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1、关于微生物次级代谢及调节第1页，此课件共40页哦内容：n青霉素的生物合成途径及代谢调节青霉素的生物合成途径及代谢调节n选育青霉素产生菌选育青霉素产生菌n发酵控制发酵控制第2页，此课件共40页哦青霉素的化学结构式：青霉素的化学结构式：青霉素有一个青霉素有一个四氢噻唑环四氢噻唑环和和内酰胺环内酰胺环。R代表代表 侧链侧链，不，不同类型的青霉素含有不同类同类型的青霉素含有不同类型的侧链。型的侧链。用不同的菌种或培养条件不用不同的菌种或培养条件不同，可以得到各种不同类型同，可以得到各种不同类型的青霉素，或同时产生几种的青霉素，或同时产生几种不同类型的青霉素。不同类型的青霉素。青霉素简介青霉素简介：四氢
2、噻唑环四氢噻唑环内酰胺环内酰胺环侧链侧链6-APA（6-氨基青霉烷酸）氨基青霉烷酸）第3页，此课件共40页哦第4页，此课件共40页哦历史：n1928年弗莱明发现点青霉产生可以杀死葡萄糖球菌的年弗莱明发现点青霉产生可以杀死葡萄糖球菌的物质，称之为青霉素。物质，称之为青霉素。n1940年牛津大学的年牛津大学的H.W.Flory和和Chain获得较为纯净获得较为纯净的青霉素，杀菌效果极佳。的青霉素，杀菌效果极佳。n194345年间，发展成了新的一个工业部门：抗生素发年间，发展成了新的一个工业部门：抗生素发酵工业酵工业 n1945年，对青霉素发现做出重要贡献的弗莱明、弗洛年，对青霉素发现做出重要贡献的
3、弗莱明、弗洛里、钱恩分享了诺贝尔医学和生理学奖里、钱恩分享了诺贝尔医学和生理学奖。第5页，此课件共40页哦一一 青霉素的生物合成途径及代谢调节青霉素的生物合成途径及代谢调节第6页，此课件共40页哦青青霉霉素素的的生生物物合合成成途途径径酰基转移酶酰基转移酶酰化酶酰化酶青霉素青霉素G6-APAACV合成酶合成酶IPN合成酶合成酶第7页，此课件共40页哦青霉素合成的调节方式：n1 碳分解代谢产物的影响碳分解代谢产物的影响n2 赖氨酸的反馈调节赖氨酸的反馈调节n3 氮调控氮调控n4 磷酸盐调控磷酸盐调控n5 硫调控硫调控第8页，此课件共40页哦1 碳分解代谢产物的影响碳分解代谢产物的影响l 青霉素的
4、生物合成受碳分解代谢产物阻遏，青霉素的生物合成受碳分解代谢产物阻遏，如如ACV合成酶，合成酶，IPN合成酶，酰基转移酶合成酶，酰基转移酶就就被阻遏。被阻遏。l葡萄糖可以刺激菌体生长，使作为葡萄糖可以刺激菌体生长，使作为Lys和青霉和青霉素合成中间体的素合成中间体的-氨基己二酸氨基己二酸转向合成转向合成Lys，抑制青霉素的合成。抑制青霉素的合成。第9页，此课件共40页哦-酮戊二酸酮戊二酸+乙酰乙酰CoA高柠檬酸高柠檬酸顺顺-高乌头酸高乌头酸高异柠檬酸高异柠檬酸-氨基己二酸氨基己二酸-腺苷腺苷-AAA赖氨酸赖氨酸L-AAA-L-半胱氨酸半胱氨酸异青霉素异青霉素N青霉素青霉素G产黄青霉赖氨酸和青霉素
5、的生物合成途径产黄青霉赖氨酸和青霉素的生物合成途径高柠檬酸高柠檬酸合成酶合成酶第10页，此课件共40页哦n葡萄糖降低青霉素生物合成的速率和得率还由葡萄糖降低青霉素生物合成的速率和得率还由于葡萄糖与于葡萄糖与6-APA之间形成复合物，从而减少之间形成复合物，从而减少了可用于合成青霉素的中间产物。了可用于合成青霉素的中间产物。n葡萄糖有利于菌的生长，但抑制青霉素的合成，葡萄糖有利于菌的生长，但抑制青霉素的合成，而乳糖虽被缓慢利用，却是产生青霉素的最好而乳糖虽被缓慢利用，却是产生青霉素的最好碳源。碳源。n碳源的缓慢利用是大量合成青霉素的关键。碳源的缓慢利用是大量合成青霉素的关键。第11页，此课件共4
