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1、关于细胞工程与基因工关于细胞工程与基因工关于细胞工程与基因工关于细胞工程与基因工程程程程第1页，讲稿共38张，创作于星期二B C A 生物工程的技术体系细胞工程的基本原理细胞工程的基本原理基因工程的基本原理基因工程的基本原理细胞工程与基因工程第2页，讲稿共38张，创作于星期二酶酶生物活性分子生物活性分子天然细胞天然细胞天然细胞天然细胞干细胞干细胞工程干细胞工程干细胞工程细胞工程细胞组织器官个体组织器官个体组织工程组织工程组织器官个体组织器官个体生物活性分子生物活性分子发酵工程发酵工程细胞工程细胞工程代谢工程代谢工程分离工程分离工程分离工程分离工程酶工程酶工程采集破碎采集破碎蛋白质工程蛋白质工程
2、途径工程途径工程基因工程基因工程生物工程的技术体系生物工程的技术体系细胞工程细胞工程分离工程分离工程分离工程分离工程第3页，讲稿共38张，创作于星期二细胞工程的基本原理细胞工程的基本原理 细胞工程细胞工程是指通过是指通过组织、细胞、细胞器组织、细胞、细胞器水平上的筛选和改造，获得具有商业水平上的筛选和改造，获得具有商业价值的价值的人造组织（器官）、工程细胞株或细胞系，人造组织（器官）、工程细胞株或细胞系，再通过规模化培养，制备特殊再通过规模化培养，制备特殊产品的技术和过程。细胞工程包括：产品的技术和过程。细胞工程包括：动植物细胞及组织大规模培养技术动植物细胞及组织大规模培养技术动植物细胞融合技
3、术动植物细胞融合技术动植物细胞重组技术动植物细胞重组技术干细胞技术（组织或器官再生技术，即组织工程）干细胞技术（组织或器官再生技术，即组织工程）第4页，讲稿共38张，创作于星期二植物细胞和组织的大规模培养技术植物细胞和组织的大规模培养技术基本原理：植物细胞的分化全能性基本原理：植物细胞的分化全能性第5页，讲稿共38张，创作于星期二动物细胞的大动物细胞的大规模培养技术规模培养技术基本原理：基本原理：动物细胞的动物细胞的接触抑制性接触抑制性第6页，讲稿共38张，创作于星期二动植物细胞融合技术动植物细胞融合技术将两种不同性状的细胞在促融剂的将两种不同性状的细胞在促融剂的帮助下融合在一起，并从中筛选出
4、帮助下融合在一起，并从中筛选出具有优异性能的杂合细胞。具有优异性能的杂合细胞。例如，例如，B B淋巴细胞具有合成特异性淋巴细胞具有合成特异性抗体的性状，骨髓瘤细胞具有生抗体的性状，骨髓瘤细胞具有生长迅速的性状。将两者融合，就长迅速的性状。将两者融合，就能筛选到集两者优点的杂合细能筛选到集两者优点的杂合细胞，即胞，即单克隆抗体技术单克隆抗体技术。第7页，讲稿共38张，创作于星期二细胞重组是把不同种类的细胞的部件细胞重组是把不同种类的细胞的部件重新组合装配，包括重新组合装配，包括细胞核细胞核移植、移植、叶叶绿体绿体移植、移植、核糖体核糖体重建及重建及线粒体线粒体装装配等，由此获得具有优良性能的重配
5、等，由此获得具有优良性能的重组细胞株或细胞系组细胞株或细胞系动植物细胞重组技术动植物细胞重组技术第8页，讲稿共38张，创作于星期二经 历经 历277277次 乳次 乳腺细胞核的移腺细胞核的移植实验；获得植实验；获得2929个发育为八个发育为八细胞胚；使用细胞胚；使用1313头代孕母亲；头代孕母亲；生出多莉生出多莉动植物细胞重组技术动植物细胞重组技术第9页，讲稿共38张，创作于星期二骨髓多能干细胞骨髓多能干细胞骨髓细胞骨髓细胞淋巴细胞淋巴细胞网状细胞网状细胞红细胞红细胞巨核细胞巨核细胞血小板血小板单核细胞单核细胞巨噬细胞巨噬细胞嗜中酸碱性粒细胞嗜中酸碱性粒细胞BB、T T 淋巴细胞淋巴细胞干细胞
6、技术（组织或器官再生技术）干细胞技术（组织或器官再生技术）第10页，讲稿共38张，创作于星期二基因工程的基本原理基因工程的基本原理切切接接转转增增检检第11页，讲稿共38张，创作于星期二DNA的体外重组：切与接用限制性核酸内切酶切割用限制性核酸内切酶切割DNADNA分子分子识别识别双链双链DNADNA分子中分子中4-84-8对碱基的特定序列对碱基的特定序列大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧识别切割序列呈典型的旋转对称型识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构回文结构5 5 G C T G C T G A A T T CG A A T T C G A G
