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1、实验三实验三细菌的鞭毛染色和芽孢染色细菌的鞭毛染色和芽孢染色主 讲:徐尔尼生命科学学院生物技术系一、目的与要求 学习细菌的芽孢染色和鞭毛染色方法。学习细菌的芽孢染色和鞭毛染色方法。学习细菌的芽孢染色和鞭毛染色方法。学习细菌的芽孢染色和鞭毛染色方法。观察芽孢杆菌形态特征和鞭毛的形态特征。观察芽孢杆菌形态特征和鞭毛的形态特征。观察芽孢杆菌形态特征和鞭毛的形态特征。观察芽孢杆菌形态特征和鞭毛的形态特征。巩固无菌操作技术和显微镜的油镜使用。巩固无菌操作技术和显微镜的油镜使用。巩固无菌操作技术和显微镜的油镜使用。巩固无菌操作技术和显微镜的油镜使用。二、基本原理基本原理1 1、鞭毛染色法、鞭毛染色法 细细
2、细细菌菌菌菌的的的的鞭鞭鞭鞭毛毛毛毛很很很很纤纤纤纤细细细细，其其其其直直直直径径径径通通通通常常常常为为为为0.010.010.010.010.02m0.02m0.02m0.02m，所所所所以以以以不不不不能能能能用用用用光光光光学学学学显显显显微微微微镜镜镜镜直直直直接接接接观观观观察察察察到到到到，必必必必须采用特殊的染色方法，才能被观察。须采用特殊的染色方法，才能被观察。须采用特殊的染色方法，才能被观察。须采用特殊的染色方法，才能被观察。鞭鞭鞭鞭毛毛毛毛染染染染色色色色原原原原理理理理是是是是在在在在染染染染色色色色前前前前先先先先用用用用媒媒媒媒染染染染剂剂剂剂处处处处理理理理，使使
3、使使它它它它沉沉沉沉积积积积在在在在鞭鞭鞭鞭毛毛毛毛上上上上，使使使使鞭鞭鞭鞭毛毛毛毛直直直直径径径径加加加加粗粗粗粗，然然然然后后后后再再再再进进进进行染色。行染色。行染色。行染色。二、基本原理基本原理2 2、芽孢染色法、芽孢染色法 由由由由于于于于芽芽芽芽孢孢孢孢壁壁壁壁厚厚厚厚、透透透透性性性性低低低低、不不不不易易易易着着着着色色色色，因因因因此此此此用用用用着着着着色色色色力力力力强强强强的的的的染染染染色色色色剂剂剂剂孔孔孔孔雀雀雀雀绿绿绿绿或或或或石石石石炭炭炭炭酸酸酸酸复复复复红红红红，在在在在加加加加热热热热条条条条件件件件下下下下染染染染色色色色，使使使使染染染染料料料料不
4、不不不仅仅仅仅进进进进入入入入菌菌菌菌体体体体也也也也可可可可进进进进入入入入芽芽芽芽孢孢孢孢内内内内，进进进进入入入入菌菌菌菌体体体体的的的的染染染染料料料料经经经经水水水水洗洗洗洗后后后后被被被被脱脱脱脱色色色色，而而而而芽芽芽芽孢孢孢孢一一一一经经经经着着着着色色色色难难难难以以以以被被被被水水水水洗洗洗洗脱脱脱脱，当当当当用用用用对对对对比比比比度度度度大大大大的的的的复复复复染染染染剂剂剂剂染染染染色色色色后后后后，芽芽芽芽孢孢孢孢仍仍仍仍保保保保留留留留初初初初染染染染剂剂剂剂颜颜颜颜色色色色，而而而而菌菌菌菌体体体体和和和和芽芽芽芽孢孢孢孢囊囊囊囊被被被被染染染染成成成成复复复复
