稿共52张，创作于星期二5、胚拯救、胚拯救n远远缘缘杂杂交交早早期期胚胚胎胎发发育育到到一一定定时时间间就就停停止止发育、死亡、夭折。发育、死亡、夭折。n远远缘缘杂杂种种幼幼胚胚离离体体组组织织培培养养发发育育正正常植株。常植株。第15页，讲稿共52张，创作于星期二6、花药（花粉）培养、花药（花粉）培养v解决了杂交后代分离，遗传纯合稳定慢，育种周期长。解决了杂交后代分离，遗传纯合稳定慢，育种周期长。v花粉（花药）花粉（花药）单倍体（单倍体（n）二倍体二倍体(2n)。遗传迅速纯合，育种周期极大缩短。遗传迅速纯合，育种周期极大缩短。q Hs-1、Hs-2、Hs-
7、3系列光敏不育系；花系列光敏不育系；花1A。q培矮培矮64s花培纯化，解决育性转换临界温度漂移。花培纯化，解决育性转换临界温度漂移。qq十字花科蔬菜的自交不亲和系培育。十字花科蔬菜的自交不亲和系培育。十字花科蔬菜的自交不亲和系培育。十字花科蔬菜的自交不亲和系培育。q“中花中花8 8号号”水稻，水稻，“京花京花3 3号号”小麦，等小麦，等第16页，讲稿共52张，创作于星期二花椰菜、抱子甘蓝花药培养，快速培育自交不亲和系花椰菜、抱子甘蓝花药培养，快速培育自交不亲和系第17页，讲稿共52张，创作于星期二第18页，讲稿共52张，创作于星期二7、创制人工种子、创制人工种子人工种皮人工种皮+胚状体（不胚状
8、体（不定芽、顶芽、腋芽）定芽、顶芽、腋芽）8、种质试管保存、种质试管保存9、转基因受体、转基因受体第19页，讲稿共52张，创作于星期二转转40页页第20页，讲稿共52张，创作于星期二二、植物离体培养技术二、植物离体培养技术（一）概念（一）概念1、植物离体培养、植物离体培养（In vitro culture）植物外植体在无菌条件下进行人工培养，并使之发育成完植物外植体在无菌条件下进行人工培养，并使之发育成完整植株的技术总称，也称植物组织培养（整植株的技术总称，也称植物组织培养（Plant tissue culture）。）。2、外植体、外植体（explant）从植物体分离下来进行培养的器官、组织
9、或细胞从植物体分离下来进行培养的器官、组织或细胞等。等。第21页，讲稿共52张，创作于星期二3、初代培养、初代培养（Primary culture）指外植体的最初培养。指外植体的最初培养。4、继代培养、继代培养（Subculture）将初代培养得到的培养体移植于新鲜培养基中再培养将初代培养得到的培养体移植于新鲜培养基中再培养（一次或多次移植培养）。（一次或多次移植培养）。第22页，讲稿共52张，创作于星期二n洗涤室洗涤室n灭菌室灭菌室n配制室配制室n无菌操作室无菌操作室n培养室（暗、光）培养室（暗、光）（二）实验室基本设施（二）实验室基本设施第23页，讲稿共52张，创作于星期二组培实验室：组培
10、实验室：要求无菌条件要求无菌条件第24页，讲稿共52张，创作于星期二第25页，讲稿共52张，创作于星期二(三三)培养条件培养条件1、培养基、培养基（1）种类：）种类：固体培养基固体培养基液体培养基液体培养基（2）基本培养基）基本培养基MS、B5、White、N6等等 P237 表表15-1第26页，讲稿共52张，创作于星期二MS:Murashige&Skoog第27页，讲稿共52张，创作于星期二（3）培养基的成分）培养基的成分n无机营养：无机营养：大量元素：大量元素：N、P、K、S、Ca、Mg 微量元素：微量元素：Fe、Mn、Cu等等n有机营养：有机营养：碳源：碳源：蔗糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖
11、蔗糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖 氮源：氮源：氨基酸类、酰胺类氨基酸类、酰胺类 活性物质：活性物质：烟酸、肌醇、生物素等烟酸、肌醇、生物素等n植物激素：植物激素：生长素类：生长素类：IAA、NAA、IBA等等 细胞分裂素类：细胞分裂素类：激动素、玉米素等激动素、玉米素等 其它：其它：赤霉素、脱落酸、乙烯赤霉素、脱落酸、乙烯n 附加物：附加物：琼脂、椰乳、水解蛋白等琼脂、椰乳、水解蛋白等第28页，讲稿共52张，创作于星期二十字花科花药培养的培养基成分十字花科花药培养的培养基成分第29页，讲稿共52张，创作于星期二2、无菌操作、无菌操作（1）污染源）污染源培养基及玻璃器皿培养基及玻璃器皿无菌操作室、器械