7、3 G A G 33 3 C G A C G A C T T A A GC T T A A G C T C 5 C T C 5EcoRI EcoRI 的识别序列的识别序列EcoRI EcoRI 的切割位点的切割位点第12页，讲稿共38张，创作于星期二EcoRI EcoRI 等产生的等产生的 5 5 粘性末端粘性末端5 5 GG-C C-T T-GG-A A-A A-T T-T T-C C-GG-A A-G 3G 33 3 C C-GG-A A-C C-T T-T T-A A-A A-GG-C C-T T-C 5C 5EcoRI 37 EcoRI 37 5 5 GG-C C-T T-GG-OHO
8、H PP-A A-A A-T T-T T-C C-GG-A A-G 3G 33 3 C C-GG-A A-C C-T T-T T-A A-A A-PP OHOH-GG-C C-T T-C 5 C 5 退火退火 4-7 4-7 5 5 GG-CC-T T-GG AA-AA-T T-T T-CC-GG-AA-G 3G 33 3 CC-GG-AA-CC-T T-T T-AA-AA GG-CC-T T-C 5C 5OHOHPPOHOHPP第13页，讲稿共38张，创作于星期二PstI PstI 等产生的等产生的 3 3 粘性末端粘性末端5 5 GG-CC-T T-CC-T T-GG-CC-AA-GG-G
9、G-AA-G 3G 33 3 CC-GG-AA-GG-AA-CC-GG-T T-CC-CC-T T-C 5C 5PstI 37 PstI 37 5 5 GG-CC-T T-CC-T T-GG-CC-AA-OHOH PP-GG-GG-AA-G 3G 33 3 CC-GG-AA-GG-PP OHOH-AA-CC-GG-T T-CC-CC-T T-C 5 C 5 退火退火 4-7 4-7 5 5 GG-CC-T T-CC-T T-GG-CC-AA GG-GG-AA-G 3G 33 3 CC-GG-AA-GG AA-CC-GG-T T-CC-CC-T T-C 5C 5OHOHPPOHOHPP第14页，
10、讲稿共38张，创作于星期二PvuII PvuII 等产生的平头末端等产生的平头末端5 5 GG-CC-T T-CC-AA-GG-CC-T T-GG-GG-AA-G 3G 33 3 CC-GG-AA-GG-T T-CC-GG-AA-CC-CC-T T-C 5C 5PvuII 37 PvuII 37 5 5 GG-C C-T T-C C-A A-GG-OHOH PP-C C-T T-GG-GG-A A-G 3G 33 3 C C-GG-A A-GG-T T-C C-PP OHOH-GG-A A-C C-C C-T T-C 5 C 5 第15页，讲稿共38张，创作于星期二DNA的体外重组：切与接用用
11、T4-DNAT4-DNA连接酶连接连接酶连接DNADNA分子分子修复双链修复双链DNADNA上缺口处的磷酸二酯键上缺口处的磷酸二酯键T4-DNAT4-DNA连接酶连接酶5 5 GG-CC-T T-CC-T T-GG-CC-AA GG-GG-AA-G 3G 33 3 CC-GG-AA-GG AA-CC-GG-T T-CC-CC-T T-C 5C 5OHOHPPOHOHPP5 5 GG-CC-T T-CC-T T-GG-CC-AA-GG-GG-AA-G 3G 33 3 CC-GG-AA-GG-AA-CC-GG-T T-CC-CC-T T-C 5C 5nicknicknicknick第16页，讲稿共
12、38张，创作于星期二DNA的体外重组：切与接用用T4-DNAT4-DNA连接酶连接连接酶连接DNADNA分子分子连接多个平头双链连接多个平头双链DNADNA分子分子5 5 GG-CC-T T-CC-AA-GG-CC-T T-GG-GG-AA-GG 333 3 CC-GG-AA-GG-T T-CC-GG-AA-CC-CC-T T-CC 5 55 5 GG-C C-T T-C C-A A-GG-OHOH PP-C C-T T-GG-GG-A A-GG 333 3 C C-GG-A A-GG-T T-C C-PP OHOH-GG-A A-C C-C C-T T-C C 5 5 T4-DNAT4-DN