6、0页哦2 赖氨酸的反馈调节赖氨酸的反馈调节n-氨基己二酸的初级代谢产物是赖氨酸，分枝次级代谢产物是青霉素。n赖氨酸能抑制青霉素的合成，-氨基己二酸能逆转这种抑制。n赖氨酸能反馈抑制高柠檬酸合成酶，导致-氨基己二酸合成受阻，因而减少青霉素的合成。第12页，此课件共40页哦-酮戊二酸酮戊二酸+乙酰乙酰CoA高柠檬酸高柠檬酸顺顺-高乌头酸高乌头酸高异柠檬酸高异柠檬酸-氨基己二酸氨基己二酸-腺苷腺苷-AAA赖氨酸赖氨酸L-AAA-L-半胱氨酸半胱氨酸异青霉素异青霉素N青霉素青霉素G产黄青霉赖氨酸和青霉素的生物合成途径产黄青霉赖氨酸和青霉素的生物合成途径高柠檬酸高柠檬酸合成酶合成酶第13页，此课件共40
7、页哦3 氮调控n产黄青霉生物合成青霉素能高浓度的铵离子抑制，这种抑产黄青霉生物合成青霉素能高浓度的铵离子抑制，这种抑制与谷胺酰胺合成酶有关：制与谷胺酰胺合成酶有关：NH4+，谷氨酸浓度，谷氨酸浓度，青霉素，青霉素。nNH4+还能直接阻遏产黄青霉的青霉素合成基因的表达。还能直接阻遏产黄青霉的青霉素合成基因的表达。如：乳糖培养的产黄青霉菌加入如：乳糖培养的产黄青霉菌加入40mmol/L NH4Cl，ACV合成酶和合成酶和IPN合成酶的基因受到阻遏，这种阻遏通过氮调控蛋白介导，它能结合成酶的基因受到阻遏，这种阻遏通过氮调控蛋白介导，它能结合到启动子区影响其表达。合到启动子区影响其表达。第14页，此课
8、件共40页哦4 磷酸盐调控 磷酸盐可强化产黄青霉的葡萄糖阻遏，其本身对青霉素的合成没有明显影响。第15页，此课件共40页哦5.硫调控n硫酸盐作为前体氨基酸半胱氨酸合成酶原料，在青霉素硫酸盐作为前体氨基酸半胱氨酸合成酶原料，在青霉素合成中起着重要作用。合成中起着重要作用。n高浓度的硫酸盐阻遏低产产黄青霉菌株的硫酸盐通透高浓度的硫酸盐阻遏低产产黄青霉菌株的硫酸盐通透酶而影响摄取，在硫酸盐饥饿时，该酶活性及硫酸盐酶而影响摄取，在硫酸盐饥饿时，该酶活性及硫酸盐摄取率上升。摄取率上升。n高产产黄青霉菌株呈现高产产黄青霉菌株呈现脱阻遏现象脱阻遏现象，即使在较高的硫，即使在较高的硫酸盐浓度下仍具有较高的通透
9、酶活性。酸盐浓度下仍具有较高的通透酶活性。第16页，此课件共40页哦二二 选育青霉素生产菌选育青霉素生产菌n1 出发菌株的选择出发菌株的选择n2 切断支路代谢切断支路代谢n3 解除菌体自身的反馈调节解除菌体自身的反馈调节n4 增加前体物的合成增加前体物的合成n5 选育形态突变株选育形态突变株n6 其他标记其他标记第17页，此课件共40页哦1 出发菌株的选择出发菌株的选择产生菌：点青霉菌（表面培养只有几十个单位产生菌：点青霉菌（表面培养只有几十个单位）和）和产黄产黄青霉菌青霉菌（适合深层培养（适合深层培养），以产黄青霉菌经过），以产黄青霉菌经过X射线，射线，紫外诱变筛选到紫外诱变筛选到 51-2
10、0号菌常用。号菌常用。形成形成绿色绿色孢子和孢子和黄色黄色孢子的两种产黄青霉菌孢子的两种产黄青霉菌 深层培养中菌丝形态为球状和丝状两种深层培养中菌丝形态为球状和丝状两种，我国生产上大，我国生产上大多数生产厂都采用多数生产厂都采用绿孢子丝状菌绿孢子丝状菌。第18页，此课件共40页哦n菌落：平坦或皱褶，圆形，边沿整齐或锯齿菌落：平坦或皱褶，圆形，边沿整齐或锯齿或扇形。气生菌丝形成大小梗，上生分生孢或扇形。气生菌丝形成大小梗，上生分生孢子，排列程链状，似毛笔，称为青霉穗。孢子，排列程链状，似毛笔，称为青霉穗。孢子黄绿至棕灰色，圆形或圆柱形。子黄绿至棕灰色，圆形或圆柱形。第19页，此课件共40页哦2