5、染染染染剂剂剂剂的颜色，使芽孢和菌体更易于区分。的颜色，使芽孢和菌体更易于区分。的颜色，使芽孢和菌体更易于区分。的颜色，使芽孢和菌体更易于区分。三、实验器材1 1、菌种：、菌种：、菌种：、菌种：普通变形普通变形普通变形普通变形杆菌、枯草芽孢杆菌杆菌、枯草芽孢杆菌杆菌、枯草芽孢杆菌杆菌、枯草芽孢杆菌2 2、染色剂：、染色剂：、染色剂：、染色剂：硝酸银鞭毛染色液硝酸银鞭毛染色液硝酸银鞭毛染色液硝酸银鞭毛染色液:(A:(A:(A:(A液、液、液、液、B B B B液）、芽孢液）、芽孢液）、芽孢液）、芽孢染色液染色液染色液染色液:（5%5%5%5%孔雀绿染液、孔雀绿染液、孔雀绿染液、孔雀绿染液、0.5
6、%0.5%0.5%0.5%番红染液）番红染液）番红染液）番红染液）3 3、仪器或其他用具：、仪器或其他用具：、仪器或其他用具：、仪器或其他用具：载玻片、生理盐水、酒精灯、载玻片、生理盐水、酒精灯、载玻片、生理盐水、酒精灯、载玻片、生理盐水、酒精灯、木夹、接种环、双层瓶、显微镜、擦镜纸、滤纸等木夹、接种环、双层瓶、显微镜、擦镜纸、滤纸等木夹、接种环、双层瓶、显微镜、擦镜纸、滤纸等木夹、接种环、双层瓶、显微镜、擦镜纸、滤纸等四、操作步骤1 1、鞭毛染色（硝酸银染色法）、鞭毛染色（硝酸银染色法）取取取取一一一一滴滴滴滴无无无无菌菌菌菌水水水水，滴滴滴滴于于于于玻玻玻玻片片片片一一一一端端端端取取取取
7、一一一一环环环环菌菌菌菌置置置置于于于于无无无无菌菌菌菌水水水水中中中中，让让让让菌菌菌菌体体体体利利利利用用用用鞭鞭鞭鞭毛毛毛毛运运运运动动动动开开开开 然然然然后后后后玻玻玻玻片片片片倾倾倾倾斜斜斜斜，让让让让菌菌菌菌液液液液缓缓缓缓缓缓缓缓流流流流向向向向玻玻玻玻片片片片的的的的另另另另一一一一端端端端 室室室室温温温温自自自自然然然然干干干干燥燥燥燥 滴滴滴滴加加加加染染染染液液液液A A 3-5min3-5min 水水水水洗洗洗洗 用染液用染液用染液用染液B B冲去残水冲去残水冲去残水冲去残水 滴加染液滴加染液滴加染液滴加染液B B1-1.5min1-1.5min水洗水洗水洗水洗干燥
8、干燥干燥干燥 镜检镜检镜检镜检 结果：菌体深褐色，鞭毛淡褐色并呈波浪形。结果：菌体深褐色，鞭毛淡褐色并呈波浪形。结果：菌体深褐色，鞭毛淡褐色并呈波浪形。结果：菌体深褐色，鞭毛淡褐色并呈波浪形。操作要点：操作要点：操作要点：操作要点：菌种的培养时间为菌种的培养时间为菌种的培养时间为菌种的培养时间为8-10h8-10h8-10h8-10h。玻片要求光滑、洁净。玻片要求光滑、洁净。玻片要求光滑、洁净。玻片要求光滑、洁净。勿用接种环涂布制片。勿用接种环涂布制片。勿用接种环涂布制片。勿用接种环涂布制片。制片后要自然干燥，不能放在火焰上干燥。制片后要自然干燥，不能放在火焰上干燥。制片后要自然干燥，不能放在
9、火焰上干燥。制片后要自然干燥，不能放在火焰上干燥。为使鞭毛清晰可见，水洗时尽量把载玻片冲干净。为使鞭毛清晰可见，水洗时尽量把载玻片冲干净。为使鞭毛清晰可见，水洗时尽量把载玻片冲干净。为使鞭毛清晰可见，水洗时尽量把载玻片冲干净。四、操作步骤2 2、芽孢染色、芽孢染色涂涂涂涂片片片片 干干干干燥燥燥燥固固固固定定定定 滴滴滴滴加加加加孔孔孔孔雀雀雀雀绿绿绿绿染染染染液液液液 夹夹夹夹住住住住玻玻玻玻片片片片，微微微微火火火火加加加加热热热热至至至至蒸蒸蒸蒸汽汽汽汽冒冒冒冒出出出出，维维维维持持持持5min 5min 水水水水洗洗洗洗 番番番番红红红红复复复复染染染染6min6min水水水水洗洗洗洗