13、A连接酶连接酶第17页，讲稿共38张，创作于星期二同种内切酶生产的粘性末端的连接同种内切酶生产的粘性末端的连接5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRIEcoRI5GCTTAAAATTCG5 5 GCTTAA 55 AATTCG5 退火退火GCTTAAAATTCG5 GCTTAA 5 AATTCGGCTTAAAATTCG5 GCTTAA 5 AATTCGT4-DNA ligaseT4-DNA ligaseGAATTCCTTAAG5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5 5GAATTCCTTAAG第18页，讲稿共38张，创作于星期二同尾酶生产的粘性末端的连接
14、同尾酶生产的粘性末端的连接BamHIBamHI5 5GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5GCCTAGGATCCG5 5 TACTAG 55 GATCAT5 退火退火GCCTAGGATCCG5 TACTAG 5 GATCATT4-DNA ligaseT4-DNA ligaseTGATCCACTAGG5 5GGATCACCTAGT5 TGATCAACTAGT5 BclIBclIGCCTAGGATCCG5 TACTAG 5 GATCATTGATCCACTAGG5 5GGATCACCTAGT第19页，讲稿共38张，创作于星期二同尾酶生产的粘性末端的连接同尾酶生产的粘性末端的连接载体质粒载
15、体质粒BamHIBamHISau3AISau3AIGGGATCGATCCCCCCTAGCTAGGGGATCGATCCTAGCTAGBamHIBamHISau3AISau3AISau3AISau3AIGATCGATCCCGGCTAGCTAG第20页，讲稿共38张，创作于星期二不同酶生产的粘性末端的连接不同酶生产的粘性末端的连接BamHIBamHI5 5GGATCCCCTAGGCTGCAGGACGTCGATCCG5 5 G5 GACGTCT4-DNA ligaseT4-DNA ligase5 CTGCAGGACGTC5 PstIPstI3 PstIPstICTGCA3 GGGATCCCCTAGGB
16、amHIBamHICCTAG5 5 G5 GACGTCCCTAGGATCCGCTGCAG5 G5ACGTCCCTAGGGATCCCTGCAGG混合混合退火退火第21页，讲稿共38张，创作于星期二重组DNA分子的转化和扩增：转与增物理转化法：物理转化法：钙离子诱导的细菌转化钙离子诱导的细菌转化原生质体转化原生质体转化电击转化电击转化生物转化法：生物转化法：病毒转染转化病毒转染转化细菌接合转化细菌接合转化第22页，讲稿共38张，创作于星期二转化子的筛选和鉴定：检 由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借助各种筛选和由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借助各种筛选和鉴定方法区分鉴定
17、方法区分转化子转化子与非转化子、与非转化子、重组子重组子与非重组子、与非重组子、目的重组子目的重组子与非目的与非目的重组子。重组子。转化子转化子重组子重组子目的重组子目的重组子第23页，讲稿共38张，创作于星期二基于载体遗传标记筛选基于载体遗传标记筛选抗药性筛选法抗药性筛选法ROPROISal IBamH ITcrPvu IPst IPst IEcoR ICla IHind IIIHind IIBal IAprpBR3224363 bpori此类筛选法可区分此类筛选法可区分转化子转化子与与非非转化子转化子、重组子重组子与与非重组子非重组子。将外源将外源DNADNA片段插在片段插在EcoRIEc
18、oRI位点：位点：非重组子呈非重组子呈 ApAprr、TcTcr r 重组子呈重组子呈 ApAprr、TcTcr r 将外源将外源DNADNA片段插在片段插在BamHIBamHI位点：位点：非重组子呈非重组子呈 ApAprr、TcTcr r 重组子呈重组子呈 ApAprr、TcTcss 第24页，讲稿共38张，创作于星期二基于载体遗传标记筛选基于载体遗传标记筛选抗药性筛选法抗药性筛选法抗药性筛选法的基本操作：抗药性筛选法的基本操作：先将转化液涂布含有先将转化液涂布含有ApAp的平板上；的平板上；再将再将ApAp平板上的转化子影印至平板上的转化子影印至含有含有ApAp和和TcTc的平板上。的平板