11、切断支路代谢切断支路代谢n（1）初级代谢与次级代谢处于分枝途径时，初级代初级代谢与次级代谢处于分枝途径时，初级代谢产物的营养缺陷型可使次级代谢产物的产量增加。谢产物的营养缺陷型可使次级代谢产物的产量增加。如：亮氨酸营养缺陷型，使产量提高如：亮氨酸营养缺陷型，使产量提高4倍。倍。第20页，此课件共40页哦第21页，此课件共40页哦（2）选育）选育赖氨酸营养缺陷型赖氨酸营养缺陷型，解除对高柠檬酸，解除对高柠檬酸合成酶的阻遏和抑制。合成酶的阻遏和抑制。n 研究发现产黄青霉研究发现产黄青霉Lys的营养缺陷型的营养缺陷型1/4不产青霉素，这是因为合不产青霉素，这是因为合成成Lys途径中断发生在途径中断发
12、生在-氨基己二酸之前，所以不能仅从此育氨基己二酸之前，所以不能仅从此育种。种。n 对对Lys的营养缺陷型其的营养缺陷型其Lys的补给可以只须支撑微生物生长，或的补给可以只须支撑微生物生长，或者使用过量者使用过量Lys阻遏氨基己二酸之后的第一个酶，从而积累阻遏氨基己二酸之后的第一个酶，从而积累-氨基氨基己二酸库。这是因为己二酸库。这是因为高产工业菌常常不受高产工业菌常常不受Lys的严格控制，的严格控制，Lys结构结构类似物抗性的突变株青霉素产量常常较低类似物抗性的突变株青霉素产量常常较低。第22页，此课件共40页哦-酮戊二酸酮戊二酸+乙酰乙酰CoA高柠檬酸高柠檬酸顺顺-高乌头酸高乌头酸高异柠檬酸
13、高异柠檬酸-氨基己二酸氨基己二酸-腺苷腺苷-AAA赖氨酸赖氨酸L-AAA-L-半胱氨酸半胱氨酸异青霉素异青霉素N青霉素青霉素G产黄青霉赖氨酸和青霉素的生物合成途径产黄青霉赖氨酸和青霉素的生物合成途径高柠檬酸高柠檬酸合成酶合成酶第23页，此课件共40页哦3 解除菌体自身的反馈调节（1）选育结构类似物抗性突变株）选育结构类似物抗性突变株 三氟亮氨酸，三氟亮氨酸，AEC，D，L-正缬氨酸，正缬氨酸，L-烯丙基甘氨酸等抗性突烯丙基甘氨酸等抗性突变株均可使青霉素的产量增加变株均可使青霉素的产量增加（2）筛选自身耐受性突变株）筛选自身耐受性突变株 高产菌株能耐受高浓度的自产抗生素。有人筛选的能耐受高产菌株
14、能耐受高浓度的自产抗生素。有人筛选的能耐受10万万u/ml的青霉素的青霉素V菌株可产菌株可产4万万u/ml的青霉素的青霉素V，其原因可能是由于，其原因可能是由于反馈抑制被解除，使青霉素合成酶的活力大为提高。反馈抑制被解除，使青霉素合成酶的活力大为提高。第24页，此课件共40页哦n（3）筛选前体或前体类似物抗性突变株）筛选前体或前体类似物抗性突变株n毒性前体或其类似物对某些微生物的生长产生抑制作用，且毒性前体或其类似物对某些微生物的生长产生抑制作用，且可抑制代谢终产物的生物合成。可抑制代谢终产物的生物合成。n以苯氧基乙酸为青霉素发酵的前体，选用耐以苯氧基乙酸为青霉素发酵的前体，选用耐1.3苯氧基
