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1、关于基因芯片的制作方法(2)第一页，讲稿共四十页哦3.1 概述概述 1.基因芯片是以Southern印迹杂交技术为基础发展起来的。反向杂交技术第二页，讲稿共四十页哦2.基因芯片的制作方法：原位合成法：Affymetrix公司 直接点样法（合成后点样）：Stanford大学，1995年第三页，讲稿共四十页哦项目项目原位合成法原位合成法直接点样法直接点样法探针预备探针预备不需要不需要需要需要探针类型探针类型寡核苷酸寡核苷酸寡核苷酸，寡核苷酸，cDNA，基因组，基因组DNA，蛋白等，蛋白等探针长度探针长度约约25nt不限制不限制联合合成联合合成需要需要不需要不需要芯片表面点样芯片表面点样不需要不需要
2、需要需要密度密度高高低低制作成本制作成本高高低低应用应用基因表达，突变检测基因表达，突变检测 基因表达，突变检测，基因表达，突变检测，CGH第四页，讲稿共四十页哦1.常见的载体类型 膜 玻片 三维基质包被玻片3.2 芯片载体的制作芯片载体的制作第五页，讲稿共四十页哦（1）膜 优点：与核酸亲和力强。缺点：单位面积上点样密度低；背景较高；灵敏度低。第六页，讲稿共四十页哦（2）玻片 优点：耐受高温和高离子强度；具有不浸润性，提高点样密度；背景低。缺点：二维的平面结构，与DNA杂交时会有空间位阻。第七页，讲稿共四十页哦（3）三维基质包被玻片 具有三维孔性结构，更适合做蛋白质芯片的支持物，可以保持蛋白质
3、的空间构象，不影响它的活性。第八页，讲稿共四十页哦2.玻片的修饰类型l氨基修饰玻片l同型双功能偶联剂修饰的玻片l硫醇基修饰的玻片l环氧硅烷化修饰的玻片等第九页，讲稿共四十页哦图图3-3 APS修饰玻璃表面反应示意修饰玻璃表面反应示意（1）氨基修饰的玻片羟基羟基氨基氨基第十页，讲稿共四十页哦对苯乙异硫氰酸（2）同型双功能偶联剂包被修饰的玻片异硫氰基异硫氰基第十一页，讲稿共四十页哦醛基醛基戊二醛第十二页，讲稿共四十页哦连接分子连接分子手臂分子手臂分子特异性探针特异性探针第十三页，讲稿共四十页哦图图3-7 SMPB连接硫醇基核苷酸和氨基玻片连接硫醇基核苷酸和氨基玻片（3）连接硫醇基修饰的玻片硫醇基硫
4、醇基第十四页，讲稿共四十页哦图图3-8 环氧硅烷化玻片修饰示意环氧硅烷化玻片修饰示意（4）环氧硅烷化修饰的玻片环氧硅烷基环氧硅烷基第十五页，讲稿共四十页哦1.cDNA探针2.寡核苷酸探针3.基因组DNA探针（很少用）4.RNA探针3.3 探针的制备探针的制备第十六页，讲稿共四十页哦cDNA探针：主要来自cDNA文库，从细胞或组织中提取RNA后逆转。第十七页，讲稿共四十页哦寡核苷酸探针：根据数据库中的基因序列人工合成的。通常在5末端进行氨基修饰，并加入一段不直接参与杂交的重复序列，称为手臂分子，通常用poly dT(10)。手臂分子手臂分子特异性探针特异性探针第十八页，讲稿共四十页哦探针分子与基
5、片表面的作用方式 化学偶联：探针分子与基片表面活性基团发生化学反应，生成新的共价键。物理吸附：探针分子与基片表面通过次级键相连接。第十九页，讲稿共四十页哦3.4 点样仪及点样过程点样仪及点样过程l接触式点样l非接触式点样第二十页，讲稿共四十页哦1.接触式点样 点样针。基本过程：点样针接触探针溶液，通过浸润现象或毛细现象，使液体转移到针尖或针的狭缝中。针尖再接触基片，样品在基片上留下斑点，完成一次点样。第二十一页，讲稿共四十页哦点样针的种类：实心针（solid pin）裂隙针（split pin）毛细管针（capillary tube）针与环（pin and ring）第二十二页，讲稿共四十页哦
6、bestbest第二十三页，讲稿共四十页哦第二十四页，讲稿共四十页哦2.非接触式点样（自学）（1）微螺线阀 （2）压电元件第二十五页，讲稿共四十页哦接触式接触式非接触式非接触式 压电元件压电元件微螺线阀微螺线阀1 1 图图3-10当前当前59家芯片设备生产商使用的点样针分布情况家芯片设备生产商使用的点样针分布情况（图中的数字代表使用各点样针的厂家数目）（图中的数字代表使用各点样针的厂家数目）第二十六页，讲稿共四十页哦3.5 原位合成法第二十七页，讲稿共四十页哦操作平台第二十八页，讲稿共四十页哦Affymetrix芯片的特点：光导原位合成的寡核苷酸芯片 高密度的点阵技术 独特的PM-MM探针设计
7、 第二十九页，讲稿共四十页哦1.光导原位合成原理第三十页，讲稿共四十页哦2.高密度的点阵技术1平方厘米的面积至少可排列上百万个探针合成区（“点”)第三十一页，讲稿共四十页哦3.Affymetrix独特的PM-MM探针设计第三十二页，讲稿共四十页哦图图3-11 PM-MM探针设计方案探针设计方案第三十三页，讲稿共四十页哦第三十四页，讲稿共四十页哦高灵敏度图图3-12 仅仅用用PM探探针针与与联联合合应应用用PM-MM探探针检测针检测靶序列的灵敏度比靶序列的灵敏度比较较第三十五页，讲稿共四十页哦芯片结果准确可靠图图3-13 PM-MM的多个探针的结果与单个探针的结果比较的多个探针的结果与单个探针的结果比较第三十六页，讲稿共四十页哦第三十七页，讲稿共四十页哦第三十八页，讲稿共四十页哦第三十九页，讲稿共四十页哦感谢大家观看第四十页，讲稿共四十页哦