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1、细菌鞭毛染色的方法 目前，细菌鞭毛染色方法根据染色剂的不同，可分为碱性复红法、副品红法、结晶紫法、维多利亚蓝 B 法、镀银染色法和荧光蛋白染色法 6 类，前 5 类方法的媒染剂成分中均含有单宁酸，染色原理通常是采用不稳定的胶体溶液做媒染剂，并使其沉淀于鞭毛上而使“鞭毛肿胀（tar and feather）”，鞭毛直径加粗，进一步染色后即可在油镜下观察。1.碱性复红法和副品红法：1926 年由 Gray 首创，其媒染液成分包括 20%丹宁酸水溶液 2.0ml，硫酸钾铝饱和水溶液 5ml，饱和氯化汞水溶液 2ml，3%碱性复红乙醇（95%）溶液 0.4ml，临用前混合，且需过滤后方可使用。染片时，
2、媒染剂染色约 6min，具体时间尚需在试验中摸索确定，染色液是抗酸染色 Ziehl-Neelsen 石碳酸复红染液，染片时需要 1 小片吸水纸盖在涂片上，染色 3min。由于该方法媒染剂混合物不稳定、操作复杂、经验性强。Leifson 于 1930 年建立了副品红法，并于 1938 年和 1951 年两次对该方法进行了改良，称为 Leifson 方法。染色试剂由 3 种溶液组成：A 为 1.5%NaCl 水溶液，B 为 3%单宁酸水溶液，C为乙酸副品红 0.9g，碱性副品红 0.3g 溶解于 100ml95%乙醇溶液中。使用时把等体积 A 和 B 混合，然后再加 2 体积 C 与之相混。该试剂
3、冷藏可保存 12 个月。2.结晶紫法：又称 Ryu 法，1937 年由 Ryu 建立，1982 年由 Kodaka 等进行了改良。媒染剂：5%石碳酸 10 ml，2g 单宁酸和 10 ml 饱和硫酸钾铝。染色剂：饱和结晶紫乙醇溶液，即 12g 结晶紫溶于 100 ml 无水乙醇中。使用时把 10 份媒染剂与 1 份染色剂混合，染色 5min。1989 年，Heimbrook 等使用改良的 Ryu染色试剂，采用湿片技术进行鞭毛染色，虽然可以观察到细菌鞭毛，但效果不好。Ryu 染色方法优点是试剂比较稳定，目前 Difco 公司已经研制出该方法的商品试剂盒，但染色效果亦不甚理想.3.维多利亚蓝 B
4、法：1990 年由 Inoue 等报道日本制药株式会社 Shionogi Seiyaku 研制出一种细菌鞭毛染色商品试剂盒。其试剂组成包括维多利亚蓝 B、苯酚、单宁酸和硫酸钾铝，染色约需 7min。该试剂保存期约为 6 个月，关于其染色效果虽然有过一篇文献评述，但却没有采用评分法进行评价，很难判断其染色效果。4.镀银染色法：1958 年 Rhodes 根据 Fontana 的螺旋体改良镀银染色法，建立了一种细菌鞭毛镀银染色法。试剂分为媒染剂和银染剂。媒染液：10%单宁酸 10 ml 加 5 ml 饱和硫酸钾铝水溶液，再加 1 ml 苯胺饱和水溶液形成沉淀，通过摇动又能重新溶解，加入 5%FeC
5、l3 水溶液 1 ml 形成黑色溶液，稳定 10 min 后使用。银染液：配制 5%AgNo3 水溶液 100 ml 取出 10 ml 备用，再缓慢加入浓氨水（比重 0.880）使形成的沉淀刚好重新溶解，最后把备用的 10 mlAgNo3 溶液向其中逐滴加入，直到摇动后呈现轻微而稳定的薄雾状溶液为止，避光保存，可稳定数周。用媒染液染片 35min，蒸馏水充分洗涤后，再把银染液滴加至涂片上。加热至接近沸腾，染色 35min。由于 Rhodes 镀银染色法媒染液成分复杂、操作繁锁，所以 1965年 Blenden 等改良了细菌鞭毛镀银染色法的配方。试剂 A：100 ml 蒸馏水中加入 5 g 单宁
6、酸，1.5 gFeCl3，15%福尔马林 2 ml，1%NaOH 溶液 1 ml。试剂 B：使用 2%AgNo3，其他同于 Rhodes，但试剂不稳定，要求在 4h 内使用，并用要用氨水调 pH 至 10。试剂 A 染片 24min，试剂 B 染色 30 s，不需加热。由于以上两种镀银染色方法都要使用营养琼脂斜面培养物，并且需用无菌蒸馏水悬浮菌液制片，未采用评分法评价镀银染色方法。因此 1977 年，West 等对镀银染色法进一步改良，制备涂片时直接使用血平板，评价染色效果首次使用 5 分制，通过该评价方法证明了加热银染液染片可以提高染色效果。试剂配方：媒染液为饱和硫酸钾铝水溶液 25 ml，