12、无菌操作室、器械外植体外植体（2）消毒）消毒器皿消毒器皿消毒材料（外植体）消毒材料（外植体）消毒第30页，讲稿共52张，创作于星期二外植体外植体消毒消毒外植体常用消毒剂的种类、浓度、及效果外植体常用消毒剂的种类、浓度、及效果第31页，讲稿共52张，创作于星期二第32页，讲稿共52张，创作于星期二n培养基灭菌培养基灭菌n高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌n过滤灭菌过滤灭菌n接种过程消毒接种过程消毒n接种室（无菌操作室）的灭菌接种室（无菌操作室）的灭菌n接种台的灭菌接种台的灭菌n工作人员工作人员第33页，讲稿共52张，创作于星期二3、培养条件、培养条件v光照：白色荧光灯，光强光照：白色荧光灯，光强10005
13、000Lx，1216hr，用，用自动定时器控制光照时间自动定时器控制光照时间v温度：多为温度：多为252v湿度：湿度：v容器内湿度：容器内湿度：100%v环境湿度：要求环境湿度：要求70%80%第34页，讲稿共52张，创作于星期二4、基本过程、基本过程 外植体取材（已分化的器官、组织、细胞等）外植体取材（已分化的器官、组织、细胞等）外植体消毒灭菌，接种到相应的脱分化培养基外植体消毒灭菌，接种到相应的脱分化培养基 （脱分化）（脱分化）愈伤组织或胚状体愈伤组织或胚状体 接种到分化培养基接种到分化培养基 （再分化）（再分化）分化芽、根，完整植株分化芽、根，完整植株 练苗，移栽大田练苗，移栽大田第35
14、页，讲稿共52张，创作于星期二胚状体胚状体愈伤组织愈伤组织第36页，讲稿共52张，创作于星期二水稻花药培养过程水稻花药培养过程第37页，讲稿共52张，创作于星期二第38页，讲稿共52张，创作于星期二影响花药及花粉培养的因素影响花药及花粉培养的因素4供体植株的基因型供体植株的基因型4培养基（基本培养基、附加物，如水稻、小麦用培养基（基本培养基、附加物，如水稻、小麦用N6）4小孢子发育阶段小孢子发育阶段合适发育期的花药，离体培养才能启动花粉发育。实践表合适发育期的花药，离体培养才能启动花粉发育。实践表明，从减数分裂期至双核期的花药，均有可能诱导离体孤雄发明，从减数分裂期至双核期的花药，均有可能诱导
15、离体孤雄发育。育。大多数园艺植物的花药培养，成功率最高的时期为单大多数园艺植物的花药培养，成功率最高的时期为单核期，或单核中晚期。核期，或单核中晚期。4供体植株的生理状态及培养前预处理供体植株的生理状态及培养前预处理第39页，讲稿共52张，创作于星期二三、原生质体培养与体细胞杂交三、原生质体培养与体细胞杂交n植物原生质体：植物原生质体：除去细胞壁的由质膜包裹着的具除去细胞壁的由质膜包裹着的具有生活力的裸细胞。有生活力的裸细胞。n原生质体融合：原生质体融合：也称体细胞杂交，使不同原生质也称体细胞杂交，使不同原生质体相互融合形成杂种细胞，再经过人工培养诱导体相互融合形成杂种细胞，再经过人工培养诱导
16、杂种细胞分化形成植株的过程。杂种细胞分化形成植株的过程。第40页，讲稿共52张，创作于星期二第41页，讲稿共52张，创作于星期二（一）基本步骤（一）基本步骤v原生质体分离原生质体分离v原生质体培养原生质体培养v原生质体融合原生质体融合v融合体的发育及杂种细胞融合体的发育及杂种细胞的筛选的筛选v体细胞杂种植株的再生及鉴体细胞杂种植株的再生及鉴定定P254，图，图15-9第42页，讲稿共52张，创作于星期二（二）原生质体分离（二）原生质体分离4分离原生质体的材料分离原生质体的材料 叶肉组织，无菌苗的子叶，愈伤组织及悬浮细胞。叶肉组织，无菌苗的子叶，愈伤组织及悬浮细胞。4分离植物原生质体所需的酶分离
