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1、1/7 利用内标为基础的 RT-PCR 技术检测草莓 SCV、SVBV 病毒 史芳芳 (新疆兵团第十二师农业科学研究所，乌鲁木齐 830088)摘要：草莓皱缩病毒病（SCV）是草莓上为害性最大的病毒病，单独侵染，影响长势，与其他病毒复合侵染时，使感病品种植株严重矮化，通常与草莓镶脉病毒（SVBV）复合侵染。本研究通过 CTAB 法与试剂盒提取 RNA，以优质的总 RNA 为模板，进行梯度 PCR，结合扩增内标的检测体系，建立了优化的 SCV 和 SVBV 的多重 RT-PCR 检测体系，可以对草莓田间植株进行快速稳定的病毒检测。关键词:草莓病毒;内标;多重 RT-PCR;病毒检测 Detect
2、ion of SCV and SVBV with Multiplex RT-PCR Based on Internal Control Shi Fang-fang（The Center of Popularization of Agricultural Technology of the 12th Division of Xinjiang Production and Construction Corps,Urumchi 830088）Abstract:Strawberry crinkle virus(SCV)was damage of the largest virus disease.Wh
3、en it was infected alone,it influenced the growth,and other complex virus infection to susceptible cultivars were severe stunting,usually mixed infection strawberry vein banding virus(SVBV).By CTAB method and the kit,RNA was extracted,using high-quality total RNA as a template,gradient PCR with inte
4、rnal amplification target detection system,established a multiplex RT-PCR detection system of SCV and SVBV can fast and stable virus detection in field grown strawberries.Key words:strawberry virus;internal control;multiplex RT-PCR;virus detection 草莓种苗普遍感染病毒是草莓生产中的瓶颈问题，由于可侵染草莓的病毒经常复合侵染，因此草莓病毒病的田间症状表
5、现极其复杂。不同病毒病在草莓上可表现出相似的症状,而同种病毒病在不同条件下的症状也会出现很大的差异,这给病害的田间诊断带来了极大的困难。因此，建立快速、准确的草莓病毒检测技术具有重要的实际意义。新疆对草莓病毒病的研究极少，对病毒种类、分布、发生程度及生物学特性等基础极为薄弱，病毒检测体系不2/7 健全，缺乏先进的种苗及种苗生产环节有效的病毒检测技术手段，脱毒种苗质量难以保证，退化严重，使用时间短，效益不高。有的生产单位未经检测就盲目从内地调种，劣质种苗不仅破坏了脱毒种苗的声誉，市场引起纠纷，损害了农民的利益，还造成了一些病原菌的广泛传播和地区性的检疫病害传入我区，后患无穷。因此，我们在已有实验
6、技术的基础上，通过进一步改进实验方法，优化体系，建立起一套灵敏度高，准确性好，操作简便的病毒检测技术。本研究旨在针对草莓 SVBV、SCV 两种病毒，以单一 RT-PCR 为基础，通过对反应条件和参数的摸索与优化，建立多重 RT-PCR 检测方法，实现两种病毒的同时高效快速检测，为草莓病毒检测提供一种方便、高效的分子生物学方法，为草莓无病毒苗的实际生产提供技术支撑。1 材料与方法 1.1 试验材料 草莓试材采自于新疆兵团十二师三坪农场种植的露地草莓品种达赛莱克特,此品种为该单位从外地引进，种苗未经检测便种植于大田，受三坪农场之托采集疑似感染皱缩病毒的6 株草莓植株叶片，进行病毒检测。取幼叶一片
7、,大小约 50mg 为试验材料。RNA 试剂提取盒、反转录试剂盒、Taq DNA 聚合酶、dNTPs、DNA 分子量 MarkerD2000 均购于上海生物工程有限公司。1.2 试验方法 1.2.1 特异性扩增与参照引物设计 根据GenBank中SMoV(Genbank Accession No.AJ311875,AJ311876)、SMYEV(Genbank Accession No.D12517)、SCV(Genbank Accession No.AY005146.1)、SVBV(Genbank Accession No.NC001725)的基因组序列和文献分别设计和合成针对SMoV、SM