19、上。在在ApAp平板上生长、但在平板上生长、但在ApAp和和TcTc平板平板上上不长的转化子即为不长的转化子即为重组子重组子。ApApAp+TcAp+Tc影印影印挑选挑选第25页，讲稿共38张，创作于星期二基于载体遗传标记筛选基于载体遗传标记筛选重组子（重组子（ApAprr+lacZ+lacZ-）pUC18AprlacZoriAp+X-galAp+X-gal显色筛选法显色筛选法第26页，讲稿共38张，创作于星期二pUC18 pUC18 2.7 kb2.7 kbHindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRIHindIII SphI PstI SalI B
20、amHI SmaI KpnI EcoRIApAprrlacZlacZorioriBBBBEEPP4.0 kb4.0 kb1.0 kb1.0 kb0.8 kb0.8 kb区分重组子与非重组子区分重组子与非重组子用用BamHIBamHI酶切转化子质粒酶切转化子质粒DNADNA电泳观察酶解产物片段电泳观察酶解产物片段重组子：重组子：2.7 2.7 kb+4.0 kbkb+4.0 kb非重组子：非重组子：2.7 2.7 kbkb如果外源如果外源DNADNA片段也是片段也是2.7 2.7 kbkb，最好选用单最好选用单一切口的酶将质粒线型化，然一切口的酶将质粒线型化，然后通过其长度来鉴定其是否为重组子后
21、通过其长度来鉴定其是否为重组子基于克隆DNA序列检测限制性酶切图谱法限制性酶切图谱法：第27页，讲稿共38张，创作于星期二pUC18 pUC18 2.7 kb2.7 kbHindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRIHindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRIApAprrlacZlacZorioriBBB BEEP P4.0 kb4.0 kb1.0 kb1.0 kb0.8 kb0.8 kb区分目的重组子与非目的重组子区分目的重组子与非目的重组子用用EcoRIEcoRI酶切转化子质粒酶切转化子质粒DNADNA：
22、目的重组子：目的重组子：3.0 3.0 kb+3.7 kbkb+3.7 kb 或者：或者：1.0 1.0 kb+5.7 kbkb+5.7 kb用用PstIPstI酶切转化子质粒酶切转化子质粒DNADNA：目的重组子：目的重组子：3.2 3.2 kb+3.5 kbkb+3.5 kb 或者：或者：0.8 0.8 kb+5.9 kbkb+5.9 kb基于克隆DNA序列检测限制性酶切图谱法限制性酶切图谱法：第28页，讲稿共38张，创作于星期二基于目标基于目标DNADNA序列鉴定序列鉴定DNA DNA 杂交法杂交法影印影印碱解碱解杂交杂交感光感光漂洗漂洗取膜取膜ATGCCGTATGTGTCATAGCAT
23、GCCGTATGTGTCATAGCGGCATACACAGGGCATACACAGGCGTGTAAATGCGCGTAAAGCGTGTAAATGCGCGTAAATTGTCGTAATGCGTAAGCCTTGTCGTAATGCGTAAGCCCCGTGTAAATGTCGACTATCCGTGTAAATGTCGACTAT此类筛选法可区分此类筛选法可区分目的重组子目的重组子与与非目的重组子非目的重组子。探针探针第29页，讲稿共38张，创作于星期二基于目标基于目标DNADNA序列鉴定序列鉴定PCR PCR 扩增法扩增法引物引物 AA引物引物 B B凝胶电泳检测凝胶电泳检测PCRPCR扩增产物扩增产物A/BA/BA
24、ABB非非重重组组子子重重组组子子目目的的重重组组子子第30页，讲稿共38张，创作于星期二目的基因的克隆（分离获得）目的基因的克隆（分离获得）实现基因工程三大用途的前提条件是从生物体基因组中克隆目的基因。目实现基因工程三大用途的前提条件是从生物体基因组中克隆目的基因。目的基因获得之后，或确定其表达调控机制及生物学功能，或建立高效表达系统，的基因获得之后，或确定其表达调控机制及生物学功能，或建立高效表达系统，构建具有经济价值的基因工程菌（细胞），或将目的基因在体外进行必要的结构建具有经济价值的基因工程菌（细胞），或将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰，然后输回细胞内改良生物体的遗传性状，包括人