17、植物原生质体所需的酶 果胶酶、纤维素酶果胶酶、纤维素酶4原生质体分离步骤原生质体分离步骤一步法：一步法：果胶酶和纤维素酶混合处理材料果胶酶和纤维素酶混合处理材料二步法：二步法：用果胶酶降解细胞间层使细胞分离；再用纤维素酶用果胶酶降解细胞间层使细胞分离；再用纤维素酶水解细胞壁释放原生质体。水解细胞壁释放原生质体。第43页，讲稿共52张，创作于星期二第44页，讲稿共52张，创作于星期二 酶解后，用酶解后，用200目目筛过滤，滤液再用筛过滤，滤液再用400目筛过滤，滤液经低目筛过滤，滤液经低速离心，去上清液后，速离心，去上清液后，即为纯化原生质体。即为纯化原生质体。纯化后的原生质体纯化后的原生质体第
18、45页，讲稿共52张，创作于星期二（三）原生质体培养（三）原生质体培养4液体浅层培养液体浅层培养4固、固、液培养液培养4固体包埋培养固体包埋培养注意几点：注意几点：q原生质体培养之前必须调到一定的密度（细胞密度），原生质体培养之前必须调到一定的密度（细胞密度），一般以一般以103105（104108）个细胞）个细胞/ml。密度太低原生质体。密度太低原生质体不能分裂。不能分裂。q在培养过程中，根据细胞生长情况不断降低渗透压，以促进分在培养过程中，根据细胞生长情况不断降低渗透压，以促进分裂。裂。第46页，讲稿共52张，创作于星期二q一般在暗条件下培养直到一般在暗条件下培养直到愈伤组织形成愈伤组织形
19、成。暗条件有利于细胞暗条件有利于细胞壁形成和细胞再生。壁形成和细胞再生。q愈伤组织形成后，可转移到普通培养基上进行细胞繁殖和分愈伤组织形成后，可转移到普通培养基上进行细胞繁殖和分化。化。q培养效果可用培养效果可用植板率来衡量。植板率来衡量。植板率：植板率：每个平板接种细胞总数中形成每个平板接种细胞总数中形成愈伤愈伤的百分率。的百分率。即：每平板愈伤数即：每平板愈伤数/每平板接种的细胞总数每平板接种的细胞总数 100%。每平板接种的细胞总数每平板接种的细胞总数=每每ml培养液中细胞数培养液中细胞数该平板细胞培该平板细胞培养液养液ml数。数。第47页，讲稿共52张，创作于星期二（四）原生质体融合（
20、四）原生质体融合1、融合过程、融合过程 异种原生质体发生膜接触异种原生质体发生膜接触形成细胞质桥形成细胞质桥两种细胞两种细胞质将两个核包围，完成融合。质将两个核包围，完成融合。2、融合体类型、融合体类型对称杂种：综合双亲全部遗传物质的融合体对称杂种：综合双亲全部遗传物质的融合体非对称杂种：部分遗传物质发生丢失的融合体非对称杂种：部分遗传物质发生丢失的融合体胞质杂种：双亲胞质胞质杂种：双亲胞质+单亲细胞核单亲细胞核非杂种：单亲的原生质体融合。非杂种：单亲的原生质体融合。第48页，讲稿共52张，创作于星期二3、融合方法、融合方法 原生质体不带电荷，它们相互排斥，需通过诱发才能发生融原生质体不带电荷
21、，它们相互排斥，需通过诱发才能发生融合。合。（1）NaNO3处理：最早使用的融合诱发剂。融合频率低，对叶肉处理：最早使用的融合诱发剂。融合频率低，对叶肉（高度液胞化）的原生质体有害。（高度液胞化）的原生质体有害。（2）高）高Ca2+（0.05MCaCl2）+高高pH(10.5)+高温（高温（37C）处理：）处理：融合速度快，但频率不高。融合速度快，但频率不高。（3）聚乙二醇（）聚乙二醇（PEG）处理：）处理：25-50%PEG处理效果好。处理效果好。（4）电融合）电融合:微电流，短时间电激。微电流，短时间电激。第49页，讲稿共52张，创作于星期二（五）杂种细胞筛选与杂种鉴定（五）杂种细胞筛选与杂种鉴定1、杂种细胞筛选杂种细胞筛选 p256n形态互补法形态互补法n遗传互补法遗传互补法n代谢互补法代谢互补法n生长互补法生长互补法n荧光染色法荧光染色法2、杂种鉴定、杂种鉴定 经杂种细胞筛选获得的再生植株不一定是所需的杂种植株，还可能经杂种细胞筛选获得的再生植株不一定是所需的杂种植株，还可能出现混倍体。出现混倍体。n形态鉴定形态鉴定n细胞学鉴定（染色体数目）细胞学鉴定（染色体数目）n流式细胞仪鉴定流式细胞仪鉴定n分子标记法分子标记法第50页，讲稿共52张，创作于星期二第51页，讲稿共52张，创作于星期二感谢大家观看第52页，讲稿共52张，创作于星期二