15、乙苯氧基乙酸的突变株，青霉素的发酵单位可达酸的突变株，青霉素的发酵单位可达5万万u/ml。n此外选育此外选育苯乙酸，苯乙酰胺抗性苯乙酸，苯乙酰胺抗性突变株也可明显提高青霉突变株也可明显提高青霉素的产量。素的产量。第25页，此课件共40页哦n（4）选育营养缺陷型的回复突变株。）选育营养缺陷型的回复突变株。n 采用原养型菌株诱变成营养缺陷型菌株，再诱变成原养采用原养型菌株诱变成营养缺陷型菌株，再诱变成原养型菌株的途径，获得了比亲株单位高型菌株的途径，获得了比亲株单位高2倍的青霉素高产菌。倍的青霉素高产菌。n当一种初级代谢产物是次级代谢产物的前体时，这种初级代谢当一种初级代谢产物是次级代谢产物的前体
16、时，这种初级代谢产物营养缺陷型的回复突变株是获得高产菌株的有效方法。产物营养缺陷型的回复突变株是获得高产菌株的有效方法。n-氨基己二酸缺陷的回复突变株青霉素产量提高氨基己二酸缺陷的回复突变株青霉素产量提高2.4倍。倍。n此外，半胱氨酸、异亮氨酸或苏氨酸缺陷的回复突变株均此外，半胱氨酸、异亮氨酸或苏氨酸缺陷的回复突变株均可使青霉素的产量大幅提高。可使青霉素的产量大幅提高。第26页，此课件共40页哦4.增加前体物的合成增加前体物的合成n增加缬氨酸：丙酮酸丙酮酸 选育选育Val对乙酰羟酸合成酶抑制程度低的菌株对乙酰羟酸合成酶抑制程度低的菌株n增加增加-氨基己二酸氨基己二酸：采用基因工程技术克隆采用基
17、因工程技术克隆同型柠檬酸合成酶同型柠檬酸合成酶基因，使之在菌体基因，使之在菌体内大量表达；进一步再通过体外诱变使发生基因突变，表达出同内大量表达；进一步再通过体外诱变使发生基因突变，表达出同型柠檬酸合成酶不再受型柠檬酸合成酶不再受Lys反馈抑制的酶，增加反馈抑制的酶，增加-氨基己二氨基己二酸的量。酸的量。乙酰羟酸合成酶乙酰羟酸合成酶Val乙酰乳酸乙酰乳酸第27页，此课件共40页哦5 选育形态突变株长期选育过程中发现，随着青霉素产量的增加，产生菌落长期选育过程中发现，随着青霉素产量的增加，产生菌落直径变小，表面结构由平坦变为褶皱，孢子逐渐减少的现直径变小，表面结构由平坦变为褶皱，孢子逐渐减少的现
18、象，可以此寻找高产菌。象，可以此寻找高产菌。深层培养中菌丝形态的突变有利于通气时，可提高产量。深层培养中菌丝形态的突变有利于通气时，可提高产量。第28页，此课件共40页哦6.其他标记n（1）筛选抗生长抑制剂突变株。n 筛选抗重金属离子（筛选抗重金属离子（Cu2+，Co2+，Fe3+，Hg2+）的突变株。）的突变株。n原因：重金属离子本身具有毒性，与青霉素结合原因：重金属离子本身具有毒性，与青霉素结合后能消除毒性、产生抗性菌株。后能消除毒性、产生抗性菌株。第29页，此课件共40页哦（2）筛选耐消泡剂的突变株 选育耐合成消泡剂的突变株，减少植物油的消耗（3）选育细胞膜渗透性好的突变株 产黄青霉菌如
19、果膜渗透性发生改变，使其摄取无机硫酸盐的能力提高，由于硫参与半胱氨酸的合成，这样青霉素的产量也会提高。第30页，此课件共40页哦（4）构建基因工程菌株 将青霉素G酰化酶基因进行克隆，强化青霉素生物合成能力，构建出的青霉素生产菌株产量提高3.3倍。第31页，此课件共40页哦三 发酵控制n1 碳源n2 pHn3 温度n4 补料n5 铁离子的影响第32页，此课件共40页哦1 碳源n青霉素能利用多种碳源，如青霉素能利用多种碳源，如乳糖，蔗糖，葡萄糖，阿乳糖，蔗糖，葡萄糖，阿拉伯糖，甘露糖，淀粉和天然油脂拉伯糖，甘露糖，淀粉和天然油脂等。等。n乳糖是最好的碳源，葡萄糖也较好，但需控制其加入乳糖是最好的碳