8、YEV、SCV 和 SVBV 的引物(表 1)。为了验证扩增的阴性条带的真伪性,该研究特引用草莓肌动蛋白基因 Actin(GenBank Accession No.AB116565)作为内部体系参照。研究中所用引物均由上海生物工程公司合成。引物序列见表 1。Table 1 The primer pairs for detection of SMoV、SMYEV、SVBV、SCV and Actin primer pair Sequence(53)Target fragment(bp)SMoVF TAAGCGACCACGACTGTGACAAAG(Sense primer)219 SMoVR TC
9、TTGGGCTTGGATCGTCACCTG(Antisense primer)SVBVF GAATGGGACAATGAAATGAG(Sense primer)278 3/7 SVBVR AACCTGTTTCTAGCTTCTTG(Antisense primer)SMYEVF CCGCTGCAGTTGTAGGGTA(Sense primer)861 SMYEVR CATGGCACTCATTGGAGCTGGG(Antisens primer)SCVF CATTGGTGGCAGACCCATCA(Sense primer)345 SCVR TTCAGGACCTATTTGATGACA(Antisens
10、primer)ActinF GCTGGGTTTGCTGGAGATG(Sense primer)295 ActinR CACGATTAGCCTTGGGATTC(Antisens primer)1.2.2 核酸提取 1.2.2.1 利用改进的 CTAB 法提取草莓叶片总核酸。取少许幼嫩的叶片，放入 1.5ml 离心管中，加入石英砂用研磨杵研磨均匀，直至全部研磨至粉末，加入 500ul65预热的 CTAB 溶液（用前加入 2%的巯基乙醇），将装有 CTAB 和样品的 EP 管放入 65水浴，约 20min。冷却后，加入 500ul 的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1=300:288:12)，混匀，1
11、2000rpm，离心 15min，吸上清，装入一新的 EP 管。加入 500ul 氯仿：异戊醇（24:1=576:24），12000rpm。离心 15min吸上清，转入一新的离心管中。加入 1/10 体积的 NaAc（3mol/l），1ml-20预冷的无水乙醇，反复颠倒数次，混匀后置于-20（-80，30min）3-4h，12000rpm，10min 弃上清。向离心管中加入 75%的乙醇洗涤 2-3 次，置于吸水纸上倒置晾干。加入 DEPC H2O（30ul）溶解。1.2.2.2 试剂盒提取总 RNA 参见试剂盒说明书。1.2.3 反转录 按照试剂盒说明进行反转录。1.2.4 梯度 PCR 扩
12、增内参 以反转录产物为模板，进行单一 PCR 扩增。10PCR 缓冲液 4ul MgCl2 1.2ul dNTP 0.4ul 引物 ActinF/ActinR 1ul Taq 酶 0.5ul 反转录产物 0.5ul 总体积 补足双蒸水至 20ul 反应程序：预变性 942min;9430s；50-5540s；681min,35 个循环；72延伸 5min。1.2.5 多重 RT-PCR 4/7 1.2.5.1 双重 RT-PCR 扩增 SCV 10PCR 缓冲液 4ul MgCl2 1.2ul dNTP 0.4ul 引物 ActinF/ActinR 0.5ul SCVF/SCVR 0.5ul
13、Taq 酶 0.5ul 反转录产物 0.5ul 总体积 补足双蒸水至 20ul 反应程序：预变性 942min;9430s；5540s；681min,35 个循环；72延伸 5min。1.2.5.2 三重 RT-PCR 扩增其它三个病毒 10PCR 缓冲液 4ul MgCl2 1.2ul dNTP 0.4ul 引物 SMoVF/SMoVR 0.72ul SVBVF/SVBVR 1ul SMYEVF/SMYEVF 0.6ul Taq 酶 0.5ul 反转录产物 0.5ul 总体积 补足双蒸水至 20ul 反应程序：预变性 942min;9430s；5540s；681min,35 个循环；72延伸
14、 5min。2 结果与分析 2.1 总核酸分离和电泳检测 采用试剂盒提取总核酸，包括总 DNA 和总 RNA。从琼脂糖凝胶电泳结果可以看出（如图1），DNA 条带及 RNA 的 28S、18S 和 5S 条带均能看到，这说明总 RNA 没有发生降解，完整性较好。2.2 内标的 RT-PCR 以 ActinF/ActinR 为引物，采取的草莓品种反转录产物为模板，梯度 PCR 扩增，筛选出53 度为最佳退火温度，扩增出了预期 295 bp 大小的特异片段(图 2),说明 Actin 基因存在于草莓中，该基因适合作为草莓 RNA 病毒检测的内标。以此基因为内标，一方面可以排除假阴性结果的干扰，另一