25、体基因治疗。构功能修饰，然后输回细胞内改良生物体的遗传性状，包括人体基因治疗。一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类：一类是构建感兴趣的生一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类：一类是构建感兴趣的生物个体的物个体的基因文库基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；另一类是利用模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；另一类是利用PCRPCR扩增技扩增技术甚至化学合成法体外术甚至化学合成法体外直接合成直接合成目的基因，然后将之克隆表达。目的基因，然后将之克隆表达。第31页，讲稿
26、共38张，创作于星期二目的基因的克隆目的基因的克隆鸟枪法鸟枪法克隆目的基因克隆目的基因cDNAcDNA法法克隆目的基因克隆目的基因PCRPCR法法获得目的基因获得目的基因化学合成化学合成法法获得目的基因获得目的基因第32页，讲稿共38张，创作于星期二目的基因的克隆目的基因的克隆鸟枪法克隆目的基因鸟枪法克隆目的基因基因文库基因文库第33页，讲稿共38张，创作于星期二目的基因的克隆目的基因的克隆cDNAcDNA法克隆目的基因法克隆目的基因煮沸煮沸NaOHNaOHAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA5 5 pppppp55G G AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
27、AAAOHOH 33TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTpp 55TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTpp 55TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTpp 55AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOHOH 33TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTOHOH 33KlenowKlenowdNTPsdNTPsS1S1基因文库基因文库5 5 pppppp55G G AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOHOH 33TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTpp 55逆转录酶逆转录酶mRNAmRN
28、AcDNAcDNA第34页，讲稿共38张，创作于星期二目的基因的克隆目的基因的克隆PCRPCR法克隆目的基因法克隆目的基因 DNADNA复制（生物合成）的基本原理复制（生物合成）的基本原理55p p-ACCTCGTGTCAAAGCCGTCGATGTACGTTAGCCGCACCTCGTGTCAAAGCCGTCGATGTACGTTAGCCGC-OHOH 3333HOHO-TGGAGCACAGTTTCGGCAGCTACATGCAATCGGCGTGGAGCACAGTTTCGGCAGCTACATGCAATCGGCG-p p 5533HOHO-UCGGCGUCGGCG-p p 5555p p-ACCUCG
29、ACCUCG-OHOH 33引物引物引物引物5 pppN5 pppNRR5 pppN5 pppNRRDNADNA聚合酶聚合酶模板模板第35页，讲稿共38张，创作于星期二5555目的基因目的基因55变性变性加热加热5555引物引物退火退火5555底物底物聚合聚合55555555加热加热变性变性55555555555555555555555555555555555555555555555555退火退火 引物引物底物底物聚合聚合加热加热变性变性引物引物退火退火底物底物聚合聚合112233第36页，讲稿共38张，创作于星期二目的基因的克隆目的基因的克隆化学合成化学合成法克隆目的基因法克隆目的基因OHGHHHHOCH2ODMTPOMeNCHMeMeCHMeMeHDMTDMT：二甲氧基三苯甲基二甲氧基三苯甲基激活激活缩合缩合氧化氧化脱取代基脱取代基玻璃珠玻璃珠连接臂连接臂第37页，讲稿共38张，创作于星期二感谢大家观看第38页，讲稿共38张，创作于星期二