20、源，葡萄糖也较好，但需控制其加入的浓度，因为高浓度的葡萄糖对一些酶具有阻遏作用。的浓度，因为高浓度的葡萄糖对一些酶具有阻遏作用。n常采用连续添加葡萄糖的方法代替乳糖常采用连续添加葡萄糖的方法代替乳糖。第33页，此课件共40页哦n苯乙酸或其衍生物苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘氨酸苯乙酸或其衍生物苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘氨酸均可作为青霉素均可作为青霉素G的侧链前体。的侧链前体。n菌体对前体的利用有两个菌体对前体的利用有两个途径途径：直接结合到产物分子中，直接结合到产物分子中，或作为养料利用或作为养料利用。究竟采取哪个途径，主要取决于培养。究竟采取哪个途径，主要取决于培养条件以及所用菌种的特性。如早期
21、的条件以及所用菌种的特性。如早期的Q-176菌株菌株7194的前体被氧化，只有的前体被氧化，只有210转化为青霉素；现代的菌转化为青霉素；现代的菌株，前体转化率为株，前体转化率为4696。n为了避免前体加入浓度过大而对菌体有毒害，除基础料中为了避免前体加入浓度过大而对菌体有毒害，除基础料中加入加入0.07的前体外，其余按需要同氮源一同补入。的前体外，其余按需要同氮源一同补入。n保持供应速率略大于生物合成需要保持供应速率略大于生物合成需要。第34页，此课件共40页哦2 pH控制合成适宜合成适宜pH6.2-6.8左右，避免超过左右，避免超过7.0。pH下降：补加下降：补加CaCO3、通氨、尿素或提
22、高通气量、通氨、尿素或提高通气量pH上升：补加糖、生理酸性物质（硫酸铵、油脂）上升：补加糖、生理酸性物质（硫酸铵、油脂）直接加酸或碱直接加酸或碱 优点优点：自动控制；缺点：满足不了菌的代谢和合成抗生素的：自动控制；缺点：满足不了菌的代谢和合成抗生素的 需需要，可致菌的代谢朝不利于抗生素合成的方向发展）要，可致菌的代谢朝不利于抗生素合成的方向发展）流加葡萄糖：流加葡萄糖：恒速；变速，依赖恒速；变速，依赖pH变化快慢。可满足菌不同生长阶段对葡萄糖变化快慢。可满足菌不同生长阶段对葡萄糖的需求，对青霉素合成更有利。的需求，对青霉素合成更有利。第35页，此课件共40页哦3 温 度 控 制适宜菌丝生长温度
23、30,分泌青霉素20。20青霉素破坏少，周期很长。变温控制：不同阶段不同温度。生长阶段：较高温度，缩短生长时间；生长阶段适当降低温度，以利于青霉素的合成。前期控制26左右，后期降温控制24。第36页，此课件共40页哦4 补料 4.1 补加无机氮源：硫酸铵、氨水、尿素 氨基氮浓度：0.01-0.05。基础料中加入0.05尿素，并在补糖时再两次补加尿素，可以扭转发酵液浓度转稀，pH降低和青霉素单位增长缓慢的情况，提高发酵单位。第37页，此课件共40页哦n4.2 提高产量的其他物质n表面活性剂：新洁尔灭、聚氧乙烯、山梨糖醇酐、单油酸酯、单月桂酸酯、三油酸酯n可溶性高分子化合物：聚乙烯醇、聚丙烯酸钠、聚乙二胺、聚乙烯吡咯烷醇 其他：剪切保护剂；分散剂第38页，此课件共40页哦5 铁离子的影响nFe3+对青霉素生物合成有显著影响，若对青霉素生物合成有显著影响，若Fe3+的含量超的含量超过过3040ug/ml，则发酵单位增加缓慢，因此铁罐使，则发酵单位增加缓慢，因此铁罐使用前必须进行处理，可在罐壁上涂上环氧树脂等保护用前必须进行处理，可在罐壁上涂上环氧树脂等保护层，使铁离子的含量控制在层，使铁离子的含量控制在30ug/ml.第39页，此课件共40页哦感感谢谢大大家家观观看看第40页，此课件共40页哦