10、 干燥干燥干燥干燥 镜检镜检镜检镜检结果：芽孢绿色，营养体红色结果：芽孢绿色，营养体红色结果：芽孢绿色，营养体红色结果：芽孢绿色，营养体红色。操作要点：操作要点：操作要点：操作要点：加热过程中，要及时补充染液，切勿让涂片干涸。加热过程中，要及时补充染液，切勿让涂片干涸。加热过程中，要及时补充染液，切勿让涂片干涸。加热过程中，要及时补充染液，切勿让涂片干涸。在冒蒸汽的条件下，维持足够的时间，否则在冒蒸汽的条件下，维持足够的时间，否则在冒蒸汽的条件下，维持足够的时间，否则在冒蒸汽的条件下，维持足够的时间，否则染液不易进入芽孢内。染液不易进入芽孢内。染液不易进入芽孢内。染液不易进入芽孢内。待玻片冷却
11、后，用缓流自来水冲洗，以免细菌被水冲掉。待玻片冷却后，用缓流自来水冲洗，以免细菌被水冲掉。待玻片冷却后，用缓流自来水冲洗，以免细菌被水冲掉。待玻片冷却后，用缓流自来水冲洗，以免细菌被水冲掉。尽可能地把尽可能地把尽可能地把尽可能地把孔雀绿染液冲洗干净，以免影响番红的复染。孔雀绿染液冲洗干净，以免影响番红的复染。孔雀绿染液冲洗干净，以免影响番红的复染。孔雀绿染液冲洗干净，以免影响番红的复染。五、实验数据及处理结果五、实验数据及处理结果 1 1、根据油镜观察结果，、根据油镜观察结果，、根据油镜观察结果，、根据油镜观察结果，绘出枯草芽孢杆菌的形态绘出枯草芽孢杆菌的形态绘出枯草芽孢杆菌的形态绘出枯草芽孢
12、杆菌的形态特征（注意芽孢的形状及着生位置）。特征（注意芽孢的形状及着生位置）。特征（注意芽孢的形状及着生位置）。特征（注意芽孢的形状及着生位置）。2 2 2 2、绘出普通变形杆菌的鞭毛形态特征。绘出普通变形杆菌的鞭毛形态特征。绘出普通变形杆菌的鞭毛形态特征。绘出普通变形杆菌的鞭毛形态特征。六、思考与讨论思考与讨论1 1、用鞭毛染色法准确鉴定一株细菌是否具有鞭毛，要、用鞭毛染色法准确鉴定一株细菌是否具有鞭毛，要、用鞭毛染色法准确鉴定一株细菌是否具有鞭毛，要、用鞭毛染色法准确鉴定一株细菌是否具有鞭毛，要注意哪些环节？注意哪些环节？注意哪些环节？注意哪些环节？2 2、若涂片中观察到的只是大量游离芽孢
13、，很少看到芽、若涂片中观察到的只是大量游离芽孢，很少看到芽、若涂片中观察到的只是大量游离芽孢，很少看到芽、若涂片中观察到的只是大量游离芽孢，很少看到芽孢囊及营养细胞，你认为这是什么原因？孢囊及营养细胞，你认为这是什么原因？孢囊及营养细胞，你认为这是什么原因？孢囊及营养细胞，你认为这是什么原因？3 3、说明芽孢染色法的原理，用简单染色法能否观察到、说明芽孢染色法的原理，用简单染色法能否观察到、说明芽孢染色法的原理，用简单染色法能否观察到、说明芽孢染色法的原理，用简单染色法能否观察到细菌的芽孢？细菌的芽孢？细菌的芽孢？细菌的芽孢？下次实验项目：下次实验项目：下次实验项目：下次实验项目：放线菌的形态观察、放线菌的形态观察、放线菌的形态观察、放线菌的形态观察、酵母菌的形态观酵母菌的形态观酵母菌的形态观酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴别察及死活细胞的鉴别察及死活细胞的鉴别察及死活细胞的鉴别