15、方面可以进一步检测 RNA 质量，提高了检测结果的准确性。2.3 多重 RT-PCR 5/7 以 ActinF/ActinR、SCVF/SCVR 两对引物首先扩增疑似皱缩病毒，扩增条件同 Actin 基因，两个植株扩增出大小为 345bp 的特异片段（图 3），说明检测出 SCV 病毒，此前预估带有此病毒的推测是正确的。同时，以另外三种病毒引物继续扩增 cDNA，确定植株是否还有其它病毒侵染，结果检测出片段大小 278bp 的条带，说明存在镶脉病毒侵染（图 4），因此疑似植株可确定为皱缩病毒和镶脉病毒复合侵染，与文献中所述：皱缩病毒通常与草莓镶脉病毒（SVBV）复合侵染的说法一致。3 讨论 3
16、.1 与改进 CTAB 法提取 RNA 相比，本研究采用试剂盒提取，方法简单，时间只需半小时，提取效果也比改进 CTAB 法好，而且改进 CTAB 法提取配制试剂复杂，准备工作耗时长，对所用耗材及试剂要求均必须去除 RNA 酶污染，提取时间需要一天，提取过程也较繁琐，一批次提取样品，提取效果均一性不好，有的样品提取条带完整，有的则不太好，这说明提取过程稍不注意，则会 RNA 酶污染，影响了提取效果。3.2 植物病毒检测体系中引入内标可增加试验的可靠性，可减少假阴性的出现。本研究中起初设计了 NADH 脱氢酶基因为内参，合成引物后，经过多次条件摸索，始终扩增不出内参条带，之后换成 actin 内
17、参引物，经过梯度 PCR 扩增，一次便成功扩增出条带，本研究最终选 M 1 2 3 4 5 6 5s 18s 28s 图 1 总核酸提取 295bp 图 2 6 个植株内参 actin 扩增 M A1 A2 S1 S2 345bp(SCV)295bp（actin）图 3 actin/SCV 引物扩增 M:marker A1,A2:actin 扩增条带 S1，S2：SCV 扩增条带 图 4 其它 3 引物扩增 M:marker 1，2:SVBV 扩增条带 M 1 2 278bp(SVBV)6/7 择此基因作为内参，扩增效果较好，健康植株与带毒试材均可良好的扩增，说明此内标相对稳定。3.3 多重P
18、CR扩增受诸多因素影响，本研究首先以疑似病毒引物和内参引物做双重PCR扩增，确保了样本 RNA 质量可靠性，同时验证了疑似病毒的检测结果，二次试验再进行三引物 PCR扩增，以排除其它病毒的侵染，两次实验便可确保试验的准确无误，避免了单一引物扩增的繁琐性，因此，经过多重 RT-PCR 扩增可缩短试验时间，减少试剂耗材的损耗，达到了省时省力的功效。同时，本研究在实验过程中尝试了一步法 RT-PCR 进行扩增，此方法可节省更多的时间和试验步骤，但此方法中间过程不好控制，并且重复性不好，因此，没有得到较好的试验结果，最终还是选择两步法 PCR 更能保证试验的准确性。参考文献 1 王国平.我国草莓病毒种
19、类鉴定研究初报J.中国果树，1988,(2):32-34.2 肖君泽,黄益鸿,姜放军，等.草莓病毒病及其脱毒与检测技术研究进展J.江西农业学报,2010,22(8):88-90.3 常琳琳，张志宏.草莓病毒的简单、快速 PCR 检测J.草莓研究进展（三），2009,83-88.4 杨洪一，张志宏，李丽丽，等.利用多重 RT-PCR 技术检测草莓病毒的研究J.植物病理学报，2007,37(5):549-552.5 随春，吴禄平，张志宏.利用 PCR 技术检测草莓镶脉病毒J.园艺学报，2003,30(1):82-84.6朱海生,花秀凤,陈敏氡,等.四种草莓病毒 SMoV、SVBV、SCV、SMYE
20、V 多重 RT-PCR 检测J.核农学报,2013，27(11):1630-1635.7张志宏,杨洪一,代红艳,等.应用多重 RT-PCR 检测草莓斑驳病毒和草莓轻型黄边病毒J.园艺学报,2006,33(3):507-510.8王红，王菁菁，张科立，等.利用内标为基础的多重T-PC 技术检测草莓斑驳病毒和草莓轻型黄边病毒J 浙江农业学报,2014,26(1):105-109 9杨洪一，张志宏女，杜国栋，等.利用内标为基础的 RT-PCR 技术检测草莓斑驳病毒J.植物病理学报,2005,35(2)：116-122.10陈晓军,王敬东,马洪爱,等.利用 RT-PCR 对脱毒草莓苗病毒检测研究.北方园艺,2010(23):146-148.7/7 基金项目：新疆生产建设兵团科技支疆计划项目，项目编号：2013AB006。作者简介：史芳芳（1977-），女，硕士研究生,助理研究员。研究方向：植物基因工程。现从事植物组织培养及农业技术推广工作，。邮箱：单位：新疆兵团第十二师农业科学研究所 地址：乌鲁木齐市头屯河区崇五路48号，830088