7、10%单宁酸 50 ml，5%FeCl3 水溶液 5 ml，5保存，染色液配制同Rhodes，但需避光 5保存。媒染液染片 4min，银染液滴加至涂片上加热至微冒蒸汽，染色 4min。同时West 等还对使用不同培养基进行染色效果评价，包括半固体动力培养基、血琼脂平板、TSA（trypticase soy agar）斜面，其中半固体动力培养基和 TSA 斜面 25，培养 1824h；血琼脂平板 3537，培养1824h。评价结果血琼脂平板 3537，培养 1824h 不适于细菌鞭毛染色，而半固体动力培养基和 TSA 斜面 25，培养 1824h 适合于细菌鞭毛染色，同时也证明了使用福尔马林处理
8、标本制备涂片并不能有效阻止鞭毛脱落。由于镀银染色法媒染液不稳定，需避光 5保存，1992 年 Porter 等继续改良该方法，其试剂配方同 West 等的方法，只是媒染剂避光室温可保存数月，延长媒染剂染色时间为 8 min，染色液不需加热，只染 30 s，制备涂片程序略有不同。使用 TSA 平板，36培养 24h，但遗憾的是 Porter 等只使用了 1 种细菌（奇异变形杆菌）进行研究。于是 1994 年 Finegan 等进一步证实使用过期媒染剂进行镀银染色可以增强鞭毛染色效果，并使用 4 种细菌（绿脓假单胞、奇异变形杆菌、黏质沙雷菌、枯草芽孢杆菌），用 trypitcase soy 肉汤及
9、其琼脂平板，26培养 24h。试剂配方仍不变，媒染液放置 1、2、4、8、16 周后进行染色，媒染液染色 8 min，银染液染色 3060 s，不需加热。这 4 种细菌均染色成功，从而证明媒染液可至少放置 16 周。5、鞭毛的负染：具体操作：菌悬液，直接滴在铜网上，12 分钟后，吸去多余的菌液（似干非干的程度），再滴上 0.1的磷钨酸溶液，1 分钟后，吸去多余的染液，然后就可以在电镜下观察了。一般染色后十五天之内看电镜。时间太长效果不好。这是我试验用的方法。6、我喜欢用银染法，曾做过一段时间的细菌鉴定，以下是我一些染色心得：首先染色用玻片一定要干净，洗液泡过之后蒸馏水冲洗干净。涂片的时候菌千万
10、别涂得太多。第一部染色时，可将玻片置于水浴锅内，温度保持在 35 度,盖上盖（主要是保持一定的湿度，防止染色液变干不利于冲洗，这步非常有用)。一定要将第一步使用的媒染液冲洗干净，否则影响染色效果，背景可能非常 脏。其他的步骤参考书上的资料进行，一般没什么问题。我用这种方法染单鞭毛的弧菌，效果非常好。注意事项：1.要注意培养条件和培养时间：用点接法在新配制的牛肉膏蛋白胨半固体平板上接种。一般一个平板点接 34 处。经比较用半固体培养基培养出来的菌体活动度大，鞭毛长且多，易于染色，这可能与半固体培养基更适于菌体运动、鞭毛生长较好有关。用点接种法在平板上接种更易于挑取边缘幼龄的菌体。培养时间要严格掌
11、握，一般培养 912h 较好，菌龄超过 15h，鞭毛染色效果较差，这可能与老龄菌体活动度降低、鞭毛易脱落有关。2.染色过程中的细节也应充分注意：取菌要取菌落边缘的幼龄菌体。取菌后的接种环在载片上的蒸馏水中轻轻沾几下即可，不要用力太猛，更不能用接种环大幅度涂开；将载片稍倾斜，使菌液散开即可，否则鞭毛易脱落，造成染色失败。鞭毛染色的玻片只能自然干燥，不能用热风吹干，不能热固定，这是由于加热后菌体易变形，鞭毛易脱落，影响观察。A 染液染 35 min，其后用蒸馏水（自来水效果差）冲洗时一定要充分，否则加 B 染液后，背景很脏，鞭毛不易被观察到，影响实验效果。加 B 染液后，将玻片稍加热（但不能太热，更不能沸腾或蒸干）使其微冒蒸汽，3060 s，染色效果较不加热为好。B 染液染完后，用蒸馏水冲洗比用自来水冲洗效果好。